CC BY
33могут быть антителосодержащие препараты, реагирующие со сконструированными диагностикумами в титре не менее 1/5120 — 1/10240. В данном исследовании — это лошадиные сыворотки О1 при контроле диагностикума V. cholerae 1395, кроличья коммерческая сыворотка О139 при контроле диагностикума V cholerae О139 16064 и МКА О139.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов, 1981.
2. Ефременко В.И., Савельев В.Н. Лабораторная диагностика холеры: состояние и перспективы. В: Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. 2003, с.57-62;
3. Королев Ю.С., Иванова С.М., Кюрегян А.А. и др. О значении систем серологических реакций при обследовании людей на холеру. В: Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. 2003, с.97-98.
4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М., 2009.
5. Леви М.И., Басова Н.Н. Эритроцитарные диагностикумы и их применение в серологии. Проблемы ООИ. 1970, 2: 207-213.
6. Мазрухо Б.Л., Поляков И.И. Получение и использование холерного антигенного эри-троцитарного диагностикума. Журн. микробиол. 1976, 1: 26-30.
7. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Королев Ю.С., и др. Серологическая диагностика холеры. В: Холера и патогенные для человека вибрионы. 2005, 18: 131-133.
8. Савельева И.В. Экспериментальная разработка липосомального энтеротоксического диагностикума для серологической диагностики холеры. Автореф. дис.канд.мед.наук. Ставрополь, 2002.
9. Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М., Агафонова В.В. и др. Конструирование антилипазно-го иммуноглобулинового полимерного диагностикума для выявления штаммов холерных вибрионов эльтор, обладающих гемолитической и липазной активностью. Журн. микробиол. 2006, 1: 57-60.
10. Цыбин Б.П. Применение реакции пассивной гемагглютинации в изучении антитоксического и антибактериального иммунитета у вибриононосителей. Проблемы ООИ. 1975, 1 (41): 117-121.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Телесманич Наталья Робертовна, д.б.н., 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (8632)240-35-94
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Л.П.Блинкова, Ю.Д.Пахомов, О.В.Дмитриева
ОБНАРУЖЕНИЕ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ЛИОФИЛИЗИРО-ВАННЫХ ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКОВ
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Обнаружение среди лиофильно высушенных клеток промышленных пробиоти-ков жизнеспособных, но некультивируемых форм. Материалы и методы. Объектами исследования являлись серии 9 пробиотических препаратов (колибактерин, бификол, би-фидумбактерин, бифиформ) с истекшим (до 30 лет хранения) или действующим сроком годности. Общее количество бактерий рассчитывали под микроскопом в камере Горяева, число жизнеспособных клеток определяли в люминесцентном микроскопе после окрашивания набором флуоресцентных красителей, количество КОЕ/мл оценивали методом посева на соответствующие плотные или полужидкие питательные среды. Результаты. Сопоставление величин указанных показателей позволило установить, что в лиофили-зированных препаратах колибактерина с истекшим сроком хранения количество живых,
но не формирующих колонии клеток (некультивируемые формы) колебалось от 4,13 до 99,73%, в зависимости от срока изготовления. Для бифидобактерий с неистекшим сроком годности живые клетки составляли 95,45 и 70,73%. Количество жизнеспособных бифидобактерий, формирующих колонии, было на уровне 100 и 50% соответственно. У бифи-допрепаратов отмечены микроколонии, которые, вероятно, образованы спонтанно пробудившимися некультивируемыми формами. Показана возможность стимуляции роста таких клеток с помощью 1 и 10% аминопептида. Заключение. Экспериментально доказано наличие некультивируемых форм в лиофилизированных препаратах пробиотиков.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 83-88
Ключевые слова: лиофилизированные клетки, некультивируемые формы, колибактерин, бификол, бифидумбактерин, бифиформ
L.P.Blinkova, Yu.D.Pakhomov, O.V.Dmitrieva
DETECTION OF UNCULTIVABLE BACTERIA FORMS IN PROBIOTIC LYOPHILIZED PREPARATIONS
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Detection of viable but uncultivable forms among lyophilized cells of commercial pro-biotics. Materials and methods. 9 series of probiotic preparations (colibacterin, bificol, bifidum-bacterin, bifiform) with expired (up to 30 years of storage) or valid shelf life were objects of the study. Total quantity of the bacteria was calculated under the microscope in Goryaev chamber, the number of viable cells was determined in luminescence microscope after staining by an array of fluorescent dyes, the quantity of CFU/ml was evaluated by method of seeding into the respective solid or semi-liquid cultivation medium. Results. Juxtaposition of the specified parameter values allowed to establish that in lyophilized preparations of colibacterin with expired shelf life the amount of viable but not forming colonies (uncultivable forms) cells varied from 4.13 to 99.73% depending on date of production. For bifidumbacterin with unexpired shelf life live cells constituted 95.45 and 70.73%. The amount of viable bifidobacteria forming colonies was on the level of 100 and 50%, respectively. In bifidopreparations micro colonies that may possibly be formed spontaneously by awakened uncultivable forms were noted. A possibility of growth stimulation of these cells by 1 and 10% aminopeptide was shown. Conclusion. The presence ofuncultivable forms in lyophilized preparations of probiotics was proven experimentally.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 83-88
Key words: lyophilized cells, uncultivable forms, colibacterin, bificol, bifidumbacterin, bifiform
Известно, что в неблагоприятных условиях естественной или искусственной среды обитания (исчерпание источников питания и энергии, неоптимальный уровень температурного воздействия, оксигенизации, влияние химических веществ, токсинов органической природы и т.д.) неспорообразующие микроорганизмы подвергаются стрессу, результатом которого является образование клетками некультивируемых (покоящихся) форм [1 — 9]. При этом, выходя из пролиферативного цикла, клетки сохраняют потенциальную возможность вернуться к активному росту и размножению. За таким состоянием обратимой потери культивируемости закрепился термин «жизнеспособное, но некультивируемое» (viable but non culturable — VBNC) [11, 12]. Выявление микроорганизмов, находящихся в некультивируемом состоянии в окружающей среде, организме человека и животных, в пищевых продуктах и др. является важным направлением микробиологических исследований.
Покоящееся состояние разделяют по степени его глубины. Так, при некоторых стрессовых воздействиях [1] метаболизм тормозится, но его можно выявить, или он
полностью прекращается. Например, в стационарной фазе, в условиях пролифера-тивного покоя, клетка сохраняет метаболическую активность [1, 2, 5]. При другом виде покоя происходит постепенное торможение обменных процессов [2, 4, 11]. При аметаболизме (анабиоз, криптобиоз, абиоз) [1] обменные процессы в клетке прекращаются, однако метаболизм при благоприятных условиях может быть восстановлен.
В зависимости от факторов, индуцирующих переход в состояние покоя, его классифицируют как эндогенный и экзогенный вид покоя [1]. Эндогенный покой является частью естественного цикла и обусловлен внутренними механизмами клетки как ответ на стрессовое воздействие факторов среды обитания и является частью естественного цикла развития. К покоящимся клеткам такого типа принадлежат эндо- и экзоспоры бактерий, грибов, конидий и др. (Sussan A.S., Halvorson H.O., 1966).
Экзогенный покой связан с воздействием внешних факторов, таких как консервирование в растворах осмотически активных веществ (осмобиоз) солей, сахарозы и др., замораживание (криобиоз), обезвоживание (ангидробиоз). По нашему мнению, к этому типу покоя следует отнести лиофильное высушивание, сочетающее криобиоз и ангидробиоз, воздействие низкой и высокой температуры [8].
Покоящиеся некультивируемые клетки обладают повышенной устойчивостью к действию поражающих факторов. Такие клетки не теряют генетических особенностей микроорганизмов, обеспечивая сохранение вида при длительных стрессах. Однако при реверсии покоящихся форм к метаболической активности реализуется только тот клеточный вариант (серотип, клон и т.д.), который оказался наиболее адаптирован к изменившимся условиям пребывания. Сохранение свойства жизнеспособности и возможность возврата к состоянию активного деления может исчисляться миллионами лет [2]. Однако существует предположение, что образование некультивируемых форм и потеря способности формировать колонии — это этап отмирания культуры [10]. Следует отметить, что клетки, не способные образовать колонии на стандартных питательных средах, часто обнаруживают при микрокопировании структурную не-поврежденность.
Поскольку известно, что колонии микроорганизмов могут формироваться более, чем одной клеткой, биологическая активность препаратов, связанная с живыми бактериями (пробиотики, вакцины, БАД) по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) оказывается заниженной. Поэтому вопрос изучения потенциала жизнеспособности лиофилизированных клеток в длительно хранящихся препаратах не через КОЕ, а непосредственно через подсчет живых клеток, является актуальным.
Цель настоящего исследования — обнаружить среди лиофильно высушенных клеток промышленных пробиотиков жизнеспособные, но некультивируемые формы микроорганизмов.
Объектами исследования являлись разлитые во флаконы и ампулы препараты пробиотиков (колибактерин, бификол, бифидумбактерин, бифиформ) производства ОАО «Биомед им. И.И. Мечникова (Московская обл.); «ИМБИО» (Нижний Новгород); НПО «Микроген» (Ставрополь); «Ферросан А/С» (Дания, Себорг) с истекшим и действующим сроком годности, которые хранили в холодильнике в соответствии с инструкцией по применению.
Общее количество бактериальных клеток подсчитывали в камере Горяева под микроскопом «Микмед-5» фирмы «Ломо» с увеличением 320 (8x40). Визуальную оценку количества окрашенных с помощью коммерческого набора биолюминесцентного красителя Live/Dead (Baclight™) живых и мертвых клеток пробиотиков осуществляли под люминесцентным микроскопом фирмы «Opton» (Германия). Живые микроорганизмы с интактной мембраной имели ярко зеленую окраску, а мертвые с поврежденной цитоплазматической мембраной окрашивались в красный цвет из-за связывания с ДНК проникающего в клетку пропидия иодида.
Определение величины КОЕ/мл для клеток пробиотических препаратов выполняли общепринятым методом высева десятикратно разведенной суспензии пробио-тиков на плотный питательный агар и среду Эндо (Escherichia coli, E. faecium) и в полужидкую бифидум-среду для культивирования и выделения бифидобактерий (ГНЦ ПМБ, Оболенск). Некультивируемые, но жизнеспоспособные формы бактерий выявляли при сопоставлении показателей на 1 мл: общего количества клеток, числа живых, а также не образующих колонии бактерий.
Первоначальный этап наших исследований состоял в определении уровня жизнеспособности лиофилизированных бактерий в коммерческих пробиотических препаратах. Нами было изучено 5 серий лиофилизированного колибактерина от разных производителей с истекшими сроками годности (от 1982 г. до 2009 г.). В препарате колибактерина, разлитого в ампулы по 3 дозы (производство Пермского НИИВС), с превышением срока хранения почти на 30 лет не формировали колонии 99,73% живых клеток (1,1±0,12x1010 кл/мл). Как установлено под микроскопом с набором Live/ Dead, это составляло 52,2% от их общей численности (2,11±0,23x1010 кл/мл, т.е. 100%). Результат жизнеспособности этого препарата по величине КОЕ/мл соответствовал 2,89±0,32x107 кл/мл.
Колибактерин, также разлитый в ампулы по 3 мл (производства Нижегородского предприятия «ИМБИО») с превышением срока годности на 11 лет имел 79,5% клеток, не способных формировать колонии при общей (100%) численности (3,11±0,34x1010 кл/мл) и 86,7% (2,7±0,3x1010 кл/мл) жизнеспособных клеток. По величине КОЕ/мл этот показатель равнялся 5,55±0,61x109 кл/мл.
Интересен факт более высокого числа живых бактерий E. coli, не способных образовать колонии (85,5%) в препарате «Биомеда им. И.И.Мечникова» с более поздним сроком изготовления (превышение срока годности на 4 года). Следует при этом отметить, что розлив осуществлен во флаконы по 5 доз. Процент живых клеток, выявленных с помощью набора Live/Dead, составлял 90,3%.
Колибактерин двух серий (240-3 и 270-3), изготовленный в ОАО «Биомед им. И.И.Мечникова», с превышением срока годности на 3 года имел количество жизнеспособных биолюминесцирующих клеток 88,2% и 91,3%, соответственно.
Показатель неспособности формировать колонии при этом составлял для каждой серии 21,3% и 4,13%. Необходимо отметить, что в разведениях суспензий клеток E. coli М-17 для препарата с 30-летним превышением срока годности, из колибактерина, с использованием физиологического раствора (голодная среда) после инкубации пробирок при 37°C в течение 72 часов обнаружено существенное увеличение жизнеспособной (по Live/Dead) численности микробов (на 3 порядка), по сравнению с исходным числом КОЕ/мл. Сопоставление результата высева суспензий на питательный агар из разведений, показавших единичное количество КОЕ/мл после исходного ресуспензирования пробиотика, указывает, что такое статистически значимое увеличение концентрации бактерий на 3 порядка для единичных клеток в голодной среде невозможно. По-видимому, происходило восстановление поврежденных при лиофилизации или при хранении клеток (стрессовый фактор), которые потеряли способность к немедленному переходу в состояние роста и размножения. Для комплексных препаратов, содержащих бифидобактерии (от трех производителей), которые хранились на 2 года и 5 лет больше срока годности или без его превышения, наблюдали (по данным люминесцентной микроскопии) высокий уровень сохранения жизнеспособности смеси клеток (от 70,3% для бификола сер. 120-1 во флаконах по 5 доз до 100% для бифи-форма в капсулах).
В препаратах бифидумбактерина, разлитого во флаконы по 5 доз, производства НПО «Микроген» (Ставрополь) без превышения сроков хранения выявлены величины жизнеспособности смеси клеток от 70,7 до 95,45%. Характерной особенностью рекультивирования бифидобактерий некоторых серий (120-1 и 442) в отечественной
среде для их выращивания была задержка появления визуального роста колоний до 72 час (образовались микроскопические колонии, спустя 4 и 7 суток развившиеся в нормальные колонии). В первые сутки инкубации в этих препаратах появлялось не более 0,01% от общего числа сформировавшихся позднее колоний бифидобакте-рий.
Датский препарат бифиформ, хранившийся свыше 1,5 лет после истечения срока годности, по данным люминесцентной микроскопии содержал 100% жизнеспособных клеток смеси обоих микроорганизмов (Bifidobacterium longum и E. faecium), входящих в его состав. Для одной из серий бифидумбактерина (121-1) со сроком годности до 01.2008 г. нами была предпринята попытка повышения высеваемости путем добавления 1% и 10% аминопептида в конечной концентрации. В пробирках с добавками уже на вторые сутки инкубации было отмечено более чем 2-кратное увеличение количества культивируемых клеток по сравнению с контролем (среда без добавления аминопептида). Эти результаты позволяют предположить, что произошел переход некультивируемых форм в вегетативное состояние.
Следовательно, в каждом из изученных препаратов обнаружен определенный процент живых, но не культивируемых бактерий, которые потенциально способны размножаться в благоприятных условиях.
На наш взгляд, экспериментальные данные указывают на присутствие в лиофи-лизированных пробиотических препаратах некультивируемых, но жизнеспособных форм бактерий. В таком состоянии искусственного анабиоза клетки могут подчиняться тем же законам сохранения и восстановления, что и некультивируемые формы в природе.
Полученные данные по некультивируемым формам важны для контроля истинной жизнеспособности клеток в промышленных лиофилизированных препаратах, основой которых являются микробные клетки. Срок годности таких препаратов, по нашему мнению, может быть увеличен из-за присутствия в них жизнеспособных, но не сразу выходящих из анабиоза клеток. Добавление аминопептида в количестве 1 и 10% при выращивании микроскопических колоний бифидобактерий (возможно, развившихся из некультивируемых форм) указывает на один из факторов для возвращения некультивируемых бактерий в вегетативное состояние. Например, попадая в кишечник человека или животных эти неучтенные некультивируемые формы пробиотических микроорганизмов начинают развиваться, обеспечивая пробиотикам длительное эффективное воздействие. Апробированный метод оценки жизнеспособности является также экспресс-методом выявления жизнеспособных клеток по сравнению с методом определения КОЕ/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блинкова Л.П., Пахомов Ю.Д., Стоянова Л.Г. Свойства некультивируемых и покоящихся форм микроорганизмов. Иммунология, аллергология, инфектология, 2010, 3: 67-76.
2. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М., Медицина, 2005.
3. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., Фармарус Принт, 1998.
4. Мулюкин А.Л. Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий. Свойства, разнообразие, диагностика. Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 2010.
5. Пахомов Ю.Д., Блинкова Л.П., Стоянова Л.Г. Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий с поддержанием гомеостаза популяции. Иммунология, аллергология, инфектология. 2010, 4: 57-66.
6. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых форм» у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? Мол. генетика, микробиол., вирусол. 1993, 6: 34-37.
7. Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий: феномен и способы их выявления
в объектах окружающей среды. В: Руководство по медицинской микробиологии. Лабинская А.С., Костюкова Н.Н., Иванова С.М. (ред.). М., 2010, с. 37-46.
8. Blinkova L.P., Pakhomov Yu.D., Nikiforova O.V. et al. Express assessment of cell viability in biological preparation. Pharmaceutical and Medical Biotechnology. Moscow, JSC Expo-biochem-Technology, 2012, p. 391-392.
9. Mukamolova G.V., Yasnopolskaya N.D., Kell D.B., Kaprelyants A.S. On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek, 1998, 73(3): 237-243.
10. Nystrom T. Not-quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death. Arch. Microbiol, 2001, 176: 159-164.
11. Oliver J.D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbial Rev. 2010, 34: 415-425.
12. Oliver J.D. The viable but nonculturable state in the human pathogen, Vibrio vulnificus. FEMS Microbiоl. Lett., 1995, 133: 203-208.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Блинкова Лариса Петровна, д.б.н., проф.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495) 916-11-52
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 С.А.Лисовская, Н.И.Глушко, Е.В.Халдеева
ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА FUSARIUM, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии
Цель. Изучение адгезивной активности и скорости роста у грибов рода Fusarium, выделенных с поверхности кожного покрова у больных атопическим дерматитом (АД). Материалы и методы. В исследовании использовали клинические и музейные штаммы F.oxysporum, F.solani. Посев проводили на агаризованную среду Чапека и Сабуро. Исследовали культуры в течение девяти суток при 30±2°C. Адгезивные свойства грибов определяли с помощью модели на основе нитроцеллюлозной пленки (Лисовская С.А. и др., 2006). Результаты. Проведенные исследования показали статистически достоверные отличия адгезивных свойств и интенсивности прорастания различных видов Fusarium spp. Уровень адгезии микроконидий F.solani был почти в 2,5 раза выше по сравнению с F.oxysporum. Формирование первой ростковой трубки микроконидиями вида F.solani отмечали в первые десять часов, тогда как у F.oxysporum — только на вторые сутки. Заключение. Полученные данные подтверждают видовые различия патогенных свойств Fusarium spp., что подчеркивает значимость видовой идентификации грибов.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 88—92
Ключевые слова: патогенные грибы, патогенность, адгезия, микроконидии
S.A.Lisovskaya, N.I.Glushko, E.V.Khaldeeva
PATHOGENIC PROPERTIES OF FUNGI FUSARIUM GENUS ISOLATED FROM PATIENTS WITH ATOPIC DERMATITIS
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russia
Aim. Study of adhesive activity and growth speed of fungi Fusarium genus isolated from the surface of cutaneous covering in patients with atopic dermatitis (AD). Materials and methods. Clinical and museum F. oxysporum, F. solani strains were used in the study. Seeding was carried out into agarized Czapek and Sabouraud medium. The cultures were studied for 9 days at 30±2°C.
