CC BY
41KEYWORDS: veterinary clinic, pets, morbidity, market for veterinary services.
References
1. Bayazitov, G.S. Ob"em i struktura rynka veterinarnyh uslug v sel'skih rajonah [Size and market structure of veterinary services in rural areas] / G.S.Bayazitov // Tezisy dokladov Vserossijskoj konferencii molodyh uchenyh - proc.: All-Russian conference of young scientists. - Kazan. - 2000. - p. 82-84.
2. Organizaciya raboty seti kommercheskih veterinarnyh klinik v usloviyah megapolisa [Organization of of the commercial network of veterinary clinics in cities] / N.M.Vasilevskij, P.P.Ershov, R.A.Semchenko, A.I.Osadchaya // Veterinariya, zootekhniya i biotekhnologiya. - 2014. - № 7. -P. 6-11.
3. Il'inyh, P.A. Menedzhment i marketing, organizaciya veterinarnogo dela v rynochnyh usloviyah / P.A.Il'inyh [Management and marketing, organization of veterinary business in market conditions]// Agrarnyj vestnik Urala. - 2013.
- № 10 (116). - P. 75-78.
4. Minnebaev, D.F. Marketingovye issledovaniya rynka veterinarnyh tovarov [Marketing research: veterinary products] / D.F.Minnebaev // Proceedings from the International scientific-practical conference on current problems of agribusiness. Part 1. - Kazan, 2003. - P. 216-217.
5. Nekhajchuk, E.V. Otechestvennyj rynok veterinarnyh tovarov i uslug: sovremennye tendencii i perspektivy razvitiya [Domestic market of veterinary products and services: current trends and prospects]/ E.V. Nekhajchuk // Novaya nauka: ot idei k rezul'tatu. - 2017. - Vol. 2. - № 2. - P. 9-12.
6. Nikitin, I.N. Veterinarnoe predprinimatel'stvo [Veterinary entrepreneurship] / I.N. Nikitin - Moscow: Koloss, 2009.
- 336 p.
7. Nikitin, I.N. Rynok veterinarnyh uslug v gorode [The market of veterinary services in cities] / I.N. Nikitin, E.N. Trofimova. - Veterinariya. - 2005. - № 7. - P. 12-13.
8. Pleshakova, E.V. Rynok veterinarnyh uslug v regional'noj infrastrukture agropromyshlennogo kompleksa Omskoj oblasti [The market of veterinary services in regional infrastructure of agroindustrialcomplex of the Omsk region] / E.V.Pleshakova. - Bulletin of Altai state agrarian University. - 2012. - № 6 (92). - P. 116-120.
9. Trofimova, E.N. Rynok veterinarnyh uslug v gorode i rascenki v chastnyh veterinarnyh klinikah [Veterinary service market in the city and private veterinary clinics prices] / E.N.Trofimova. - Veterinariya. - 2010. - №. 6. - P.6-8.
УДК 619:579.843.96.
ВЛИЯНИЕ СРЕД ВЫСУШИВАНИЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ САПА В ПРОЦЕССЕ ЛИОФИЛИЗАЦИИ И ДАЛЬНЕЙШЕМ ХРАНЕНИИ
1Л.А.Мельникова - кандидат ветеринарных наук, вед. научный сотрудник; 1С.В.Иванова - кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник;1.Х.Н.Макаев - доктор ветеринарных наук, профессор;
2Н.К.Букова - доктор биологических наук, профессор.
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел.+7(843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru). 2ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Россельхознадзора, г.Москва (г.Москва Звенигородское шоссе, 5, e-mail: bukova@
vgnki.ru).
Правильное длительное хранение коллекционных и производственных штаммов различных видов микроорганизмов с сохранением ими биологических свойств - основная цель коллекционной деятельности. Известно несколько основных способов длительного хранения культур микроорганизмов: лиофилизация, криоконсер-вирование и периодичные пересевы на питательные среды. Нами экспериментально подтверждена возможность длительного хранения штаммов возбудителя сапа в лиофилизированном состоянии с использованием защитных сред (стабилизаторов) - обезжиренного молока и сахарозо-желатиновой. В результате эксперимента отработан порядок подготовки штаммов, рассчитан и предопределен режим, установлен часовой диапазон лиофилизации и конечная относительная влажность в пределах 2-3,5%. С целью определения процента жизнеспособных клеток, лиофилизированную культуру суспендировали и засевали на МПГА. Установлена 60-74%-ная сохранность жизнеспособных клеток. Затем ежегодно, в течение 5 лет (срок наблюдения), контролировали процент сохранности жизнеспособных клеток в лиофилизированной массе. Установлено, что при хранении в высушенном состоянии происходило снижение выживших клеток от 0,0001 до 9% в зависимости от срока хранения. Исследованиями подтверждено, что оставшееся количество жизнеспособных бактерий достаточно для
восстановления культуры при высеве на МПГА. После лиофилизации штаммы сохраняли свои исходные морфологические, культуральные, биохимические свойства. Лиофилизация не влияла на серологическую активность и вирулентность. Следовательно, установлено, что лиофилизация является оптимальным способом длительного хранения штаммов возбудителя сапа. Наиболее приемлемо использование обезжиренного молока как стабилизатора, несложного в приготовлении и применении.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сап, криопротекторы, лиофилизация, микробные клетки, штамм.
Несмотря на постоянное углубление знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, наука все еще далека от понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние и обратно [8]. Примерно за 60-летнюю историю активного изучения мира микроорганизмов и создания их коллекций, накопились достаточно общие, но все еще не вполне четкие представления по управлению процессами консервации для сохранения жизнеспособности каждого конкретного микроорганизма.
Опыт работы отечественных и зарубежных исследователей с коллекциями микроорганизмов свидетельствует о том, что современные методы консервации оказываются эффективными для поддержания в рабочем состоянии коллекционных культур микроорганизмов, от первичного изучения до использования их в производстве различных биопрепаратов [6].
Из литературных источников известно [4], что в музеях микроорганизмов для сохранения штаммов бактерий, грибов и вирусов в жизнеспособном и стабильном состоянии используются методы непродолжительного (субкультивирование, или метод перевиваемых культур; хранение под минеральным маслом; в виде водно-солевых растворов; высушивание на твердых носителях; замораживание при температурах ниже точки кристаллизации воды) и длительного хранения микроорганизмов (консервация замораживанием при низких температурах; лиофилизация; высушивание из жидкого состояния) [3,5].
Продолжительность сохранения жизнеспособности сапного микроба зависит от его биологических свойств и условий, в которых находится. Он относительно неустойчив к воздействию неблагоприятных условий внешней среды, физических и химических факторов [7]. Вопрос длительного хранения штаммов возбудителя сапа в литературе освещен крайне недостаточно.
Штаммами возбудителя сапа коллекция стала формироваться с выделения Burcholderia mallei №5584 Д.С.Руженцевым в 1917 году от больной лошади, у которой сап проявлялся в трех формах: носовой, легочной, кожной. В последующем она пополнялась штаммами, выделенными в различных регионах мира (Польша, Венгрия, Югославия, Индонезия, Индия, Голландия). При длительном хранении культур на искусственных питательных средах возникает опасность потери ими основных культурально-морфологических и биологических свойств. Чтобы избежать этого, нужны регулярные пересевы и постоянное изучение их
основных свойств, что необходимо для ведения коллекционной деятельности [2]. Поэтому перед нами стоит задача поддержания штаммов возбудителя сапа в рабочем состоянии и выявления оптимальных условий длительного хранения, обеспечивающих сохранность ими морфологических, культуральных, биохимических, серологических и вирулентных свойств. Известно, что наилучшим способом длительного хранения является лиофилизация - обратимое консервирование микроорганизмов, при котором высушивание происходит из замороженного состояния в вакууме, минуя жидкую фазу. На стадии замораживания часть клеток погибает. Причинами гибели могут быть следующие факторы: внутриклеточная кристаллизация; действие электролитов, концентрация которых возрастает в межкристаллических пространствах по мере вымораживания влаги; механическое повреждение клеток (биомембран) кристаллами льда и другие. В настоящее время в качестве ограждающих добавок при лиофилизации используют обезжиренное молоко, смесь сахарозы с желатиной, пептон, глютамат натрия, сыворотки и другие. В результате удается в максимальной степени сохранить специфические свойства белков, свести к минимуму процессы денатурации и обмена веществ, обеспечить переход живой клетки в состояние длительного анабиоза, облегчающие задачи стандартизации микроорганизмов.
Исходя из вышеизложенного, целью нашей работы было испытание действия сред высушивания, как в процессе лиофилизации на жизнеспособность и сохранность основных биологических свойств микробной клетки возбудителя сапа, так и длительном хранении.
Материалы и методы. Для проведения основного опыта были взяты семь штаммов возбудителя сапа, изучены их морфологические, культуральные, биохимические свойства. Культурально-морфологи-ческие свойства определяли путем посева культур на МПГА, МПГБ, картофель по Павловскому, микроско-пированием окрашенных мазков. При изучении биохимических свойств определяли образование сероводорода посевом на МПГБ с индикаторной бумажкой, пропитанной уксусно-кислым свинцом; по изменению свойства обезжиренного молока, 12%-ной желатины, после внесения сапных бактерий.
После проверки основных свойств на соответствие паспортным данным штаммы готовили к лиофи-лизации. Для этого двухсуточные культуры, выращенные на МПГА при температуре 37оС, смывали средой высушивания, суспензии разливали в стерильные ампулы по 1 мл. В качестве сред высушивания (стабили-
заторов) были использованы: сахарозо-желатиновая (сахарозы 10,0 г, желатины 1,0 г, дистиллированной воды 1,0 л) и обезжиренное молоко.
Лиофилизацию проводили на установке «Фригера» ЛЗ-9, режим был рассчитан и предопределен для данного вида возбудителя. Так как возбудитель сапа относится ко II группе патогенности (опасности), работа проводилась согласно санитарным правилам СП 1.3.3118-13 [1].
Результаты исследований. Изучением основных свойств семи штаммов возбудителя сапа перед лиофи-лизацией установлено, что они представляют собой палочки, располагающиеся как нитями, так и поодиночке, неподвижны, по Граму красятся отрицательно. При окраске синькой Лефлера просматривается зернистость. При культивировании на МПГА на вторые сутки дают хороший рост, форма и цвет колоний характерны для возбудителя. На глицериновом картофеле сапные штаммы растут в виде нежного, желтоватого, просвечивающегося наложения, на 6-8 день желтый цвет переходит в коричневый. Образуют сероводород, свертывают молоко.
Проверенные штаммы на соответствие паспортным данным рассевали на МПГА для получения бактериальной массы. Выросшие культуры смывали двумя испытуемыми средами высушивания. Концентрацию взвеси микробных клеток определяли путем последовательных 10-кратных разведений и высевом на МПГА в чашки Петри с последующей инкубацией при 370С в течение трех суток. По последнему разведению, которое давало рост на чашках, определяли концентрацию микробных клеток в 1мл, которая составляла 90 млрд.
Лиофилизация проведена по ранее отработанному режиму: 1) замораживание материала в течение 18 часов до -400С в морозильной камере; 2) перенос материала в лиофильную установку, охлаждение плиты до -520С; 3) включение вакуума; 4) лиофилизация в автоматическом режиме в течение 12 часов; 5) включение обогрева (Р) через 17 часов с момента загрузки материала при следующих параметрах: 1плиты +100С, t 00С; 6) включение обогрева (р+1) через 18 часов при следующих параметрах: t +200С, t +50С,
г m —i г г плиты ' среды '
вакуум 0,5 trr; 7) часовой диапазон 24 часа: ^литы +320С, tel»» 250С, вакуум 0,05 trr. Окончание сушки при относительной влажности в пределах 2-3,5%.
Запайку ампул проводили без вакуума, так как ампулы с культурами особо опасных инфекций, патогенных для человека, запаиваются только без вакуума.
С целью проверки процента жизнеспособных микробных клеток после лиофилизации, в ампулы с высушенными культурами добавляли 1 мл 0,85%-ного раствора NaCl. Суспензии переносили в пробирки, делали девять последовательных десятикратных разведений в 0,85%-ном растворе NaCl и проводили мерный (по 0,1 мл) высев на три чашки с МПГА. Через трое суток инкубации при 370С подсчитывали выросшие колонии. По последнему разведению, которое дало рост на чашках, определяли процент выживших клеток. Установлено, что после лиофилизации с применением двух
сред высушивания сохранялось от 60 до 74% жизнеспособных клеток и основные свойства для данного возбудителя, которые определяли по методам лабораторного исследования на сап.
Лиофилизация не влияла на серологическую активность. Как до, так и после лиофилизации регистрировали положительную РА с соответствующими гипериммунными сыворотками, полученными на гомологичные антигены трехкратным введением культуры кроликам.
Подкожным заражением золотистых хомячков установлено, что вирулентность культур сохранена на прежнем уровне - в пределах 50х106-10х107.
В последующем жизнеспособность лиофилизи-рованных культур с применением двух сред высушивания контролировали ежегодным высевом на МПГА с последующей проверкой основных свойств методами лабораторных исследований на сап. Установлено, что в процессе хранения в течение 5 лет (срок наблюдения) в высушенном состоянии процент жизнеспособных клеток снизился от 0,0001 до 9%. При этом основные биологические свойства сохранились. Кроме того выявлено, что существенного различия между примененными для лиофилизации средами нет, как в показателе процента выживших клеток, так и сохранности основных свойств.
Однако, сахарозо-желатиновая среда многокомпонентная, перед применением ее необходимо прогревать и использовать в теплом виде, при остывании увеличивается ее вязкость, что затрудняет смыв культуры с поверхности питательной среды и разлива в ампулы.
Обезжиренное молоко однокомпонентно, несложно в приготовлении и использовании. Поэтому данная среда удобна для применения.
На основании полученных данных считаем наиболее приемлемым использование обезжиренного молока в качестве среды для лиофилизации бактерий возбудителя сапа.
Заключение. В результате проведенных исследований показана возможность сохранения лиофили-зированными штаммами возбудителя сапа исходных морфологических, культуральных, биохимических свойств, серологической активности и вирулентности в течение пяти лет (срок наблюдения). Следовательно, лиофилизация является оптимальным способом длительного хранения бактерий возбудителя сапа. Процент жизнеспособных клеток после лиофилиза-ции сохраняется в пределах 60-74%, а в последующем снижается до 0,0001-9% в течение пяти лет хранения.
В процессе экспериментов существенного различия между примененными в качестве защитных сред при лиофилизации бактерий возбудителя сапа сахарозо-же-латиновой и обезжиренного молока по показателям процента выживших клеток и сохранности основных свойств не выявлено. Однако в связи с тем, что обезжиренное молоко просто в приготовлении и применении - эту среду рекомендуем для использования в дальнейшей работе по лиофилизации бактерий возбудителя сапа.
Литература
1. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патоген-ности». Приложение СП.1.3.3118-13: утв. 28.11.2013 г. Врио Гл. гос. санитарного врача РФ А.Ю.Поповой, № 64 // сайт «Судебные и нормативные акты РФ». - 182 с.
2. Беляков, В.Д. Псевдомонады и псевдомонозы / В.Д.Беляков, Л.А.Ряпис, В.И.Илюхин. - М.: Медицина, 1990. - 224 с.
3. Герна, Р. Хранение микроорганизмов / Р.Герна // Методы общей бактериологии. Ч.1. - М.: Мир, 1983. - С. 512-534.
4. Malik, K.A. Liquid-dryng of microorganisms usig a simpl apparatus / K.A.Malik // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1992. - Vol .8. - P. 80-82.
5. Похиленко, В.Д. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д.Похиленко, А.М.Баранов, К.В.Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - № 4 (12). - С. 99-121.
6. Санитарные правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». СП 1.2.036-95: утв. и введены в действие Постановлением Госкомсанэпиднадзора России 28.08.1995, № 14 // Электронный фонд правовой и нормативно-технической документации. - 52 с.
7. Fortney, K.F. Stabilization of culture productivity / K.F.Fortney // Dev. Industr. Microbiol. - 1977. - Vol. 18. - P. 319-325.
8. Smith, D. The preservation and maintenance of living fungi / D.Smith, A.H.S.Onions. - Surrey (England): Commonwealth Mycol.Inst.Publ, 1983. - 51 p.
THE INFLUENCE OF MEDIA ON DRYNG STABILITY OF THE CAUSATIVE AGENT OF GLANDERS IN THE PROCESS OF LYOPHILIZATION AND SUBSEQUENT STORAGE
1Melnikova L.A. - Candidate of Veterinary Sciences; 1Ivanova S.V. - Candidate of Biological Sciences;
1Makaev Kh.N. - Doctor of Veterinary Medicine, professor; 2Bukova N.K. - Doctor of Biological Sciences,
professor.
1Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
2All-Russia state Centre for Standartization and Quality Control for Animal Medical and Forages (e-mail:
bukova@vgnki.ru).
Proper long-term storage of microorganisms species reference and field strains with preservation of their biological properties is the major aim of collecting the living cultures. There are several major ways of microbial cultures long-term storage: lyophilization, cryopreservation and periodic re-seeding in nutrient media. The possibility of long-term storage of glanders causative agent strains in lyophilized state using protective environments (stabilizers) - skim milk, saccharose-gelatin- was experimentally confirmed. A procedure for strain preparing was developed, lyophilization mode was designed and predefined, a time range of lyophilization and the final relative humidity in the range of 2-2.5% was set. To determine the percentage of viable cells the lyophilized culture was suspended and cultivated in MPGA. The survival rate of viable cells was 60-74%. Further, annually during 5 years (time of observation) the percentage of survival rate in viable cells in a freeze-dried mass was monitored. The studies showed that freeze-drying resulted in reduction of number of recovered cells from 0.0001 to 9% depending on storage period. Research confirmed that the remaining number of viable bacteria is sufficient to restore the culture using MPGa medium. Lyophilized the strains retained their original morphological, cultural, biochemical properties. Lyophilization did not affect the serological activity and virulence. Therefore, that lyophilization was established to be the best way for long-term storage of glanders strains. Skimmed milk as a stabilizer is the most appropriate stabilizer and is simple to prepare and use.
KEYNWORDS: glanders, cryoprotectansts, liophilization.
References
1. Sanitarno-ehpidemiologicheskie pravila «Bezopasnost' raboty s mikroorganizmami I-II grupp patogennosti». Prilozhenie SP. 1.3.3118-13 [Sanitation and epidemiological regulations "Safe handling of microorganisms of I-II group of pathogenisity". Appendix Sanitation Regulations: 1.3.3118-13]: approved on 28.11.2013 by acting the russian Federation chief sanitary doctor A.YU.Popova, № 64 // website «Sudebnye i normativnye akty RF». - 182 p.
2. Belyakov, V.D. Psevdomonady i psevdomonozy [Pseaudomonades and pseaudomonoses] / V.D.Belyakov, L.A.Ryapis, V.I.Ilyuhin. - M.: Medicina, 1990. - 224 p.
