CC BY
31
УДК 619:616.98:578.834.11:638.52/.58:616-076
Ключевые слова: инфекционный бронхит кур, полимеразная цепная реакция, диссеминация вируса в организме
Key words: infectious bronchitis virus, polymerase chain reaction, virus dissemination in chicken
Дандал А. Ш., Кулаков В. Ю., Сухарев В. Ю., Макаров В. В.
ПАТОГЕНЕЗ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР. СООБЩЕНИЕ 2. ДИССЕМИНАЦИЯ ВИРУСА В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ПЦР
the infectious bronchitis pathogenesis. part 2.
the investigation by pcr of virus dissemination in chickens
'ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Адрес: 117198, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6
1Peoples' Friendship University of Russia Address: 117198, Russia, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 6 2ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
2FGBI "Federal Centre for Animal Health" (FGBI "ARIAH") Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets
Дандал Али Шилбли, аспирант1. E-mail: alidandal@mail.ru
Dandal Ali Sh., Postgraduate1. E-mail: alidandal@mail.ru Кулаков Владимир Юревич, к. в. н., вед. науч. сотрудник лаборатории профилактики болезней птиц2
Kulakov Vladimir Ju., Ph.D. in Veterinary Science, Leading Research Scientist of the Laboratory of avian disease prevention2 Сухарев Олег Иванович, д. в. н., проф. каф. клинической ветеринарии1 Sukharev Oleg I., Doctor of Veterinary Medicine, Professor of the Dept. of Clinical Veterinary Medicine1
Макаров Владимир Владимирович, д. б. н., проф. каф. клинической ветеринарии1 Makarov Vladimir V., Doctor of Biology Science, Professor of the Dept. of Clinical Veterinary Medicine1
Аннотация. С помощью количественной ПЦР исследована кинетика диссеминации вируса ИБК штаммов «Н-120», «4/91» и «QX» в организме 10-суточных цыплят. По отношению к штамму «Н-120» (референт) определены коэффициенты относительной адаптированности исследуемых штаммов к тканям различных органов.
Summary. The dissemination kinetics of infectious bronchitis virus (strains "H-120", "4/91" and "QX") in the body of 10-day-old chickens was studied by using quantitative PCR. The coefficients of relative adaptation for the studied strains to the tissues of various organs were determined in relation to the (referent) strain "H-120".
Введение
Возбудитель инфекционного бронхита кур (ИБК) - РНК-содержащий вирус семейства Coronaviridae - обладает широким тканевым тропизмом, что обусловливает разнообразие клинических симптомов заболевания. Считается, что ткани дыхательной системы - главная мишень вируса [1, 6, 7]. Однако некоторые штаммы могут вызывать тяжелые поражения почек, а в респираторном тракте обусловливают лишь слабое воспаление. При этом другие штаммы поражают только ткани респираторного тракта [9].
На практике клиническая диагностика ИБК имеет определенные сложности, что затрудняет проведение соответствующих ограничительных и профилактических мероприятий. В этой связи изучению патогенеза ИБК уделяется большое внимание [8].
Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование процесса распространения (диссеминации) в организме птицы различных штаммов вируса ИБК и оценка их преимущественного тропизма с использованием ПЦР.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы вируса ИБК: вакцинный «Н-120» серотипа Массачусетс, вакцинный «4/91» серотипа 793/В, эпизоотический депонированный ЯР08-10 генотипа <^Х», культивируемые в SPF-эмбрионах кур, в виде лиофилизированной вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости с инфекционными титрами в диапазоне 6,7-7,0 ^ЭИД50/см3.
В качестве подопытных использовали выведенных из SPF-эмбрионов кур клиниче-
ски здоровых цыплят в возрасте 15 суток. Рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц данной возрастной категории.
При постановке полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР-РВ) нуклеиновую кислоту выделяли на роботизированной станции Tecan Freedom EVO-100 из 100 мкл образца суспензии с помощью набора «Magna DNA Prep 100» (ООО БиоКом, г. Москва). Использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидно-го зонда, выбранных для амплификации фрагмента нетранслируемой области генома вируса (UTR) согласно методическим указаниям [4]. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации.
Результирующим показателем принят номер цикла, при котором был достигнут пороговый уровень флюоресценции продуктов реакции (Ct-пороговый цикл). Величину ожидаемого титра вируса ИБК рассчитывали по формуле:
"lgT = (-0,2648) Ct + 9,3919,
где "lgT - искомая величина титра для заданного значения Ct в диапазоне 10 < Ct < 35 [2]. Использованная модель предполагает, что количество циклов амплификации находится в обратной зависимости от концентрации исходного генетического материала.
Для статистической обработки данных применяли стандартные методы оценки выборок варьирующих переменных, в том числе с использованием непараметрической статистики [3, 5]. Вычислительные операции и графические построения выполняли с помощью приложения Microsoft Office Excel.
Результаты и обсуждение
Соответственно исследуемым штаммам вируса образовали 3 опытные группы цыплят («Н-120», «4/91» и «QX») по 50 голов и одну контрольную группу в 30 голов.
Рисунок. Динамика накопления вируса ИБК ("^Т -прогнозируемая величина титра по данным ПЦР) в пробах тканей различных органов птиц соответственных штаммов (• «Н-120», ▲ «4/91», ■ <^Х») и времени после заражения (сут.).
В опытных группах провели окуло-назаль-ное заражение. Для всех штаммов была принята одинаковая заражающая доза 104 ЭИД50. Птица контрольной группы оставалась интактной.
Во всех группах был назначен ежедневной клинической осмотр птиц. Через заданные интервалы времени из опытных групп отбирали по 3 цыпленка, а также по одному цыпленку из контрольной группы. После эвтаназии при вскрытии у каждого цыпленка асептически отбирали образцы тканей ды-
хательной системы (трахеи и легких), почек, миндалин слепой кишки и репродуктивных органов. Пробы замораживали при -35 °С и использовали для выделения вирусного генома с последующим тестированием в ПЦР.
Через 5-7 суток после заражения во всех опытных группах наблюдали признаки респираторной патологии (кашель, трахеаль-ные хрипы и носовые выделения). В группе «QX» у цыплят отмечена слабость, заметное снижение аппетита и гибель 2 птиц на 5 сутки после заражения.
При исследовании распространения вируса в организме подопытных цыплят по данным ПЦР в полученных образцах тканей различных органов соответственно испытанным штаммам в динамике определяли показатели Ct и проводили расчет ожидаемых величин "lgT. Полученные результаты в виде диаграмм приведены на рисунке.
Представленные диаграммы показывают, что инфекционный процесс для всех исследуемых штаммов в большинстве случаев имел схожие черты. Прослеживалась начальная фаза (рост инфекционного титра), фаза максимального накопления и фаза снижения концентрации возбудителя (регрессия титра).
Однако при сохранении общей картины по количественным показателям штаммы имели различия. Вирус штамма «Н-120» наиболее эффективно репродуцировался в респираторной системе. В других органах его размножение было менее интенсивно. Особенно указанное отставание было заметно в тканях миндалин слепой кишки.
Штамм «4/91» в респираторной системе хронологически достигал максимума своего накопления менее чем за 5 суток. Однако его наибольший титр был примерно на порядок ниже, чем у штамма «Н-120». Эффективность развития штамма «QX» в респираторных органах была несколько ниже, чем у штамма «Н-120», но в период с 5 по 10 сутки заметно превышала репродукцию штамма «4/91».
В почках после 7 суток постоянным превосходством обладал штамм «QX». В миндалинах слепой кишки и репродуктивных органах интенсивность развития штаммов «QX» и «4/91» была приблизительно одинаковой.
Возможно допустить, что для всех штаммов первые две прогрессивные фазы инфекционного процесса в большей степени были зависимы от адаптированности вируса к данному типу ткани. При этом регрессия титров, наблюдаемая в основном после 7 суток, вероятно, являлась результатом развития иммунной реакции со стороны организма.
Исключение составляют процессы, зарегистрированные в миндалинах слепой кишки. В указанных органах количество генетического материала штаммов «ОХ» и «4/91» на протяжении всего эксперимента превосходило концентрацию продуктов репродукции штамма «Н-120». При этом ожидаемые различия инфекционных тиров относительно отмеченного штамма в среднем должны составлять более 2 порядков.
Анализ приведенных результатов показал, что для всех исследуемых штаммов вируса ИБК ткани респираторной системы птиц в начальной фазе развития инфекционного процесса являются наиболее благоприятной (элективной) зоной. В данной области организма на 5 сутки после инфицирования ожидаемые по накоплению генетического материала инфекционные титры возбудителя в ЭИД50/см3 составили от 3,95 у штамма «ОХ», до 5,0 у штамма «Н-120». Последующий процесс вирусной диссеминации, очевидно, происходил как вторичное явление. Во всех остальных тканях максимальные оценки титров приходились на 7 или 10 сутки.
По эффективности развития вне респираторной системы очевидным лидером следует считать штамм «ОХ», который через 7-9 суток накапливался (по ожидаемым "^ЭИД50) до 4,33, 4,15 и 3,85 ЭИД50/см3 в почках, в миндалинах слепой кишки и в тканях репродуктивных органов, соответственно. При этом распространение в организме птицы штамма «Н-120» было значительно менее выражено. В отмеченном временном интервале аналогичные оценки составили 3,29, 2,52 и 2,08. Промежуточное положение занял штамм «4/91».
В качестве условного показателя относительной адаптированности штамма к заданному виду ткани организма (коэффициента по референту) приняли медиану хронологической выборки величин:
ё] = 'ВД -
где ё] - коэффициент изучаемого штамма (]) на данном интервале времени; "^Т и "^Т0 - хронологически совпадающие оценки ожидаемых титров изучаемого штамма и штамма «Н-120» (референта), соответственно. Положительное значение принятого коэффициента (ё > 0) рассматривали как тенденцию к большей адаптированности штамма относительно референта, отрицательное значение (ё < 0) считали оценкой меньшей адаптированности. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Приведенные в таблице результаты указывают на то, что в респираторной системе птицы наибольшая эффективность воспроизводства была у штамма «Н-120». Коэффициенты ё4/91 = -1,09 {(-1,56)^(-0,81}р<0 05 и ёдх = -0,71 {(-0,96И-0,21}р<0,05 находились в отрицательной области и свидетельствовали о меньшей адаптированности остальных исследуемых штаммов.
При этом во всех остальных тканях репродукция референтного штамма была менее интенсивной. Оценки ё4/91 и границы их доверительных интервалов (р < 0,05) для ткани почек, миндалин слепой кишки и тканей репродуктивной системы составили 0,38 {(-0,02)-0,61}, 1,81 {1,53-2,22} и 0,76 {0,26-1,52}, соответственно. Коэффициенты ёдх, представленные в аналогичной форме и порядке, имели вид 1,07 {0,71-1,8}, 2,51 {1,71-2,84} и 1,04 {0.61-1.77}, соответственно.
В биологическом смысле это означало, что ожидаемое накопление штамма «4/91» превосходило таковое референтного вируса в зависимости от вида ткани в диапазоне от 2,4 до 65 раз. При этом развитие штамма «^Х» при аналогичном сопоставлении было интенсивнее референтного вируса в диапазоне от 11 до 324 раз.
Важно отметить, что значительное превышение титров штаммов «4/91» и «^Х» по отношению к референтному, установленное
Таблица.
Коэффициенты относительной адаптированности* штаммов вируса ИБК «4/91» и «QX» по референтному штамму «Н-120», установленные для тканей различных органов птицы
Сутки** Респираторная система Почки Миндалины слепой кишки Репродуктивная система
1§Т0 ё4/91 ёох 1§Т0 ё4/91 ёох 1§Тп ё4/91 ёох 1§Тп ё4/91 ёох
1 1,20 -0,45 -0,19 1,04 -0,38 -0,76 -0,38 1,92 1,06 -0,97 0,90 1,23
2 4,52 -1,04 -1,54 1,52 0,83 -0,97 -0,01 2,59 2,66 0,30 0,47 0,63
3 5,00 -0,95 -1,05 2,34 0,30 -1,33 1,55 1,98 2,17 1,32 1,52 0,57
4 4,27 -0,86 -0,40 3,29 0,35 0,95 2,34 1,91 1,67 2,08 1,14 1,77
5 3,92 -1,65 -0,37 3,02 -0,49 1,30 2,52 1,53 1,63 1,74 1,33 2,14
6 3,57 -1,56 -0,27 1,95 0,63 1,92 2,44 0,93 1,71 0,85 1,94 2,40
7 3,12 -1,22 -0,34 1,40 0,41 2,06 1,67 1,59 2,13 0,55 2,01 1,06
8 3,07 -1,62 -1,71 0,96 0,56 1,80 1,48 1,84 2,42 0,33 1,16 1,22
9 1,94 -0,70 -0,94 1,09 -0,02 1,46 0,81 2,22 2,89 0,43 0,59 0,61
10 1,65 -1,20 -0,84 0,88 -0,12 0,96 0,73 2,45 2,67 -0,28 0,63 1,02
11 1,27 -1,13 -0,96 0,37 0,05 1,19 0,34 1,78 3,28 0,11 0,19 0,15
12 1,10 -0,90 -0,96 -0,17 0,47 1,21 0,26 1,50 2,84 -0,12 -0,40 0,39
13 0,71 -0,81 -0,57 -0,29 0,58 0,84 0,31 0,93 2,59 -0,88 0,26 1,14
14 0,37 -1,87 -0,23 -0,35 0,61 0,71 -0,59 1,68 2,69 -0,58 -0,24 0,61
Медиана - -1,09 -0,71 - 0,38 1,07 1,81 2,51 0,76 1,04
Примечания: * - с] = "^Ц - "1яТ0, где с] - коэффициент относительной адаптированности изучаемого штамма (]) на данном интервале времени; "^Ц и "1яТ0 - хронологически совпадающие оценки титров изучаемого штамма и штамма «Н-120» (референта), соответственно; ** - сутки после инфицирования.
в миндалинах слепой кишки, может указывать на тропизм отмеченных возбудителей к лимфоидной ткани.
Заключение
Примененный способ опосредованной оценки эффективности воспроизводства вируса по накоплению вирусного генома с помощью ПЦР позволил наблюдать значительные различия концентрации маркеров репродукции вируса в различных тканях и, вероятно, может быть использован как средство оценки предпочтительного тканевого тропизма инфекта.
Хронологическое сопоставление прогнозируемых оценок накопления вируса относительно референтного штамма («Н-120») показало, что различия в титрах вируса (как степени адаптированности) в зависимости от вида тканей может достигать > 300 раз.
Список литературы
1. Борисов, А. В. Инфекционный бронхит кур [Текст] / А. В. Борисов, Т. В. Хлыбова, С. В. Фролов // Вет. мед. Украины. - 1998. - № 5. - С. 28-29.
2. Дандал, А. Ш. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опос-
редованной оценки инфекционного титра вируса инфекционного бронхита кур [Текст] / А. Ш. Дандал, Х. С. Абдуллоев // Ветеринарная практика. - 2013. -№ 3. - С. 28-32.
3. Закс, Л. Статистическое оценивание / Л. Закс. -М. : Статистика, 1976. - 598 с.
4. Овчинникова, Е. В. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [Текст] / Е. В. Овчинникова, Л. О. Щербакова, А. В. Андриясов и др. // Владимир : ВНИИЗЖ, 2010.
5. Холлендер, М. Непараметрические методы статистики [Текст] / М. Холлендер, Д. А. Вульф. - М. : Финансы и статистика, 1983. - С. 214-220.
6. Alexander, D. J. Isolation of avian infectious bronchitis virus from experimentally infected chickens [Текст] / D. J. Alexander, R. B. Gough // Res. Vet. Sci. -1977. - V 23. - P. 344-347.
7. Cook, J. K. A. Effect of in-ovo bursectomy on the course of an infectious bronchitis virus infection in line C white leghorn chickens [Текст] / J. K. A. Cook, T. F. Davison, M. B. Huggins, P. McLaughlan // Arch. of Virol. - 1991a. - Vol. 118. - P. 225-234.
8. Ignatovic, J. Pathogenicity of Australian strains of avian infectious bronchitis virus [Текст] / J. Ignatovic, D. F. Ashton, R. Reece et al. // J. Сотр. Pathol. - 2002. -V. 126, N 2-3. - P. 115-123.
9. Montgomery, R. D. Effects of an Arkansas strain of infectious bronchitis vaccine on the head-associated lymphoid tissue (HALT) [Текст] / R. D. Montgomery, W. R. Maslin, C. R. Boyle, T. Pledser et al. / Avian Dis. -1991. - Vol. 35. - P. 302-307.
# ВЕТЕРИНАР.™
Всё о ветеринарии для врачей и владельцев животных
< Sfl
форум
последние новости подборка статей справочники
каталог лекарственных средств адреса ветклиник и зоомагазинов информация о выставках и конференциях анонсы ветеринарных журналов
Заходите на www.veterinar.ru, и Вы найдёте много интересной и полезной информации!
Приглашаем к сотрудничеству ветеринарных врачей и организации, e-mail: invetiS'i nbox.ru boldvrevafamail.ru тел.: 8 (909) 646-76-43, 8 {916) 181-95-58
