CC BY
20
УДК 619:616.98:578.834.11:636.52\.58
Ключевые слова: вирус инфекционного бронхита кур, антигенное родство, иммуноферментный анализ
Key words: infectious bronchitis virus, antigenic affinity, enzyme-linked immune sorbent assay
Абдуллоев Х. С., Фролов С. В., Дандал А. Ш., Кулаков В. Ю.
СРАВНЕНИЕ ГОМО- И ГЕТЕРОЛОГИЧНЬГХ РЕАКЦИЙ ИММУННЫХ СыВОРОТОК, ПОЛУЧЕННЫХ НА ШТАММЫ «Н-120», «D-274» И «4/91» ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР
COMPARISON OF HOMO- AND HETEROLOGOUS REACTIONS OF ANTISERA PREPARED AGAINST "D274", "4/91" AND "H-120" STRAINS OF INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS
'ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Адрес: 117198, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6
1Peoples' Friendship University of Russia Address: 117198, Russia, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 6 2ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», лаборатория профилактики болезней птиц Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
2Federal Centre for Animal Health, Laboratory for Avian Deseases Address: 600901, Russia, Vladimir, Yurevets, Laboratory for Epidemiology and Monitoring of Avian Diseases
Абдуллоев Хуршед Сатторвич, аспирант1 / Abdulloev Hurshed S., Postgraduate1 Фролов Сергей Владимирович, к. в. н, зав. лабораторией2 Frolov Sergey V., Ph.D. in Veterinary Science, Laboratory Chief2 Дандал Али Шебли, аспирант1 / Dandal Ali Sh., Postgraduate1 Кулаков Владимир Юрьевич, к. в. н, вед. научн. сотрудник2 Kulakov Vladimir Yu., Ph.D. in Veterinary Science, Leading Research Scientist2
Аннотация. В непрямом твердофазном варианте ИФА показано, что для дифференциации гомо- и гетероло-гичных реакций может быть использован показатель контраста вида С = (Yh - Y0)/(Yhom - Y0), где С - величина контраста, Yhom, Yhet и Y0 - оценки оптической плотности в гомологичной, гетерологичной системах и отрицательного контроля, соответственно, для данного разведения тестируемых сывороток. Установлены величины одностороннего антигенного родства штаммов вируса инфекционного бронхита кур «D274» и «4/91» по отношению к штамму «Н-120», которые в размерности долей и с указанием границ диапазона ошибки измерений составили 0,380 [0,339 - 0,426] и 0,221 [0,200 - 0,245], соответственно.
Summary. Indirect ELISA showed that the contrast of the form C = (Yh - YJ / (Yhom - YJ can be used for differentiation of homo- and heterologous reactions. C is the value of contrast, Yhom, Yhet and Yg are evaluations of optical density of homologous, heterologous sera and negative control, respectively, for each dilution of test sera. We determined the value of unilateral antigenic relationship of strains of infectious bronchitis virus "D274" and "4/91" toward the strain "H-120", which in dimension of shares specifying the boundaries of the range of measurement error amounted to 0,380 [0,339 - 0,426] and 0,221 [0,200 - 0,245], respectively.
Введение
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозная болезнь вирусной этиологии, клинически проявляющаяся в виде дисфункций дыхательной системы, поражений органов мочевыделительной и репродуктивной систем. В настоящее время ИБК является одной из наиболее экономически значимых болезней в промышленном птицеводстве многих стран мира, в том числе и Российской Федерации [1, 6].
Возбудитель ИБК — гаммакоронавирус, имеет выраженную тенденцию к антигенной изменчивости и появлению новых се-
ротипов [5]. В настоящее время для классификации штаммов (серотипов) вируса ИБК не существует единой согласованной системы. Тем не менее для изучения антигенных и иммунологических свойств широко применяются функциональные тесты (РН, ИФА, РТГА) [11].
Основным способом борьбы с данным заболеванием является специфическая профилактика, однако антигенное разнообразие циркулирующих эндемичных штаммов ИБК может существенно снижать эффективность проводимой вакцинации [10, 12].
В связи вышесказанным представляется актуальным исследование антигенных свойств различных штаммов ИБК и количественная оценка их антигенного родства.
Целью настоящей работы являлось сравнение гомо- и гетерологичных реакций иммунных сывороток, полученных на штаммы «Н-120», «Л-274» и «4/91» вируса ИБК в непрямом твердофазном варианте ИФА.
Материалы и методы
Штаммы вируса ИБК. Штаммы «Н-120», «Э-274» и «4/91» вируса ИБК в составе экстраэмбриональной жидкости, полученные в результате расплодок на СПФ-эмбрионах кур.
Антигены штаммов вируса ИБК. Инфекционную активность изучаемых вирусных материалов скорректировали к наименьшему показателю (6,8 ^ЭИД50/см3). Далее проводили инактивацию вируса. С этой целью в образцы вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости добавляли аминоэтилэтиленимин (0,05 % по объему), смесь выдерживали 24 часа при температуре 25 °С. Таким образом, соответственно исследуемым штаммам, получили вирусные антигены: АОнШ; А^ и
Гипериммунные сыворотки морских свинок. Образцы штаммовых антигенов смешивали с адъювантом - гелем гидроокиси алюминия в равных объемах. Полученные смеси вводили морским свинкам весом 350-400 г (по 6 голов на каждый образец) внутримышечно в бедро, в объеме 1,5 см3. Повторную иммунизацию проводили через 14 суток. Далее с интервалом 7 суток выполняли еще 2 инъекции.
Через 40 суток после начала эксперимента провели забор крови. За 15 минут до операции выполняли процедуру анестезии и ми-орелаксации животных. Далее производили пункцию сердца и отбор образцов крови. После этого животных подвергали эвтаназии парами хлороформа.
Образцы крови декантировали от фибрина и форменных элементов, и полученные сыворотки объединяли соответственно исследуемым антигенам. Таким образом получали меланжированные штаммоспеци-
фичные гипериммунные сыворотки SH120,
п п
SD274 И S4/91 *
Иммуно-ферментный анализ (ИФА).
Применяли метод непрямого твердофазного ИФА с постоянной дозой иммобилизованного антигена* С этой целью использовали диагностические наборы компании Synbiotics (США) для определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур*
Реакцию выполняли в соответствии с инструкцией [8] до этапа индикации иммунных комплексов, где пероксидазный конъюгат для выявления куриных антител заменяли на аналогичный реагент, предназначенный для выявления антител морских свинок* В качестве отрицательного контроля использовали меланжированный образец сыворотки крови морских свинок, полученный до их иммунизации* Оптическую плотность продуктов реакции определяли на спектрофотометридере «STL» (Австрия) при длине волны 405 нм* Порядок обработки первичных данных описан в тексте*
Результаты
Испытывали двукратные разведения (D) сывороток в диапазоне от 1 : 100 до 1 : 12800* По завершении реакции в каждом разведении измеряли оптическую плотность хро-могенного субстрата (Y)* Испытания всех образцов сывороток проводили параллельно*
Было проведено три повторных эксперимента* Полученные результаты представлены в виде диаграмм на рисунке*
Приведенные диаграммы демонстрируют монотонно убывающие по оси lgD значения Y, установленные для всех испытанных образцов сывороток* В отрицательном контроле тренд указанных величин не выражен* В диапазоне разведений от lgD = 2 (1 : 100) до lgD = 2,204 (1 : 1600) оптическая плотность (ОП) образца SH120 была заметно выше, чем у образцов SD274 и S4/91, но при этом оптические показатели двух последних образцов формально превосходили отрицательный контроль*
В соответствии с тем что в использованных диагностических наборах для выявления антител к вирусу ИБК на планшетах иммобилизован антиген штамма Н-120 [6],
Рис. Результаты титрования сывороток морских свинок, иммунизированных штаммами «Н-120», «Б-274» и «4/91» вируса ИБК (три повторных опыта). Представлены оценки оптической плотности
исследуемых образцов сывороток SH120 (♦), SD274 (▲) и S4/91 (•) и отрицательного контроля S0(□), установленные соответственно величинам их разведений ф).
реакцию с сывороткой Б считали гомологичной ^от), остальные реакции рассматривали как гетерологичные ^е^.
В каждом опыте по всему испытанному диапазону разведений вычисляли среднее значение ОП отрицательного контроля (^0). Далее по данным hom-системы определяли границы диапазона разведений (р^ ^ Dmax), в которых проводили анализ полученных результатов (рабочий диапазон), где: Dmm -величина наименьшего испытанного разведения, Dmax - величина наибольшего разведения, в котором оценка соответствующего оптического показателя превосходит или равна удвоенной средней оценке ОП отрицательного контроля (т. е. Y > 2'^0).
В границах рабочего диапазона в каждом разведении тестируемых сывороток проводили сравнение оптических показателей
hom- и het-систем, где оценкой различия (показателем контраста) между значениями Yhom и Y с учетом оптики отрицательного контроля (Y0), установленной в данном разведении, считали величину:
С = - Yo) / (^оп - Yo).
Полученные в рабочем диапазоне разведений оценки ОП УЬоп, У и У0, а также выборки соответствующих показателей гетероло-гичного контраста, представлены в таблице 1 (в целях ограничения влияния возможных резко выпадающих значений С для вычислительных процедур использовали величины ^С).
Был проведен анализ распределений показателей ^С в обеих выборках на предмет установления степени их асимметрии и эксцесса (островершинности), что являлось обоснованием использования средних значений и применения стандартных методов обработки первичных данных [3]. Результаты анализа приведены в таблице 2.
Данные, представленные в таблице 2, позволили сделать ряд заключений. По критерию асимметричности (А/па< 3) для выборок и ^С2, фактические отношения составили 0,275 / 0,528 = 0,521 и 1,058 / 0,528 = 2,003, соответственно. По критерию эксцесса (Е/пе < 3) анализируемые выборки и ^С2 имели оценки 1,483 / 0,882 = 1,681 и 1,510 / 0,882 = 1,712. В обоих случаях критериальные неравенства выполнялись. На этом основании обе выборки были отнесены к нормально распределенным, что, в свою очередь, разрешало использовать стандартные методы параметрической статистики.
Были определены средние оценки гете-рологичных контрастов и их стандартные отклонения: ± G = (-0,420) ± 0,196
и "^С2 ± G = (-0,655) ± 0,177. Статистические коэффициенты t = указанных средних величин, учитывающие ошибку сделанных измерений, по критерию Стью-дента [3] демонстрировали высокую степень их значимости (р < 0,001). При этом и сами показатели "^С и "^С2 между собой достоверно различались.
Обсуждение
В качестве доноров иммунных сывороток в работе были использованы морские свинки,
поскольку данные животные не восприимчивы к вирусу ИБК. Это обстоятельство рассматривали как дополнительную гарантию получения более объективных данных в аспекте антигенного воздействия исследуемых вирусных штаммов. При этом концентрация антигенов (по крайней мере по титру инфекционного вируса) была приближенно равной.
Использование непрямого твердофазного варианта ИФА для дифференциации гомо- и гетерологичных реакций иммунных сывороток предполагало определенные особенности интерпретации получаемых результатов. Если в данном случае опираться на обычные величины соответствующих титров [2] тестируемых сывороток (т. е. величины наиболь-
ших разведений, при которых оптические показатели превосходят или равны удвоенному среднему значению оптики отрицательного контроля) и проводить их сравнение, то такой подход был бы не корректным (см. диаграммы первичных оценок оптических показателей в гомо- и гетерологичных реакциях, представленные на рисунке).
Очевидно, что использование оптических показателей для сравнения гомо- и гетерологичных реакций [7] представляется обоснованным. Однако сопоставление указанных оценок, установленных только для одного разведения тестируемых образцов сыворотки, может снижать надежность вывода о степени их различимости.
Таблица 1.
Оценки оптической плотности (У) в hom- и het-системах, а также показатели их контраста (С), установленные соответственно испытанным разведениям ф)* исследуемых образцов сывороток ^н-120; $Ю74; S4/91)
№ ^ош^Н-ш) ^еЫ (^274) (^4/91) ^ (ЬеМ) ^С2 (Ьй-2)
2,000 0,089 1,173 0,392 0,213 -0,554 -0,942
2,301 0,065 0,601 0,322 0,197 -0,319 -0,609
2,602 0,057 0,484 0,219 0,153 -0,421 -0,648
2,903 0,056 0,300 0,233 0,115 -0,139 -0,617
3,204 0,064 0,143 0,126 0,119 -0,105 -0,157
2,000 0,079 0,602 0,190 0,160 -0,673 -0,810
2,301 0,065 0,412 0,150 0,120 -0,611 -0,800
2,602 0,051 0,320 0,138 0,098 -0,490 -0,758
2,903 0,061 0,168 0,118 0,080 -0,274 -0,751
3,204 0,058 0,152 0,127 0,087 -0,134 -0,511
2,000 0,081 0,675 0,223 0,198 -0,621 -0,706
2,301 0,062 0,482 0,168 0,128 -0,598 -0,804
2,602 0,05 0,288 0,125 0,115 -0,502 -0,564
2,903 0,059 0,221 0,128 0,093 -0,371 -0,678
3,204 0,055 0,161 0,079 0,082 -0,645 -0,594
3,505 0,052 0,124 0,092 0,073 -0,255 -0,535
Примечание: * — представлены результаты трех повторных измерений.
Таблица 2.
Результаты статистического анализа выборок показателей контраста (С), установленных в гетерологичных реакциях с сыворотками SD274 и S4/91
Выборка показателей контраста Оценка симметрии (А) Статистика асимметрии (Ша) Оценка эксцесса (Е) Статистика эксцесса (шЕ) Среднее значение П§С) Стандартное отклонение (±Ц0
^ С1 0,275 0,528 1,483 0,882 -0,420 ±0,196
^ С2 (84/91) 1,058 1,510 -0,655 ±0,177
Предлагаемый вариант показателя контраста оптики гетерологичной реакции (С) практически повторяет известную для ИФА S\P-оценку, с той разницей, что произведена замена оптической величины положительного контроля на ОП гомологичной реакции. Показано, что в установленных границах рабочего диапазона выборки значений ^С имеют нормальное распределение и их средние величины ("^С) пригодны для стандартных статистических операций.
Установлено, что показатели "1§С, установленные для сывороток Б и Б4/ по отношению к сыворотке имели вы-
сокий уровень значимости, что свидетельствовало о существенных антигенных различиях соответствующих вирусных штаммов. Опираясь на положение Архет-ти и Хорсфалла [4], величины "1§С были использованы в качестве оценок одностороннего антигенного родства штаммов Э274 и 4/91 по отношению к штамму Н-120. Искомые оценки в размерности долей и с указанием границ диапазона ошибки измерений составили "СШ74 = 0,380 [0,339 -0,426] и "С4/91 = 0,221 [0,200 - 0,245].
Благодарность
Авторы выражают искреннюю благодарность в. н. с. Меньщиковой А. Э и Самсоно-вой А. С за помощь при выполнении ИФА.
Список литературы
1. Борисов, А. В. Инфекционный бронхит кур. Эффективность ведения промышленного птицеводства в современных условиях / А. В. Борисов. Мат. науч.-практ. конф. - СПб : Издатель, 2012. - С. 12-15.
2. Егоров, А. М. Теория и практика иммунофер-ментного анализа / А. М. Егоров и др. - М. : Высшая школа, 1991.
3. Закс, Л. Статистическое оценивание / Л. Закс. -М. : Статистика, 1976. - 598 с.
4. Archetti, J. Persistent antigenic variation of influenza A viruses after incomplete neutralization in ovo with heterologus immune serum / J. Archetti, F. Horsfall // J. Exp. Med. - 1950, Vol. 92, № 5. - P. 441-462.
5. De Wit, J. Detection of infectious bronchitis virus / J. De Wit // Avian Pathol. - 2000, Vol. 29. - P. 71-93.
6. De Wit, J. Efficacy of infectious bronchitis virus vaccinations in the field: association between the a-IBV IgM response, protection and vaccine application parameters / J. De Wit et al. // Avian Pathol. - 2010, Vol. 39. - P. 123-131.
7. Infectious Bronchitis Virus Antibody Test Kit Synbiotics Corporation [Электронный ресурс] http:// www.synbiotics.com/Products/ProductionAnimals/Avian/ ChickenProFLOKELISAKits/InfectiousBronchitisVirus/96-6506-TDS.pdf (accessed: 7.11.2013)
8. Jing, Li. Comparative analysis of the effect of glycyrrhizin diammonium and lithium chloride on infectious bronchitis virus infection in vitro / Li. Jing, Yin Jiechao et al. // Avian Pathol. - 2009, Vol. 38. -P. 215-221.
9. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2013. [World Organisation For Animal Health [Электронный ресурс] http://www.oie. int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.02_ AIB.pdf (accessed: 8.12.2013)
10. Wu, Z. Q. Antigenic and immunogenic characterization of infectious bronchitis virus strains isolated in China between 1986 and 1995 / Z. Q. Wu, Q. W Yang et al. // Avian Pathol. - 1998, Vol. 28. - P. 578-585.
11. Zanella, A. Avian Infectious Bronchitis: Characterization of New Isolates from Italy / Zanella A. et al. // Avian Diseases. - 2003, Vol. 47, N 1. - P. 180-185.
12. Zellen, G. Determination of the Antigenic Relationships among Six Serotypes ofInfectious Bronchitis Virus Using the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Serum-Neutralization Test / G. Zellen, J. Thorsen // Avian Diseases. - 1987, Vol. 31, N 3. - P. 455-458.
1 ri (/ ВСЕРОССИЙСКАЯ ВЕТЕРИНАРНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ж. в рамках специализированной выставки «Зоомир. Домашние животные» реклама
1 14 ноября 2014 года МВДЦ «Сибирь», г. Красноярск Мероприятие станет главной площадкой года для практикующих ветеринарных врачей Сибирского федерального округа, где участники обсудят новые возможности ветеринарной медицины, вопросы лабораторной диагностики и профилактики заболеваний, познакомятся с новыми тенденциями, получат новые знания, обсудят насущные вопросы и проблемы, укрепят партнерские связи. Организаторы: Красноярская Краевая гильдия практикующих ветеринарных врачей, ЗАО ВК «Красноярская ярмарка» Справки: Харитонова Олеся, т. (391) 228-86-20, м. т. +7 (923) 270-00-40, e-mail: [email protected] www.krasfair.ru
> i
