CC BY
47
УДК 619:616.98:578.834.11;616-092:636.52/.58
Ключевые слова: инфекционный бронхит кур, полимеразная цепная реакция, вирус генотипа «QX» Key words: infectious bronchitis virus, polymerase chain reaction, virus genotype "QX"
Дандал А. Ш., Сухарев О. И., Макаров В. В.
ПАТОГЕНЕЗ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР. СООБЩЕНИЕ 1. РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСА ГЕНОТИПА «QX» В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ЗАРАЖЕНИЯ
THE INFECTIOUS BRONCHITIS PATHOGENESIS. PART 1. THE REPRODUCTION OF VIRUS GENOTYPE "QX" WITH DIFFERENT MODES OF INFECTION IN CHICKENS
ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов». Адрес: 117198, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6 Peoples' Friendship University of Russia. Address: 117198, Russia, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 6
Дандал Али Шилбли, аспирант / Dandal Ali Sh., Postgraduate Сухарев Олег Иванович, д. в. н., проф. каф. клинической ветеринарии Sukharev Oleg I., Doctor of Veterinary Medicine, Professor of the Dept. of Clinical Veterinary Medicine Макаров Владимир Владимирович, д. б. н., проф. каф. клинической ветеринарии
Makarov Vladimir V., Doctor of Biology Science, Professor of the Dept. of Clinical Veterinary Medicine
Аннотация. Вирус инфекционного бронхита кур генотипа «QX», штамм «RF08-10» вызывает в организме птицы инфекционный процесс, сопровождающийся тяжелыми клиническими симптомами. Вирус эффективно развивается в организме как при окуло-назальном, так и клоачном способах инфицирования, имеет тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок.
Summary. An infectious bronchitis virus (IBV) genotype "QX" strain RF08-10 causes the infectious process with severe clinical signs in the bird's organism. The virus effectively develops in the body regardless whether the way of infection was oculonasal or cloacal. It has a tropism to the tissues of the respiratory tract, kidneys, ovaries and lymphoid tissues of blind and large intestines.
Введение
Инфекционный бронхит кур (ИБК) является одной из наиболее экономически значимых болезней промышленного птицеводства. Заболевание было впервые описано Schalk и Hawn [5] как респираторная болезнь цыплят, и считалось, что ей подвержена только молодая птица. Однако дальнейшие исследования показали, что ИБК встречается как у молодняка, так и у кур-несушек [6].
В настоящее время болезнь распространена практически во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство. В последние годы вспышки ИБК регистрируются в птицеводческих хозяйствах многих стран, в том числе в Российской Федерации и странах СНГ [1, 7]. Биологические особенности возбудителя (высокая контагиозность и восприимчивость популяции хозяина, длительная персистенция) способствуют стационарности и широкому распространению заболевания [9]. Клинические проявления болезни зависят от ряда факторов, среди
которых следует отметить вирулентность и тропизм циркулирующего штамма вируса. Считается [8], что ткани дыхательной системы - ворота инфекции и главная патогенетическая мишень вируса.
Однако в последние годы вирус ИБК был выделен из клоакальных мазков и тканей кишечника [10]. При этом есть сообщение о возможности инфицирования цыплят вирусом ИБК клоакальном способом. Предполагают, что возможен перенос материала окружающей среды (в том числе инфекционного) через анальное отверстие в клоаку. Далее перистальтика нижних отделов кишечника может способствовать распространению инфекции в организме птицы [11]. В связи с этим допустимо считать, что проникновение возбудителя ИБК таким способом возможно.
Цель настоящего исследования заключается в сравнении патогенного действия вируса ИБК для СПФ цыплят при использовании окуло-назального и клоакального способов.
Материалы и методы
В работе использовали депонированный штамм «RF08-10» генотипа «QX» отечественного происхождения, клинически здоровых цыплят 10-дневного возраста, выведенных из СПФ-эмбрионов кур. На базе вивария ФГБУ «ВНИИЗЖ» птиц содержали в клетках; рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц данной возрастной категории. Сыворотки крови интактных и иммунизированных цыплят исследовали в ИФА (непрямой твердофазный вариант) с использованием диагностических наборов фирмы Synbiotics для детекции антител к вирусу ИБК.
Для постановки полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР-РВ) использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, выбранных для амплификации фрагмента нетранслируе-мой области генома вируса (UTR) согласно Методическим указаниям [4]. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett Research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации.
У подопытных и контрольных цыплят после эвтаназии извлекали почки. Кусочки тканей удаленных органов фиксировали 10%-м раствором формалина и заливали парафином. Готовили срезы парафинизированных тканей толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
Результаты и обсуждение
Были образованы две подопытные группы (А и Б) по 50 цыплят в каждой и контрольная группа птиц из 30 голов. Цыплят за сутки до заражения не кормили. Цыплята группы А были заражены вирусом ИБК окуло-на-зально. Заражение выполняли с помощью дозатора по 104 ЭИД50. Цыплят группы Б инфицировали в клоаку с помощью катетера в дозе 104 ЭИД50. Во всех группах проводили ежедневный клинической осмотр птиц.
Через заданные интервалы времени (указаны на рисунке 2) из групп А и Б отбирали по 3 цыпленка, а также по одному цыпленку из контрольной группы. Материал от ото-
бранных цыплят после эвтаназии подвергали патологоанатомическому исследованию. При вскрытии у каждого цыпленка асептически отбирали дыхательные органы (трахею и легкие), миндалины слепой кишки, почки, репродуктивные органы, бурсу. Пробы замораживали при -35 °С и использовали для выделения вирусного генома в ПЦР и гистологических исследований.
Было установлено, что проявление клинических признаков болезни у птиц при двух использованных методах заражения было неодинаковым. У цыплят группы А через 3 суток после заражения наблюдали характерный для бронхита респираторный сим-птомокомплекс. На 7-8 сутки регистрировали слабо выраженную почечную патологию (отечность и анемию).
У цыплят группы Б признаков респираторного синдрома не отмечено. Однако гистологические изменения в почках наблюдали уже на 3 сутки после заражения, на 5 сутки были зарегистрированы очевидные признаки нефрозо-нефрита. Вирус вызывал дистрофию, вакуолизацию и десквамацию эпителия канальцев. Поражения отмечались в основном в собирательных протоках, прямых канальцах и дистальных извитых канальцах мозгового вещества почки. К 5 суткам поражения почек были более выражены как в коре, так и мозговом веществе органа. Дегенерацию клеток и некрозы обнаруживали в канальцах и протоках коркового и мозгового вещества. Также наблюдали интерстициаль-ный отек с инфильтрацией из лимфоцитов и макрофагов (рис. 1).
По результатам ПЦР определяли количество циклов амплификации праймирован-ного участка вирусного генома. Количество циклов амплификации находится в обратной зависимости от концентрации генетического материала вируса в пробах. В связи с тем, что известная модель связи между пороговым циклом амплификации и величиной титра вируса ИБК [2] не является штаммоспеци-фичной, это позволило использовать ее для прогноза накопления возбудителя в исследуемых образцах инфицированных тканей птиц. Полученные результаты представлены в виде хронологических диаграмм на рисунке 2.
Контроль Опыт
Рис. 1. Микрофотографии образцов мозговой ткани почек, взятых в контрольной и опытной (7 суток после заражения) группах цыплят. У инфицированных птиц наблюдается интерстициальный отек почечных канальцев с выраженной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами.
Рис. 2. Динамика накопления вируса ИБК (прогнозируемая величина титра по данным ПЦР, Т) в пробах тканей различных органов птиц в зависимости от способов заражения (окуло-назальный - •, ♦ и клоакальный - ■) и времени после заражения (сут.).
Представленные на рисунке 2 распределения показателей для обоих способов заражения демонстрируют наличие начального периода развития инфекционного процесса, кратковременный максимум накопления вируса и продолжительное монотонное снижение его концентрации. Наиболее высокий ожидаемый титр вируса для каждого типа ткани почти во всех случаях приходился на 4-6 сутки после заражения. При обоих способах инфицирования величины максимальных титров были близкими.
Однако в зависимости от использованного способа присутствовали определенные раз-
личия. При окуло-назальном заражении вирус интенсивнее развивался в респираторной системе и кишечнике, тогда как его проникновение в почки и яичники птицы происходило медленнее. При клоачном способе вирус интенсивнее диссеминировался в почки и репродуктивную систему птицы. При этом его накопление в тканях почек было заметно выше.
Продолжительность присутствия вируса в титрах выше 0,5 ^ в респираторной и репродуктивной системах при обоих способах заражения составляло около 20-25 суток. При этом присутствие вируса в почках (клоачный способ заражения) и кишечнике
за аналогичный период соответствовало более высоким титрам. Например, в почках при клоачном способе на 25 сутки ожидаемый титр вируса составлял не менее 2 в миндалинах слепой и толстой кишок - более 3
Заслуживает внимания тот факт, что при одинаковой интенсивности развития возбудителя в тканях респираторного тракта клиническая картина процесса в случае окуло-назального заражения была более выражена. Патологоанатомические изменения в почках, наблюдаемые в большей степени при клоачном заражении, совпадали с хронологией накопления вируса в тканях указанных органов.
Рассмотренные результаты свидетельствуют, что исследуемый вирус инфекционного бронхита кур генотипа <^Х», штамм «КР08-10» имеет явные признаки пантроп-ного инфекта, который способен к интенсивной репродукции в клетках по крайней мере четырех типов исследованных тканей. Очевидно, что начало периода регрессии вирусной репродукции приходится приблизительно на 7 сутки. Это обстоятельство хорошо согласуется с началом системной иммунной реакции организма [3].
Также следует указать, что развитие вируса, продолжающееся более 25 суток в миндалинах слепой кишки, указывает на возможный тропизм его к клеткам иммунной системы.
Заключение
Анализ полученных результатов позволил сделать ряд выводов. Вирус инфекционного бронхита кур генотипа <^Х», штамм «КР08-10» способен обусловить в организме птицы инфекционный процесс, сопровождающийся тяжелыми клиническими симптомами. Вирус эффективно развивается в организме как при окуло-назальном, так и при клоачном способе инфицирования, имеет тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок. Вероятно, возбудителю также
свойственен тропизм к клеткам иммунной системы, о чем свидетельствуют длительное присутствие и высокое его накопление в лимфатической системе кишечника.
Список литературы
1. Бочков, Ю. А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России: дис. ... канд. биол. наук / Бочков Юрий Александрович. - Владимир, 1999. - 180 с.
2. Дандал А. Ш., Абдуллоев Х. С. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса инфекционного бронхита кур // Ветеринарная практика. - 2013. - № 3. - С. 28-32.
3. Калнек Б. У, Джон Барнс Х., Чарльз У Биерд и др. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц. - М. : Аквариум, 2003. - 1231 с.
4. Овчинников, Е. В. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени / Е. В. Овчинников, Л. О. Щербакова, А. В. Андриясов и др. // ФГБУ ВНИИЗЖ. - 2010 г.
5. Alexander, D. J. Isolation of avian infectious bronchitis virus from experimentally infected chickens / D. J. Alexander, R. B. Gough // Res. Vet. Sci. - 1977. -V. 23. - P. 344-347.
6. Cavanagh, D. Infectious bronchitis / D. Cavanagh, A. Nagi Syed // Diseases of Poultry. - Ames, Iowa, 1997. - P. 511-526.
7. Darbyshire, J. H. Organ culture in avian virology: a review / J. H. Darbyshire // Avian Pathol. - 1978. -V. 7. - P. 321-335.
8. Gallardo R. A., Hoerr J. F., Berry W. D. et al. Infection bronchitis virus in testicles and venereal transmission // Avian Diseases, 2011. - V 55, N 2. -P. 255-259.
9. Hyun Jeong Leea. Characterization of a novel live attenuated infectious bronchitis virus vaccine candidate derived from a Korean nephropathogenic strain / Hyun Jeong Leea, Ha Na Youna, Ji Sun Kwona et al. // Vaccine. - 2010. - N 28. - P. 2887-2894.
10. Jia, W. A novel variant of avian infectious bronchitis virus resulting from recombination among three different strains / W. Jia, K. Karaca, C. R. Parrish // Arch. Virol. - 1995. - V. 140. - P. 259-271.
11. Sorvari, R. Anal Suckinglike movements in the chicks and chick embryo followed by the transportation of environmental material to the bursa of Fabricius, caeca and caecal tonsils / R. Sorvari, A. Naukkarinen, T. E. Sorvari // Poultry Science. - 1977. - N 56. -P. 1426-1429.
®
Наши подписные индексы в каталогах: Пресса России - 29447, Газеты. Журналы (Роспечать) - 33184
