CC BY
46
■ И I II II
■m
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Horwitz Е.М., Le Blanc К., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2005; 7151: 393—5.
2. Krampera M., Pasini A., Pizzolo G. et al. Regenerative and immunomodulatory potential of mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Pharmacol. 2006; 6[4): 435—41.
3. Владимирская Е.Б., Майорова O.A., Румянцев C.A., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М.: ИД Медпрактика-М. 2DD5. С. 75
4. Friedenstein A.J., Ivanov-Smolenski А.А., Chajlakjan R.K. et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiohimeras and heterotopic transplantats. Exp. Hematol. 1978; 6: 440—4.
5. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2DD1 ; 7: 211-28.
6. da Silva M.L., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Sci. 2DD6; 119: 2204-13.
7. De Bari C., Dell’Accio F., Tylzanowski P. et al. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum. 2001; 44: 1928-42.
8. Sabatini F, Petecchia L, Tavian M et al. Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities. Lab Invest. 2005; 85: 962—71.
9. Toma J.G., Akhavan М., Fernandes K.J. et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 2001 ; 3: 778-84.
10. Родионова H.B. Функциональная морфология клеток в остеогенезе. Киев: FlayK. Думка. 1989; 192 с.
11. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов. СПб.: «Петербург-XXI век» 1997; 160 с.
12. Данилов Р.К. Руководство по гистологии. В 2Т. Т.Н. СПб.: СпецЛит, 2001; 733 с.
13. Hirschi К.К., D’Amore Р.А. Pericytes in the microvasculature. Cardiovasc. Res. 1996; 32: 687—98.
14. Andreeva E.R., Pugach I.М., Gordon D. et al. Continuous subendothelial network formed by pericyte-like cells in human vascular bed. Tissue Cell 1998; 30: 127-35.
15. da Silva L.M., Caplan A.I., Nardi N.B. In Search of the In Vivo Identity of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells 2008; 26(91: 2287-99. [Full Text]
16. Шахламов B.A. Капилляры. М.: Медицина 1971. — 198 с.
17. Михайлов Л.FI., ПальцинА.А. К вопросу об остеогенных клетках-предшественниках при репаративном остеогенезе. Бюл. эксперим. биологии и медицины 1986; 101 [61: 755—7.
18. Хэм А., Кормак Д. Гистология. М.: Мир 1983; 4: 60—1.
19. Ross R., Everett N.B., Tyler R. Wound healing and collagen formation. VI. The origin of the wound fibroblast studied in parabiosis. J. Cell Biol. 1970; 44(31: 645-54.
20. Brighton C.T., Hunt R.M. Early histologic and ultrastructural changes in microvessels of periosteal callus. J. Orthop. Trauma 1997; 11: 244-53.
21. Richardson R.L., Hausman G.J., Campion D.R. Response of pericytes to thermal lesion in the inguinal fat pad of 10-day-old rats. Acta Anat. [Basel] 1982; 114: 41—57.
22. Oishi K., Kamiyashiki Т., Ito Y. Isometric contraction of microvascular pericytes from mouse brain parenchyma. Microvasc Res. 2007; 73: 20-28.
23. Charbord P., Tavian М., Humeau L. et al. Early ontogeny of the human marrow from long bones: An immunohistochemical study of hematopoiesis and its microenvironment. Blood 1996; 87: 4109—19.
24. Maximow A.A. Uber undifferenziet Blutzellen und mesenchymalen keimlager im erwchsenen organismus. Klin. Wochenschr. 1926; 5(43): 2193-9.
25. Ясвоин Г.В. К сравнительной гистологии крови и соединительной ткани. О возникновении основного вещества кости у млекопитающих. Арх. Биол. Наук 1935; 35[33: 553—76.
26. Заварзин А.А. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани. М.; Л.; Медицина 1947; 2: 273 с.
27. Jiang Y., Vaessen В., Lenvik Т. et al. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp. Hematol. 2002; 30(81: 896-904.
28. Crisan М., Yap S., Casteilla L. et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell 2008; 3(31: 301-13.
29. Михаилов. Мезенхима. Большая медицинская энциклопедия. Изд. 3-е. М.: Советская Энциклопедия. Т. 14, 1980: 496.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам: da Silva L.M., Caplan A.I., Nardi NB. In Search of the In Vivo Identity of Mesenchymal Stern Cells. Stern Cells 9008; 96(9): 9987-99. Crisan M., Yap S., Casteilla L. et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells In multiple human organs. Cell Stem Cell 9008:3(3): 301-13
Паравулычарные ткани - новый источник ММСК?
Применение достижений клеточных технологий в клинической практике возможно лишь при удовлетворении ряда требований, касающихся получения клеточного материала, безопасности и воспроизводимости результатов в клинической практике. В этой связи, активно исследуются методы и источники получения исходных клеточных популяций, их спецификации, особенности и свойства в экспериментах in vitro и in vivo.
Несмотря на идентификацию сходных с ММСК клеток в различных тканях и органах [1], их выделение осуществляется главным образом из красного костного мозга и жировой ткани, где их количество наибольшее, а процедура получения достаточно безопасна. Однако возможность осуществления инвазивных манипуляций для выделения ММСК ограничена тяжестью состояния пациента, которому в дальнейшем будет необходима клеточная терапия. В частности, в случае тяжелых повреждений опорно-двигательного аппарата дополнительные травмирующие мероприятия, связанные с получением костного мозга или жировой ткани, становятся
неприемлемыми, выделение клеточного материала откладывается. Более того, экспериментально доказано, что костный мозг животных, перенесших политравму, содержит меньшее количество гемопоэтических стволовых клеток [2] чем в состоянии физиологической нормы; подобное обстоятельство связано с их мобилизацией из костного мозга при травме на периферию. С определённой уверенностью можно экстраполировать это и на численность ММСК. В этой связи, в сочетании с идентификацией и изучением источников ММСК продолжается разработка и совершенствование протоколов их получения.
В рамках этого направления особый интерес представляют недавно опубликованные в журнале Bone and Joint Surgery результаты исследования L.J. Nesti с со-авт., нацеленные на использование в качестве источника ММСК тканей, удаляемых в процессе хирургической обработки ран.
В клиническом исследовании приняли участие 10 солдат армии США с ранами конечностей, в том числе и
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, Ni 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
множественными, полученными во время боевых действий в Ираке. Пострадавшие были доставлены в армейский медицинский центр Уолтера Рида (Вашингтон, США), на базе которого осуществлялась работа. В результате серийных хирургических обработок ран, нацеленных на удаление поврежденных «мягких тканей» и костных осколков из зон первичного и вторичного травматического некроза, был собран материал, использованный с согласия пациентов для дальнейших клеточных исследований.
Методика выделения клеток включала гомогенизацию мышечной ткани в культуральной посуде с добавлением DMEM, антибиотиков (пенициллин 300 Е/мл и стрептомицин 300 мг/мл) и фунгизона в высоких концентрациях для ликвидации микробного загрязнения. Затем материал помещался в среду, обладающую проте-олитическими свойствами за счет наличия коллагеназы II типа в концентрации 0,5 мг/мл, где выдерживался в течении 2 час. После этапов фильтрации и центрифугирования клетки высевались на поверхность культуральной посуды. Особенностями технологии инкубирования, на которые акцентировали внимание авторы, являлось промывание культуры раствором Хенкса непосредственно перед сменой среды для более быстрого очищения от неспособных к адгезии мононуклеаров, а также использование высоких концентраций антибиотиков и противогрибкового препарата, что, однако, не предотвратило потерю двух из двенадцати культур из-за микробной контаминации.
Исследователи подсчитали, что с одного грамма мышечной ткани было получено 7,1±6,4хЮ8 жизнеспособных клеток, из которых 26,4%±3,6% адгези-ровались к поверхности культурального пластика, принимая удлиненную веретеновидную форму, и начали пролиферировать со второго дня инкубирования. Через две недели культура достигла 80—90% конфлюэнтности. На втором этапе исследования проводилась детальная спецификация культуры в соответствии с основными критериями ММСК [3]. Методом проточной цитометрии была показана экспрессия CD73, CD90 и CD105 в сочетании со сниженной продукцией CD45. Клетки были также позитивны по маркерам CD29, CD44, CD146, что соответствует иммунофенотипу ММСК. Кроме того, была показана способность полученных клеток к диф-ференцировке в трех ортодоксальных направлениях: остеобластическом, хондробластическом и адипоцитар-ном. При стимуляции остеогенеза наблюдалось повышение содержания щелочной фосфатазы в культуре и преципитация солей кальция. Доказательством хондро-генеза послужила идентификация гликозаминогликанов посредством окрашивания альциановым синим. При дифференцировке в адипоцитарном направлении определялось внутриклеточное накопление липидных капель.
Для более полного подтверждения дифференциро-вочных потенций полученных клеток исследователи методом ПЦР с обратной транскрипцией показали экспрессию ряда генов, специфичных для представителей каждого отдельного направления дифференцировки. Клетки при культивировании в остеоиндуктивной среде экспрессировали CBFA1/RUNX2 (core binding factor а1), а также гены, ответственные за синтез щелочной фосфатазы и остеокальцина. В адипоцитарной среда стимулировала экспрессию PPARg2 (peroxisone proliferator-activated receptor g2), LPL (lipoprotein lipase) и FABP4 (fatty acid binding protein 4). В хондрогенных условиях увеличивался уровень экспрессии S0X9 и генов, кодирующих синтез коллагена II типа и аггрекана.
Важно отметить, что исследователи не первыми выделили стволовые клетки из поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани. Первые работы датируются концом 90-х, началом 2000-х. Тогда, главным образом, были описаны стволовые клетки, обладающие гемопоэтичес-кими потенциями и способностью к миогенной дифференцировке [4—6]. Некоторые авторы рассматривали их в качестве предшественников сателлитных клеток, ком-митированных в рабдомиоцитарном направлении. В экспериментах на мышах Qu-Petersen с соавт. (2002) описали CD34+/Sca-1 +клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью и способные к дифференцировке в эндотелиальном и нейральном направлениях. A. Sacco (2008) с соавт. описали мышечные стволовые клетки (CD34+/integrin-—7+), не экспрессирующие Sca-1 и характеризующиеся высоким уровнем экспансии in vivo. Было показано, что при трансплантации в скелетную мышечную ткань, лишённую сателлитных клеток, они занимали их клеточные ниши, активно пролиферировали и дифференцировались в Рах7+ мононуклеары, участвующие в миогенезе. Однако ни в одной из множества противоречивых работ, касающихся получения разнообразных клеток-предшественниц из поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани, ранее не была выполнена подробная спецификация полученных культур.
Таким образом, L.J. Nesti с соавт. впервые в клиническом исследовании описали получение стволовых клеток из травмированной скелетной мышечной ткани, доказали их принадлежность к популяции ММСК за счет установления способности к адгезии к поверхности культуральной посуды, характерного иммунофенотипа и дифференцировки в трех ортодоксальных направлениях. Основным нерешённым вопросом остались источники появления ММСК в поврежденных мышцах. Потенциально возможны несколько вариантов, частично указанных авторами работы. Во-первых, ММСК могли мигрировать в область поражения непосредственно из костного мозга поврежденных костей. Во-вторых, ММСК могут быть привнесены из кровеносного русла, где установлено наличие соответствующих им по ряду морфофункциональных свойств циркулирующих предшественников соединительных тканей [7, 8]. В-третьих, ММСК в виде периваскулоцитов, в соответствии с теорией «мезенхимального резерва», могут сопровождать мелкие сосуды [9], которыми богата мышечная ткань. К тому же некоторые свойства ММСК описаны и для сателлитных клеток, как то адгезия к поверхности культурального пластика, остео- и адипогенные потенции [10, 11], что могло служить основой для непроизвольного включения их в состав выделенной популяции ММСК. Установление источников появления ММСК в мышечной ткани имеет важное практическое значение. Если исследуемая популяция присутствовала в тканях травмированной конечности до ранения, то неизбежно в использованном для их получения материале эти клетки подверглись воздействию повреждающих факторов огнестрельного или минно-взрывного оружия, следовательно, находились в состоянии т. н. «молекулярного сотрясения», способного вызывать повреждения генетического аппарата клетки и запускать апоптоз. В этой связи в будущем необходим дополнительный и детальный анализ биологии этих клеток.
Кроме того, остается не совсем ясным, как авторам удалось при получении тканевого материала в поздние сроки от ранения (7 сут.) избежать попадания в культуру элементов грануляционной ткани, безусловно, богатой стволовыми клеточными элементами. Впрочем, эти
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
h
детали не снижают общего значения работы, как основополагающей в новом направлении — клеточных технологиях в практике военно-полевой хирургии. В частности, Министерством Обороны США создан Институт Регенеративной Медицины Вооруженных Сил с целью разработки методов лечения солдат с повреждениями конечностей с помощью клеточных технологий. Возникновение этой программы обусловлено увеличением доли минно-взрывных поражений и ранений конечностей в условиях последних военных компаний армии США, что увеличило необходимость восстановления обширных
участков конечностей у пострадавших. За правительственный грант в 250 млн $ соперничают большое количество научных групп и лабораторий [12]. В этой связи, есть основания полагать, что работа Ш. с
соавт. также связана с участием в данной программе.
В любом случае, исследователи выявили принципиально новый источник получения ММСК в условиях тяжелого состояния пациента с травмами костно-суставной системы, объединяющий хирургию и клеточные технологии в единый инструмент оказания адекватной, комплексной медицинской помощи.
ЛИТЕРАТУРА:
1. da Silva L.M., Caplan A.I., Nardi N.B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells 2008; 26(9): 2287—99.
2. Александров B.H., Сергеев B.C. Влияние тяжелой политравмы на миграцию стволовых кроветворных клеток у мышей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD6; 2[41: 59—62.
3. Dominici М., Le Blanc К., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2DD6; 8(4): 315—7.
4. Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. PNAS 1999; 96(251: 14482—6.
5. Kawada H., Ogawa M. Bone marrow origin of hematopoietic progenitors and stem cells in murine muscle. Blood 2DD1; 98t7): 2008—13.
6. Seale P., Asakura A., Rudnicki M.A. The Potential of Muscle Stem Cells. Developmental Cell 2001; 1: 333-42.
7. Koerner J., Nesic D., Romero J.D. et al. Equine Peripheral Blood-Derived Progenitors in Comparison to Bone Marrow-Derived Mesenchymal
Stem Cells. Stem Cells 2006; 24(61: 1613-19.
8. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S., et al. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol. 2001; 153(51: 1133—40.
9. Maximow A.A. Liber undifferenziet Blutzellen und mesenchymalen keimlager im erwchsenen organismus. Klin. Wochenschr. 1926; 5C43): 2193-9.
10. Teboul L., Gaillard D., Staccini L. et al. Thiazolidinediones and fatty acids convert myogenic cells into adipose-like cells. J Biol. Chem. 1995; 270: 28183-7.
11. Lee J.Y., Qu-Petersen Z., Cao B. et al. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing of myogenic satellite cells. J. Cell Biol. 2000; 150(5): 1085-100.
12. Coombs A. Stem cells drafted for war on wounds. Nature Reports Stem Cells published online: 13 November 2008
13. Sacco A., Doyonnas R., Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456(72211: 502-6.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам: /Vest/ L.J., Jackson W.M., Shanti R.M. et al. Differentiation Potential of Multipotent Progenitor Cells Derived
from War-Traumatized Muscle Tissue. J. Bone Joint Surg. Am. 2008; 90:2390-8
Получение iPS клеток без векторной интеграции
Эмбриональные стволовые клетки (ЗСК) обладают уникальной способностью к дифференцировке в любые клетки организма, что делает их привлекательным биотехнологическим объектом как для изучения фундаментальных вопросов биологии развития, так и для использования в клинической практике и фармакологии. Центральная задача, стоящая перед исследователями, заключается в разработке технологии рутинного получения ЗСК или ЗСК-подобных плюрипотентных клеток без разрушения бластоцисты — их первичного источника, а также без использования клеток человека, количество которых ограничено (например овоцитов). До недавнего времени методики перепрограммирования дифференцированных клеток не могли в полной мере удовлетворять этим двум условиям, поскольку источником факторов, требуемых для перепрограммирования генома дифференцированной клетки, служила цитоплазма яйцеклеток либо других ЗСК [1]. Лишь благодаря обнаружению молекулярных факторов, ответственных за поддержание плюрипотентного статуса ЗСК (0сЬ4, Бох2, №под и др.), стала возможной направленная генетическая модификация дифференцированных клеток с целью перепрограммирования их генома и возврата к плюрипотент-ному состоянию. Плюрипотентные клетки, полученные из мышиных фибробластов в результате ретровирусной трансфекции четырех генов — 0й4, Бох2, с-Мус и К!!4, японские ученые Б. Уатапака и К. ТакаИазЫ назва-
ли индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (¡РБ-клетками) [2], уже неоднократно обсуждались [3, 4]. Такие ¡РБ-клетки, полученные из различных соматических клеток мышей и человека, по ряду принципиальных характеристик (эпигенетический статус, транскрипционный профиль, формирование тератом при трансплантации иммунодефицитным мышам, в случае мышиных ¡РБ-клеток — введение в бластоцисту с последующим образованием животных-«химер») сходны с ЗСК, полученных из бластоцист. Обнаружение феномена перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные как следствие относительно простых генетических модификаций стало одним из главных научных достижений 2007 г. [5] и получило широкий научный и общественный резонанс, хотя говорить об истинной ценности данной технологии для клинической практики пока рано. Одно из ключевых препятствий — использование вирусных векторов, интегрирующихся в клеточный геном, а также протоонкогенов в качестве трансгенов (с-Мус, К1!4), что может приводить к малигнизации ¡РБ-клеток.
За прошедшие два года были предложены модификации данной методики перепрограммирования (см. рис.). Во-первых, чтобы снизить риск онкотрансформации ¡РБ-клеток, протоонкогены с-Мус и К1!4 могут быть заменены на гены №под и Уп28 [6] либо можно ограничиться трансфекцией трех (0сЬ4, Бох2 и К№4) или
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, Ni 4, 2008
