CC BY
228
■ ИМИ!
Обзоры
Mill
Стволовые клетки в регенеративной терапии сердечных заболеваний: роль межклеточных взаимодействий
ЕЮ. Плотников*12, Д.Б. Зоров 2, Г.Т. Сухих1
1ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий, Москва
2 НИИ Физико-химической биологии им. АН. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Stem cells in regenerative therapy of cardiac pathology.
The role of intercellular interactions
E.Yu. Plotnikov *1-2, D.B. Zorov 2, G.T. Sukhikh1
1 VI Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology of Rosmedtechnologies. Moscow
3 AN. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Lomonosov Moscow State University
Заместительная регенеративная клеточная терапия представляет наиболее перспективный инновационный метод в борьбе с последствиями инфаркта миокарда и другими функциональными и структурными изменениями сердца. В качестве материала для клеточной трансплантации и регенерации миокарда наиболее широко используются эмбриональные стволовые и мезенхимальные стволовые клетки, а также некоторые другие типы стволовых и прогениторных клеток. Основная задача, возлагаемая на стволовые клетки — дифференцироваться в функционально активные кардиомиоциты и интегрироваться в ткань миокарда реципиента. Управление дифференцировкой стволовых клеток в миокарде идет за счет влияния микроокружения и прямой межклеточной сигнализации, которая регулирует направление дифференцировки. В настоящее время экспериментально подтверждены три основных типа взаимодействия стволовых/прогениторных клеток с кардиомиоцитами, в той или иной степени связанные с трансдифференцировкой. Это слияние клеток, образование межклеточных контактов классического типа (щелевые «дар» контакты) и недавно описанный тип взаимодействия — туннельные нанотрубочки. В обзоре рассмотрены данные по положительному влиянию стволовых и прогениторных клеток при заболеваниях сердца и роли межклеточных взаимодействий в реализации этих эффектов.
Ключевые слова: стволовые и прогениторные клетки, кардиомиоциты, туннельные нанотрубочки, инфаркт миокарда.
Regenerative cell therapy represents the most perspective innovative method in treatment of consequences of a heart attacks of a myocardium both other functional and structural changes of a heart tissue. Are most widely used as a material for cellular transplantation and myocardium regeneration embryonic and meshenchymal stem cells, and also some other types of stem and progenitor cells. The primary goal assigned to stem cells — to be differentiated to the functionally active cardiomyocytes and to be integrated into a myocardium tissue of the recipient. Management of a differentiation of stem cells goes in a myocardium at the expense of influence of a microenvironment and the direct intercellular signaling when cell-to-cell crosstalk between the neighboring cells regulates a differentiation direction. Now experimental acknowledgement was received by three basic types of interaction of stem/progenitor cells with cardiomyocytes, to some extent associated with a transdifferentiation. These are cell fusion, formation of intercellular contacts of gap-junction and recently found interaction type — tunneling nanotubes (TNTs). In the review we consider the data on positive effects of stem and progenitor cells in heart pathologies and a role of intercellular interactions in realization of these effects.
Key words: stem and progenitor cells, cardiomiocytes, tunneling nanotubes, myocardial infarction.
Введение
Клеточная терапия для регенерации и восстановления функций миокарда перешла в последнее время из области экспериментальных работ к клиническим испытаниям. На это направление лечения тяжелых сердечных заболеваний большие надежды возлагают как врачи, так и пациенты. Заболевания сердца и сосудов, прежде всего, инфаркт миокарда (ИМ), по-прежнему занимают ведущее место среди причин смерти больных в развитых странах. Проблема ишемических повреждений в случае сердца значительно усугубляется ограниченной способностью кардиомиоцитов к регенерации, из-за чего, как при остром инфаркте, так и при хронической ишемии происходит замещение функциональных клеток соединительной тканью, что приводит к изменению электрической проводимости и дисфункции миокарда.
* e-mail: [email protected]
Традиционные методы фармакологического лечения направлены на защиту и поддержание деятельности рабочего миокарда. Единственным способом радикального лечения остается применение тканевых трансплантатов сердца или сердечно-легочных комплексов. В мире ежегодно проводится 2,7^4,5 тыс. трансплантаций сердца и комплекса «сердце^пегкие» [1, 2]. Однако, такие операции очень травматичны, высок процент летальности, обязательна серьезная медикаментозная поддержка для предотвращения отторжения из-за иммунологической несовместимости, подходящий трансплантационный материал дефицитен, и очередь на такую операцию расписана вперёд на несколько лет, сокращая, тем самым, для многих шанс выжить. Поэтому заместительная регенеративная клеточная терапия представляется наиболее перспективным инновационным методом в борьбе
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
А
I I I I I I
Обзоры
с последствиями ИМ и другими функциональными и структурными изменениями миокарда.
Типы применяемых для терапии клеток
В качестве материала для клеточной трансплантации и регенерации миокарда наиболее широко используются эмбриональные стволовые и мезенхимальные стволовые клетки (ММСК). Эмбриональные стволовые клетки ИСК) представляют собой плюрипотентные клетки, полученные из клеток бластоцисты и самоподдержи-вающиеся в культуре, то есть обладающие высоким пролиферативным и клоногенным потенциалом. При этом они способны дифференцироваться практически в любые клетки организма. Первые линии мышиных ЭСК были получены в 1981 году М. Evans и М. Kaufman [3], человеческие ЗСК научились культивировать в 1998 г. J. Thomson и соавт. [4]. С тех пор ЗСК рассматриваются как средство регенеративной и заместительной клеточной терапии, в том числе и миокарда. Дифференцировать мышиные ЗСК в кардиомиоциты удалось в 1985 г. [5], однако только в 90-х годах XX в. начались широкие исследования способов направленной диффе-ренцировки ЗСК в клетки миокарда с целью их дальнейшего использования для оптимизации его регенерации. В 2001 г. удалось дифференцировать человеческие ЗСК в кардиомиоциты, обладающие специфическими структурными и функциональными характеристиками [6]. Такие кардиомиоциты, пересаженные в сердце свиньи, проявляли пейсмейкерную активность и формировали устойчивые связи с клетками миокарда реципиента [7]. Тем не менее, по причинам, описанным ниже, опыт применения ЗСК для экспериментального лечения повреждений миокарда остается пока весьма незначительным. В частности, показано, что введение крысам с инфарктом миокарда ЗСК в зону инфаркта или коронарную артерию приводило к уменьшению очага поражения и улучшению сократительной функции желудочка [8, 9]. Через несколько недель после введения мышиные ЗСК превращались в кардиомиоциты, сходные с клетками реципиента, при этом не наблюдалось иммунного отторжения.
Таким образом, ЗСК представляются весьма перспективным объектом для терапии сердечных заболеваний, однако на пути их активного применения стоит ряд серьезных проблем. Помимо этических аспектов при их получении из эмбриона, проблему представляет высокая туморогенность ЗСК при введении в организм; направление их дифференцировки часто малопредсказуемо, что приводит к высокой вероятности образования тератом
[10]. Кроме того, стандартные методы работы с ЗСК предполагают стадию культивирования на подложке из мышиных эмбриональных фибробластов, что ведет к возможности контаминации клеток.
Очевидно, наиболее перспективны ЗСК в качестве исходного материала для дифференцировки in vitro в кардиомиоциты, которые затем могут использоваться для трансплантаций. Об этом говорят и недавние исследования по введению овцам с постинфарктной сердечной недостаточностью мышиных ЗСК, коммитиро-ванных по пути дифференцировки в кардиомиоциты
[11]. Такие частично дифференцированные ЗСК, введенные в зону очага инфаркта или по его периферии, вызывали регенерацию миокарда и восстановление функции, причем как при наличии, так и в отсутствии иммуносупрессорной терапии. Аналогичные данные были получены при введении человеческих ЗСК, дифференцированных в кардиомиоциты, крысам с аритмией,
где эти клетки формировали участок человеческого миокарда [12].
Мультипотентные мезенхимальные
стромальные клетки
Мультипотентые мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) представляют другой активно изучаемый тип стволовых клеток, перспективных для восстановления поврежденной ткани миокарда. Их исследования ведутся с 1 966 года, когда ММСК были впервые обнаружены в костном мозге [13]. Несмотря на то, что ММСК составляют минорную фракцию (около 0,01%) стволовых клеток костного мозга [14] по сравнению с гемопоэти-ческими стволовыми клетками (ГСК), они играют огромную роль в репаративных процессах in vivo и оказались чрезвычайно востребованы для клеточных технологий. До изучения фенотипических особенностей ММСК выделялись и описывались как культура адгезивных стро-мальных клеток костного мозга, характеризующихся высокой пролиферацией и мультипотентностью. Затем ММСК были охарактеризованы по многим маркерным белкам (CD29, CD44, CD105, Sca-1 и др.), и появилась возможность выделять их с помощью FACS [ 15—17] и MACS [17] технологий.
В 1999 г. была показана возможность дифференцировки ММСК в кардиомиоциты in vitro [18], а в 2001 г. дифференцировка костномозговых клеток в кардиомиоциты была показана in vivo при трансплантации в сердце после инфаркта [19]. Однако, при этом не была исключена возможность возникновения кардиомиоцитов из ГСК, которые также присутствовали в клеточной суспензии. В дальнейшем возможность дифференцировки в кардиомиоциты подвергалась сомнениям [20]; хотя единого мнения по этому поводу так и не сформировано.
С другой стороны, мультипотентность ММСК костного мозга и их способность дифференцироваться в кардиомиоциты, в том числе при сокультивировании, были неоднократно доказаны [21 —23]. Проблема заключается в том, что ММСК составляют очень незначительную часть клеток костного мозга, поэтому необходимо использовать методики фенотипического выделения и наращивания клеток in vitro, чтобы получить достаточные количества ММСК для их реального клинического применения. Поэтому в большинстве клинических исследований для введения пациентам с инфарктом миокарда используются тотальные препараты костного мозга, содержащие и ММСК, и ГСК, и эндотелиальные прогени-торные клетки [24^26]. В результате сложно соотнести положительный эффект (часто весьма значительный) таких трансплантаций с воздействием какого-то определенного типа стволовых клеток. В то же время, имеются свидетельства по улучшению сердечных функций при введении чистых культур ММСК [27, 28].
Несмотря на перечисленные сложности, ММСК считаются чрезвычайно перспективным объектом клеточной терапии, и именно на их всестороннее изучение направлена значительная часть клинических и экспериментальных исследований, что обусловлено рядом обстоятельств. Во-первых, из всех соматических стволовых клеток именно ММСК демонстрируют в экспериментах потенции к дифференцировке в клетки всех трех зародышевых листков: энтодермы, мезодермы и эктодермы [29—31 ], хотя ортодоксальными направлениями дифференцировки ММСК считаются клетки мезенхимного происхождения (остеоциты, адипоциты, хондро-циты, лейомиоциты, теноциты). Во-вторых, фенотип поверхностных антигенов ММСК характеризуется очень
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■ ИМИ!
Обзоры
■тп
низкой иммуногенностью [32, 33]. Кроме того, имеются свидетельства иммуномодуляторных эффектов ММСК на организм реципиента [33]. Благодаря этим свойствам пересадка даже аллогенных клеток приводит к высокой степени включения их в ткани реципиента и длительному сохранению в них [34—36]. В то же время для ММСК не было описано случаев реакции «трансплантат против хозяина», что имеет место при пересадках костного мозга из-за образования иммуноком-петентных клеток, не толерантных к тканям реципиента.
Наконец, ММСК могут быть получены не только из костного мозга, но и из жировой ткани или пуповинной крови [37, 38], а также плаценты [39], сосудов [40], тимуса [41], амниотической жидкости [42]. В большинстве случаев эти способы получения ММСК не столь эффективны, как выделение из костного мозга, однако такие клетки обладают всеми фенотипическими характеристиками ММСК и мультипотентностью. Исходя из сходства фенотипа и дифференцировочного потенциала ММСК из различных источников (список которых с каждым годом все пополняется) можно предполагать, что все эти клетки потенциально могут использоваться в регенеративной терапии кардиологических заболеваний, что, однако, требует отдельных углубленных исследований.
Стволовые клетки сердца (СКС)
В ряде недавних исследований было описано существование в миокарде «взрослых» млекопитающих популяции собственных стволовых клеток. До этого существование стволовых клеток сердца подвергалось сомнениям, поскольку сердечная мышечная ткань считалась полностью постмитотической тканью. Однако в ряде работ было описано присутствие в сердце пула делящихся клеток [43, 44], которые были охарактеризованы по фенотипическим признакам и мультипотентнос-ти как стволовые. Эти клетки могут дифференцироваться в гладкомышечные, эндотелиальные клетки и собственно кардиомиоциты, а трансплантация их мышам с инфарктом миокарда приводит к восстановлению органа. Недавно были выделены стволовые клетки миокарда взрослых мышей, а затем и человека [45]. Клетки экспрессировали маркеры стволовых клеток c-kit, Sea и MDR, обладали высокой пролиферативной активностью и были способны дифференцироваться в кардиомиоциты in vivo и in vitro [46]. Появились первые данные о возможности выделения этих клеток и наращивания их in vitro, при этом не теряется их способность дифференцироваться, что делает возможным использование их в будущем для терапии инфаркта миокарда.
Взаимодействие стволовых/прогениторных клеток
с кардиомиоцитами
Итак, на сегодняшний день основные кандидаты для регенеративной клеточной терапии миокарда определены — это ЗСК, ММСК и СКС. При этом применение ЗСК и СКС видится более перспективным [47], однако, их внедрение в клиническую практику пока вызывает множество сложностей. В то же время, ММСК уже прошли многие стадии доклинических испытаний и по ним накоплен достаточно серьезный экспериментальный и клинический опыт. Поэтому в силу дисбаланса в массиве экспериментальных данных механизмы взаимодействия клеточного трансплантата с миокардом рассматриваются далее в основном на примере ММСК.
Что же лежит в основе нормализации сердечной функции при введении стволовых клеток? Очевидно, что
в первую очередь — это образование новых функциональных элементов миокарда, кардиомиоцитов, замещающих клетки, погибшие в результате инфаркта. Таким образом, основная задача, возлагаемая на стволовые клетки — дифференцироваться в функционально активные кардиомиоциты и интегрироваться в миокард реципиента. При этом процессы дифференцировки должны жестко регулироваться в соответствии с тканевой нишей, то есть стволовые клетки должны превращаться именно в кардиомиоциты и именно в миокарде. В противном случае очень вероятно возникновение тератом или очагов несоответствующей органу ткани.
Из этого следует, что управление дифференциров-кой стволовой клетки идет в миокарде за счет влияния микроокружения и прямой межклеточной сигнализации, когда соседние клетки регулируют направление дифференцировки за счет межклеточной сигнализации.
В этой связи, в последнее время все большее количество исследований посвящено взаимодействию стволовых и прогениторных клеток с кардиомиоцитами через прямые контакты клеточных мембран, обмен цитоплазматическими сигналами и слияние клеток. Очевидно, что для полноценной регенерации миокарда стволовые клетки должны не просто дифференцироваться в кардиомиоциты, а еще и полностью интегрироваться в миокард с образованием соответствующих электрических и цитоплазматических связей. Иначе даже дифференцировавшиеся в кардиомиоциты клетки, не включившись в единый функциональный синцитий сердечной мышцы, не только не улучшат функционирование поврежденного миокарда, но могут стать источниками аритмий [48^ 50], угрожающих жизни реципиента.
Исходя из этого, логично предположить, что процессы дифференцировки стволовых/прогениторных клеток идут параллельно с образованием устойчивых связей с кардиомиоцитами хозяина, более того, именно образование таких контактов может служить сигналом для начала специализации недифференцированной клетки. Косвенно это подтверждается рядом наблюдений за ми-областами, которые, будучи пересаженными в сердце, могут оставаться несопряженными с кардиомиоцитами реципиента, несмотря на наличие всех фенотипических признаков сократительной клетки [51].
В настоящее время экспериментальное подтверждение получили три основных типа взаимодействия стволовых/прогениторных клеток с кардиомиоцитами, в той или иной степени связанные с трансдифференциров-кой. Это слияние клеток, образование межклеточных контактов классического типа (щелевые «дар» контакты) и недавно открытый тип взаимодействия — туннельные нанотрубочки.
Щелевые контакты
Щелевые контакты являются основным типом взаимодействия кардиомиоцитов в миокарде. Именно за счет щелевых контактов миоциты образуют единую электрически сопряженную сеть в отделах сердца, любое нарушение в которой приводит к возникновению аритмий вплоть до фибрилляции. Нарушение проводимости в миокарде является главным негативным последствием ишемических поражений и формирования рубцовой ткани после инфаркта, и, следовательно, восстановление сопряженности кардиомиоцитов является доминирующей целью регенеративной клеточной терапии. Однако, на сегодняшний момент множество исследований показывает, что клеточные трансплантации могут сами провоцировать аритмии. Одним из предполагаемых механизмов
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
Обзоры
этого явления считают как раз недостаточное образование щелевых контактов между трансплантированными клетками и кардиомиоцитами реципиента.
Основным структурным белком щелевых контактов в миокарде является коннексин 43 (Сх43), экспрессия и сборка которого сложно регулируются в зависимости от локализации в миокарде и функционального состояния клетки. Показано, что повышение Сх43 за счет овер-экспрессии снижает аритмию в системе, моделирующей трансплантацию скелетных миобластов в миокард [52]. Коннексин 43 напрямую усиливает межклеточную коммуникацию между миобластами и взрослыми крысиными кардиомиоцитами, при этом увеличивается количество щелевых контактов и опосредованная ими проводимость между клетками [53]. Интересно, что скелетные миобласты сами по себе обладают определенным уровнем экспрессии Сх43 [54], специфичного для кардиомиоцитов, однако после прекращения деления и дифференцировки миобластов в мышечные трубочки, этот белок исчезает. Таким образом, дифференцировавшись, скелетный миобласт может терять функциональную связь с клетками миокарда [55—57]. Впрочем, возможно, такая потеря экспрессии Сх43 и уменьшение числа щелевых контактов не является обязательным событием, а происходит из-за стресса при трансплантации, повреждения клеток вокруг трансплантата и т.д. В частности, показано, что сокультивирование с кардиомиоцитами усиливает экспрессию Сх43 в миобластах [58]. При этом между кардиомиоцитами и миобластами образуются функциональные контакты, появляется электропроводимость и возможен обмен различными медиаторами, включая Са2+ [57, 58].
Многих проблем, связанных с интеграцией в сердце таких достаточно специализированных клеток, как миобласты, можно избежать, используя стволовые клетки, поскольку они более пластичны и могут дифференцироваться в кардиомиоциты. Возможность формирования межклеточных контактов на основе Сх43 между кардиомиоцитами и различными типами стволовых клеток также была показана как in vivo, так и в моделях сокультивирования.
Например, ММСК способны связываться как друг с другом через Сх43 и Сх40, так и с другими сокультиви-руемыми клетками [59], в частности культивируемыми взрослыми кардиомиоцитами. В работе V. Valiunas и соавт. (2004) показано, что человеческие ММСК формируют гетеромерные каналы из двух типов коннек-синов с кардиомиоцитами собаки, причем эти контакты обеспечивают достаточное электрофизиологическое сопряжение клеток [59].
Более того, человеческие ММСК оказались способны восстанавливать проводимость между двумя отдельными полями культивируемых кардиомиоцитов [60]. В монослое сокращающихся неонатальных кардиомиоцитов крысы, физически разделенных на два поля и сокращающихся асинхронно, при добавлении ММСК восстанавливалась электрическая проводимость и сокращение синхронизировалось. Обнаружено, что ММСК, помещенные к двум группам кардиомиоцитов, образовывали функциональные щелевые контакты как между собой, так и с кардиомиоцитами. При этом через ММСК происходила передача импульса за счет ионных токов через коннексиновые каналы, хотя и более медленная, чем в кардиомиоцитах. Недавняя работа М. Gallo и соавт. (2007) подтверждает наличие щелевых контактов на основе Сх43 в совместной культуре ММСК и кардиомиоцитов, причем этот кардиоспецифичный коннексин
выявлялся как в контактах ММСК/ММСК, так и в контактах ММСК/кардиомиоцит [61 ]. При этом между клетками наблюдались потенциал-зависимые кальциевые сигналы, однако, сами ММСК не обладали способностью к сокращению, и в них не выявлялись миофибриллы. Таким образом, формирование щелевых контактов и электропроводимость между кардиомиоцитами и стволовы-ми/прогениторными клетками выявляются многими исследователями, однако дифференцировка стволовых клеток в кардиомиоциты зависит, вероятно, и от других механизмов взаимодействия, таких, как слияние клеток или образование нанотрубочек.
Слияние клеток
Слияние клеток, то есть объединение плазматических мембран и генетического материала, является распространенным событием в ходе развития и функционирования многоклеточного организма, начиная от процесса оплодотворения яйцеклетки до образования многоядерного синцития мышечной ткани. В последнее время появился ряд работ, демонстрирующих возможность слияния стволовых клеток с нейральными предшественниками [62, 63], гепатоцитами и кардиомиоцитами [64]. Трансплантированные прогениторные клетки сердца тоже не только дифференцируются в кардиомиоциты, но и сливаются с ними в сердце, возвращая им способность к пролиферации [44]. Более того, показана возможность спонтанного слияния неонатальных кардиомиоцитов с различными типами стволовых и прогениторных клеток: эндотелиальными клетками пуповинной вены (HUVEC), мезенхимальными и гемопоэтическими клетками костного мозга, эндотелиальными прогениторны-ми клетками [65]. При сокультивировании кардиомиоцитов in vitro с HUVEC или фибробластами сердца происходило их слияние с образованием гетерокарио-нов, в которых наблюдалась экспрессия как маркеров кардиомиоцитов, так и клетки-партнера. Однако затем фенотип кардиомиоцита начинал преобладать. При слиянии непролиферирующие кардиомиоциты возвращались в клеточный цикл и начинали экспрессировать Ki-67 — маркер пролиферирующих клеток [65].
Аналогичные данные получены при исследовании экспрессии мРНК кардиоспецифичного р-миозина в совместной культуре неонатальных крысиных кардиомиоцитов и человеческих мононуклеаров костного мозга [64]. Клетки исследовались методом ПЦР отдельно взятой клетки (single-cell PCR), что позволило отличать трансдифференцировку клеток от слияния. Было показано, что около 6% человеческих клеток экспрес-
р
на, то есть появление кардиофенотипа индуцировалось слиянием. Однако около 9% клеток экспрессировало р
истинная трансдифференцировка. Похожие данные получены на гемопоэтических клетках [66, 67]. В этих исследованиях появление кардиомиоцитов из стволовых клеток путем слияния было либо очень редким явлением [66], либо происходило наравне с истинной трансдифференцировкой, не связанной со слиянием [67].
Таким образом, несмотря на появление значительного числа исследований по слиянию стволовых клеток с кардиомиоцитами, этот механизм нельзя считать основным путем регенерации миокарда при клеточных трансплантациях, поскольку многие современные работы указывают на наличие дифференцировочной пластичности стволовых клеток, не основанной на слиянии.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
I I I I I I
■ I I I
Обзоры
Туннельные нанотрубочки
Помимо щелевых контактов, между соседними клетками возможен еще один тип коммуникации, основанный на образовании тонких мембранных каналов. Эти образования, описанные совсем недавно и названные туннельными нанотрубочками (ТНТ) [68], способны осуществлять передачу различных внутриклеточных компонентов [69], причем между клетками, расположенными достаточно далеко друг от друга, что отличает их от щелевых контактов, соединяющих клетки только при тесном соприкосновении мембранных поверхностей. Изначально описанные для клеток РС12 феохромоцито-мы [68], ТНТ затем были обнаружены в линиях клеток почки [68, 70], различных типах иммунных клеток [69, 71, 72] и в гемопоэтических стволовых клетках [73]. Кроме того, ТНТ были обнаружены между эндотелиальными прогениторными клетками и кардиомиоцитами [74]. Мы также показали образование ТНТ между кардиомиоцитами и ММСК [75].
Диаметр этих структур составляет от 100 до 800 нм, а длина — до 100 мкм [76]. Формирующиеся ТНТ сначала напоминают филоподии, но когда достигают соседней клетки и сливаются с ее мембраной, то образуют прямые неветвящиеся нити, несвязанные с субстратом. В их составе находят Р-актин и моторные белки [68, 76], что говорит о возможности активного транспорта по этим структурам. Было показано движение по ТНТ неких мембранных везикул [68] лизосомаль-но/эндосомальной природы, а также крупных органелл, в частности, митохондрий [74]. В обоих описанных случаях транспорт происходит в одном направлении. Возможно, именно клетки, формирующие ТНТ, являются донорами органелл. Транспорт органелл и компонентов цитоплазмы через ТНТ говорит о возможности передачи таким путем информации из клетки в клетку. Более того, в норме эндосомы являются одним из основных путей передачи сигнальных молекул с поверхности клетки, а после передачи по ТНТ эндосомальные структуры могут сливаться с везикулярным аппаратом клетки-реципиента [68] и таким образом передавать сигналы. Помимо передачи мембранных структур по ТНТ, их образование обеспечивает наличие цитоплазматических мостиков между связанными клетками, по которым могут передаваться сигнальные молекулы и низкомолекулярные компоненты цитоплазмы. Кроме того, образуется единое цитоплазматическое пространство, объединяющее клетки и обеспечивающее согласование ионных токов и электровозбудимости.
В контексте клеточной терапии повреждений миокарда ТНТ представляют интерес с нескольких позиций. Во-первых, наряду с плотными межклеточными контактами с участием коннексинов, нанотрубочки могут способствовать интеграции донорских стволовых и прогениторных клеток в сердечную мышцу, восстановлению электропроводимости и синхронизации сократительной деятельности кардиомиоцитов реципиента и трансплан-
тированных клеток. Косвенно в пользу такого механизма говорят исследования системы сокультивируемых эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) и кардиомиоцитов, в которых, с одной стороны, показано образование ТНТ [74], а с другой стороны — наблюдаются синхронные осцилляции цитоплазматического Са2+ в объединенных клетках [77]. При совместном культивировании кардиомиоцитов и ЭПК с образованием между ними контактов в ЭПК появляются периодические колебания концентрации ионов кальция одновременно с такими же колебаниями в сокращающихся кардиомиоцитах. Хотя эти эксперименты касаются скорее объединения клеток щелевыми контактами, нельзя исключать участие и нанотрубочек в передаче ионных токов между клетками.
С другой стороны, образование нанотрубочек и транспорт цитоплазматической информации, будь то митохондрии или белковые компоненты цитозоля, коррелируют с направленной дифференцировкой ЭПК [74], или ММСК [63] в кардиомиоциты. Таким образом, ТНТ могут являться важным звеном регуляции процессов развития и дифференцировки клеток как при эмбриогенезе [78], так и в постнатальном развитии [79] и, в частности, дифференцировки стволовых/прогениторных клеток в кардиомиоциты при клеточных трансплантациях.
Заключение
Регенеративная клеточная трансплантация представляет активно развивающееся направление медицинской биотехнологии, чрезвычайно перспективное для лечения повреждений миокарда. Все большее количество исследований подтверждает высокий терапевтический потенциал различных типов стволовых и прогениторных клеток при ишемическом повреждении миокарда. Хотя на сегодняшний день из многих типов клеток сложно выделить идеального кандидата для клинических трансплантаций, уже ясны основные механизмы клеточных взаимодействий, определяющие эффективность подобной терапии. Очевидно, одним из основных условий является способность клеток дифференцироваться в функциональные кардиомиоциты, что может обеспечиваться либо дифференцировочным потенциалом используемых клеток, либо использованием предшественников сократительных клеток (миобластов, кардиомиоблас-тов). Однако не менее важной представляется необходимость образования функциональных контактов между клетками миокарда и донорскими клетками. Именно электрическая и сигнальная сопряженность клеток является залогом улучшения функций сердечной мышцы, восстановления проводимости и отсутствия аритмий после трансплантации. Наиболее важными типами межклеточных взаимодействий являются плотные контакты на основе коннексина 43 и контакты на основе нанотрубочек. Интерес к такого рода взаимодействиям обусловлен не только их необходимостью для интеграции кардиомиоцитов, но и их возможной ролью в регуляции направления дифференцировки клеток.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Taylor D.O., Edwards L.B., Boucek М.М. et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-third official adult heart transplantation report-2006. J. Heart Lung Transplant. 2006; 25: 869-79.
Notes: CORPORATE NAME: International Society for Heart and Lung Transplantation
2. Trulock E.P., Edwards L.B., Taylor D.O. et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-third official adult lung and heart-lung transplantation report-2006. J. Heart Lung Transplant. 2006; 25: 880-92.
Notes: CORPORATE NAME: International Society for Heart and Lung Transplantation
3. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292: 154—6.
4. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145—7.
5. Doetschman T.C., Eistetter H., Katz M. et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J. Embryol. Exp. Morphol. 1985; 87: 27-45.
6. Kehat I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. et al. Human embryonic
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
Обзоры
stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J. Clin. Invest. 2001; 108: 407—14.
7. Kehat I., Khimovich L., Caspi 0. et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 1282-9.
8. Min J.Y., Yang Y., Converse K.L. et al. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats. J. Appl. Physiol. 2002; 92: 288-96.
9. Hodgson D.M., Behfar A., Zingman L.V. et al. Stable benefit of embryonic stem cell therapy in myocardial infarction. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004; 287: H471—9.
10. Gruen L., Grabel L. Concise review: scientific and ethical roadblocks to human embryonic stem cell therapy. Stem Cells 2006; 24: 2162—9.
11. Menard C., Hagege A.A., Agbulut 0. et al. Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study. Lancet 2005; 366: 1005—12.
12. Laflamme M.A., Gold J., Xu C. et al. Formation of human myocardium in the rat heart from human embryonic stem cells. Am. J. Pathol. 2005; 167: 663-71.
13. Friedenstein A.J., Piatetzky-Shapiro 1.1., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J. Embryol. Exp. Morphol. 1966; 16: 381-90.
14. PittengerM.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143—7.
15. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation. Differentiation 2004; 72: 319—26.
16.Gnecchi M., Melo L.G. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium. Methods Mol. Biol. 2009; 482: 281-94.
17. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M. et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy 2004; 6: 372-9.
18. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest. 1999; 103: 697-705.
19. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701—5.
20. Murry C.E., Soonpaa M.H., Reinecke H. et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664—8.
21. Yoon J., Shim W.J., Ro Y.M., Lim D.S. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes by direct cell-to-cell contact with neonatal cardiomyocyte but not adult cardiomyocytes. Ann. Hematol. 2005; 84: 715-21.
22. Fukuda K., Fujita J. Mesenchymal, but not hematopoietic, stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction in mice. Kidney Int. 2005; 68: 1940—3.
23. Toma C., Pittenger M.F., Cahill K.S. et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation 2002; 105: 93—8.
24. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913—8.
25. Schachinger V., Assmus B., Britten M.B. et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J. Am. Coll. Cardiol. 2004; 44: 1690-9.
26. Britten M.B., Abolmaali N.D., Assmus B. et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction [TOPCARE-AMI]: mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation 2003; 108: 2212-8.
27. Miyahara Y., Nagaya N.. Kataoka M. et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat. Med. 2006; 12: 459—65.
28. Zhang S., Jia Z., Ge J. et al. Purified human bone marrow multipotent mesenchymal stem cells regenerate infarcted myocardium in experimental rats. Cell Transplant. 2005; 14: 787—98.
29. Phinney D.G., Prockop D.J. Concise review: mesenchymal stem/ multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair—current views. Stem Cells 2007; 25: 2896—902.
30. Spyridonidis A., Zeiser R., Folio M. et al. Stem cell plasticity: the debate begins to clarify. Stem Cell Rev. 2005; 1: 37—43.
31. Herzog E.L., Chai L., Krause D.S. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood 2003; 102: 3483-93.
32. Devine S.M., Peter S., Martin B.J. et al. Mesenchymal stem cells: stealth and suppression. Cancer J. 2001; 7 Suppl 2: S76—82.
33. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Sci. 2003; 10: 228—41.
34. Krampera M., Glennie S., Dyson J. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 2003; 101: 3722—9.
35. Liechty K.W., MacKenzie T.C., Shaaban A.F. et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat. Med. 2000; 6: 1282-6.
36. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ. Res. 2004; 95: 9—20.
37. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006; 24: 1294-301.
38. Montesinos J., Flores-Figueroa E., Castillo-Medina S. et al. Human mesenchymal stromal cells from adult and neonatal sources: comparative analysis of their morphology, immunophenotype, differentiation patterns and neural protein expression. Cytotherapy 2009; 16:1—14.
39. Miao Z., Jin J., Chen L. et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta: comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Biol. Int. 2006; 30: 681-7.
40. Covas D.T., Panepucci R.A., Fontes A.M. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146 1 perivascular cells and fibroblasts. Exp. Hematol. 2008; 36: 642—54.
41.Musina R.A., Bekchanova E.S., Belyavskii A.V., Sukhikh G.T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bull. Exp. Biol. Med. 2006; 141: 147—51.
42. Nadri S., Soleimani M. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from murine bone marrow and amniotic fluid. Cytotherapy 2007; 9: 729-37.
43. Beltrami A.P., Urbanek K., Kajstura J. et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 1750-7.
44. Oh H., Bradfute S.B., Gallardo T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 12313-8.
45. Messina E., De Angelis L., Frati G. et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ. Res. 2004; 95: 911-21.
46. Matsuura K., Nagai T., Nishigaki N. et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 2004; 279: 11384-91.
47. Wang Q.D., Sjoquist P.O. Myocardial regeneration with stem cells: pharmacological possibilities for efficacy enhancement. Pharmacol. Res. 2006; 53: 331-40.
48. Smits P.C. Myocardial repair with autologous skeletal myoblasts: a review of the clinical studies and problems. Minerva Cardioangiol. 2004; 52: 525-35.
49. Chang M.G., Tung L., Sekar R.B. et al. Proarrhythmic potential of mesenchymal stem cell transplantation revealed in an in vitro coculture model. Circulation 2006; 113: 1832—41.
50. Shang L.L., Dudley S.C. Jr, Pfahnl A.E. Analysis of arrhythmic potential of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Mol. Biol. 2006; 330: 221-31.
51. Hagege A.A., Carrion C., Menasche P. et al. Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemic cardiomyopathy. Lancet 2003; 361: 491—2.
52. Abraham M.R., Henrikson C.A., Tung L. et al. Antiarrhythmic engineering of skeletal myoblasts for cardiac transplantation. Circ. Res. 2005; 97: 159-67.
53. Stagg M.A., Coppen S.R., Suzuki K. et al. Evaluation of frequency, type, and function of gap junctions between skeletal myoblasts overexpressing connexin43 and cardiomyocytes: relevance to cell transplantation. FASEB J. 2006; 20: 744—6.
54. Balogh S., Naus C.C., Merrifield P.A. Expression of gap junctions in cultured rat L6 cells during myogenesis. Dev. Biol. 1993; 155: 351—60.
55. Leobon B., Garcin I., Menasche P. et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2003; 100: 7808-11.
56. Reinecke H., MacDonald G.H., Hauschka S.D., Murry C.E. Electromechanical coupling between skeletal and cardiac muscle. Implications for infarct repair. J. Cell Biol. 2000; 149: 731—40.
57. Lo C.W. Genes, gene knockouts, and mutations in the analysis of gap junctions. Dev. Genet. 1999; 24: 1—4.
58. Formigli L., Francini F., Tani A. et al. Morphofunctional integration between skeletal myoblasts and adult cardiomyocytes in coculture is favored by direct cell-cell contacts and relaxin treatment. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005; 288: C795-804.
59. Valiunas V., Doronin S., Valiuniene L. et al. Human mesenchymal stem cells make cardiac connexins and form functional gap junctions. J. Physiol. 2004; 555: 617—26.
60. Beeres S.L., Atsma D.E., van der Laarse A. et al. Human adult bone marrow mesenchymal stem cells repair experimental conduction block in rat cardiomyocyte cultures. J. Am. Coll. Cardiol. 2005; 46: 1943—52.
61. Gallo M.P., Ramella R., Alloatti G. et al. Limited plasticity of mesenchymal stem cells cocultured with adult cardiomyocytes. J. Cell. Biochem. 2007; 100: 86-99.
62. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J.M. et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 2003; 425: 968—73.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
Обзоры
63. Vassilopoulos G., Wang P.R., Russell D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. Nature 2003; 422: 901—4.
64. Garbade J., Schubert A., Rastan A.J. et al. Fusion of bone marrow-derived stem cells with cardiomyocytes in a heterologous in vitro model. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005; 28: 685—91.
65. Matsuura K., Wada FI., Nagai T. et al. Cardiomyocytes fuse with surrounding noncardiomyocytes and reenter the cell cycle. J. Cell Biol. 2004; 167: 351-63.
66. Nygren J.M., Jovinge S., Breitbach M. et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 2004; 10: 494—501.
67. Zhang S., Wang D., Estrov Z. et al. Both cell fusion and transdifferentiation account for the transformation of human peripheral blood CD34-positive cells into cardiomyocytes in vivo. Circulation 2004; 110: 3803-7.
68. Rustom A., Saffrich R., Markovic I. et al. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science 2004; 303: 1007—10.
69. Onfelt B., Nedvetzki S., Yanagi K., Davis D.M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. J. Immunol. 2004; 173: 1511—3.
70. Onfelt B., Davis D.M. Can membrane nanotubes facilitate communication between immune cells? Biochem. Soc. Trans. 2004; 32: 676-8.
71. Onfelt B., Nedvetzki S., Benninger R.K. et al. Structurally distinct membrane nanotubes between human macrophages support long-distance vesicular traffic or surfing of bacteria. J. Immunol. 2006; 177: 8476—83.
72. Galkina S.I., Molotkovsky J.G., Ullrich V., Sud'ina G.F. Scanning electron microscopy study of neutrophil membrane tubulovesicular extensions [cytonemes] and their role in anchoring, aggregation and phagocytosis. The effect of nitric oxide. Exp. Cell. Res. 2005; 304: 620—9.
73. Freund D., Bauer N.. Boxberger S. et al. Polarization of human hematopoietic progenitors during contact with multipotent mesenchymal stromal cells: effects on proliferation and clonogenicity. Stem Cells Dev. 2006; 15: 815-29.
74. Koyanagi M., Brandes R.P., Haendeler J., ZeiherA.M., Dimmeler
S.: Cell-to-cell connection of endothelial progenitor cells with cardiac myocytes by nanotubes: a novel mechanism for cell fate changes? Circ. Res. 2005; 96: 1039-41.
75. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Vasileva A.K. et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J. Cell. Mol. Med. 2008; 12: 1622-31.
76. GerdesH.H., Bukoreshtliev N.V., BarrosoJ.F. Tunneling nanotubes: A new route for the exchange of components between animal cells. FEBS Lett. 2007; 581: 2194-201.
77. Badorff C., Brandes R.P., Popp R. et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. Circulation 2003; 107: 1024—32.
78. Demontis F. Nanotubes make big science. PLoS Biol. 2004; 2: E215
79. Guo G.Q., Zheng G.C. Hypotheses for the functions of intercellular bridges in male germ cell development and its cellular mechanisms. J. Theor. Biol. 2004; 229: 139-46.
Поступила 10,12,2008
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
А
