CC BY
34
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
h
детали не снижают общего значения работы, как основополагающей в новом направлении — клеточных технологиях в практике военно-полевой хирургии. В частности, Министерством Обороны США создан Институт Регенеративной Медицины Вооруженных Сил с целью разработки методов лечения солдат с повреждениями конечностей с помощью клеточных технологий. Возникновение этой программы обусловлено увеличением доли минно-взрывных поражений и ранений конечностей в условиях последних военных компаний армии США, что увеличило необходимость восстановления обширных
участков конечностей у пострадавших. За правительственный грант в 250 млн $ соперничают большое количество научных групп и лабораторий [12]. В этой связи, есть основания полагать, что работа Ш. №зУ с соавт. также связана с участием в данной программе.
В любом случае, исследователи выявили принципиально новый источник получения ММСК в условиях тяжелого состояния пациента с травмами костно-суставной системы, объединяющий хирургию и клеточные технологии в единый инструмент оказания адекватной, комплексной медицинской помощи.
ЛИТЕРАТУРА:
1. da Silva L.M., Caplan A.I., Nardi N.B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells 2008; 26C9): 2287—99.
2. Александров B.H., Сергеев B.C. Влияние тяжелой политравмы на миграцию стволовых кроветворных клеток у мышей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD6; 2[41: 59—62.
3. Dominici М., Le Blanc К., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2DD6; 8[4): 315—7.
4. Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. PNAS 1999; 96C25): 14482—6.
5. Kawada H., Ogawa M. Bone marrow origin of hematopoietic progenitors and stem cells in murine muscle. Blood 2DD1; 98C7): 2008—13.
6. Seale P., Asakura A., Rudnicki M.A. The Potential of Muscle Stem Cells. Developmental Cell 2001; 1: 333-42.
7. Koerner J., Nesic D., Romero J.D. et al. Equine Peripheral Blood-Derived Progenitors in Comparison to Bone Marrow-Derived Mesenchymal
Stem Cells. Stem Cells 2006; 24(61: 1613-19.
8. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S., et al. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol. 2001; 153C5]: 1133—40.
9. Maximow A.A. Liber undifferenziet Blutzellen und mesenchymalen keimlager im erwchsenen organismus. Klin. Wochenschr. 1926; 5t43]; 2193-9.
10. Teboul L., Gaillard D., Staccini L. et al. Thiazolidinediones and fatty acids convert myogenic cells into adipose-like cells. J Biol. Chem. 1995; 270; 28183-7.
11. Lee J.Y., Qu-Petersen Z., Cao B. et al. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing of myogenic satellite cells. J. Cell Biol. 2000; 150(51: 1085-100.
12. Coombs A. Stem cells drafted for war on wounds. Nature Reports Stem Cells published online: 13 November 2008
13. Sacco A., Doyonnas R., Kraft P. et al. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456(72211: 502-6.
Подготовил И.Я. База
По материалам: /Vest/ L.J., Jackson W.M., Shanti R.M. et al. Differentiation Potential of Multipotent Progenitor Cells Derived
from War-Traumatized Muscle Tissue, J, Bone Joint Surg, Am. 2008; 90:2390-8
Получение iPS клеток без векторной интеграции
Эмбриональные стволовые клетки (ЗСК) обладают уникальной способностью к дифференцировке в любые клетки организма, что делает их привлекательным биотехнологическим объектом как для изучения фундаментальных вопросов биологии развития, так и для использования в клинической практике и фармакологии. Центральная задача, стоящая перед исследователями, заключается в разработке технологии рутинного получения ЭСК или ЗСК-подобных плюрипотентных клеток без разрушения бластоцисты — их первичного источника, а также без использования клеток человека, количество которых ограничено (например овоцитов). До недавнего времени методики перепрограммирования дифференцированных клеток не могли в полной мере удовлетворять этим двум условиям, поскольку источником факторов, требуемых для перепрограммирования генома дифференцированной клетки, служила цитоплазма яйцеклеток либо других ЭСК [1]. Лишь благодаря обнаружению молекулярных факторов, ответственных за поддержание плюрипотентного статуса ЭСК (0сЬ4, Бох2, №под и др.), стала возможной направленная генетическая модификация дифференцированных клеток с целью перепрограммирования их генома и возврата к плюрипотент-ному состоянию. Плюрипотентные клетки, полученные из мышиных фибробластов в результате ретровирусной трансфекции четырех генов — 0й4, Бох2, с-Мус и К!!4, японские ученые Б. Уатапака и К. ТакаИазЫ назва-
ли индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками ПРБ-клетками) [2], уже неоднократно обсуждались [3, 4]. Такие !РБ-клетки, полученные из различных соматических клеток мышей и человека, по ряду принципиальных характеристик (эпигенетический статус, транскрипционный профиль, формирование тератом при трансплантации иммунодефицитным мышам, в случае мышиных !РБ-клеток — введение в бластоцисту с последующим образованием животных-«химер») сходны с ЗСК, полученных из бластоцист. Обнаружение феномена перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные как следствие относительно простых генетических модификаций стало одним из главных научных достижений 2007 г. [5] и получило широкий научный и общественный резонанс, хотя говорить об истинной ценности данной технологии для клинической практики пока рано. Одно из ключевых препятствий — использование вирусных векторов, интегрирующихся в клеточный геном, а также протоонкогенов в качестве трансгенов (с-Мус, КМ), что может приводить к малигнизации !РБ-клеток.
За прошедшие два года были предложены модификации данной методики перепрограммирования (см. рис.). Во-первых, чтобы снизить риск онкотрансформации !РБ-клеток, протоонкогены с-Мус и К1!4 могут быть заменены на гены №под и Уп28 [6] либо можно ограничиться трансфекцией трех (0сЬ4, Бох2 и К№4) или
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
I I I I I I
Новости клеточных технологий
даже двух (0сЛ4, Бох2) генов плюрипотентности [7, 8]. Во-вторых, эффективность процедуры перепрограммирования, исходно составлявшая около 0,01 % (10^20 колоний !РБ-клеток на 100 тыс фибробластов), может быть повышена на порядок за счет совместной трансдукции обоих предложенных «квартетов» генов, т. е. уже шести генов — 0сЬ4, Бох2, с-Мус, КН4, №под и Уп28 [9]. Аналогичное по уровню увеличение выхода колоний !РБ-кле-ток наблюдается при дополнительной трансфекции генов теломеразы ТЕРТ и большого Т-антигена вируса БУ4 [10].
Тем не менее, проблема использования вирусных векторов, интегрирующихся в клеточный геном, служит основной причиной опасений, связанных со степенью надежности и безопасности применения перепрограммированных !РБ-клеток в терапии [11]. Интеграция вектора — неконтролируемый процесс, который ассоциирован с риском развития новообразований вследствие спонтанной реактивации вирусных трансгенов, а также вследствие встраивания вектора вблизи потенциальных протоонкогенов. Кроме того, полагают, что инсерционный
мутагенез может служить необходимым стимулом, запускающим клеточное перепрограммирование in vitro. Например, вектор может интегрироваться около генов, контролирующих плюрипотентный статус, тем самым обеспечивая их активацию. Хотя анализ ограниченного числа инсерционных сайтов в iPS-клетках подтвердил случайный характер встраивания вектора [12], возможность индукции перепрограммирования в результате векторной интеграции всё же не может быть полностью исключена.
Исследования М. Stadtfeld с соавт. (группа К. Hochedlinger) и К. Okita с соавт. (группа S. Yamanaka), опубликованные в Science Express соответственно 25 сентября и 9 октября, продемонстрировали возможность использования не способных к интеграции векторов (аденовирусных — К. Hochedlinger, аденовирусных и плазмидных — S. Yamanaka) для получения мышиных iPS-клеток. В итоге было показано, что инсерционный мутагенез не оказывает какого-либо значимого влияния на эффективность перепрограммирования клеток.
Основные пути совершенствования методов получения /ЯЗ-клегок: ВПК - вапьпроевая кислота; НСК - нейральные стволовые клетки
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
Обе группы исследователей использовали предложенный S. Yamanaka набор из четырех трансгенов — 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус [2]. В качестве перепрограммируемых клеток были выбраны фетальные и постна-тальные клетки печени, а также мышиные фиброблас-ты из тканей хвоста. Изначальное препятствие на пути индукции клеточного перепрограммирования с помощью неинтегрирующихся аденовирусных векторов заключалось в невозможности получить iPS-клетки путем введения четырех указанных факторов. Поэтому в качестве альтернативного пути было предложено использовать модифицированные фетальные гепатоци-ты, содержащие доксициклин-индуцибельный аллель 0ct4 (0ct4IND; группа К. Hochedlinger), либо проводить комбинированную трансфекцию клеток, применяя как ретро-, так и аденовирусные векторы в качестве носителей перепрограммирующих генов (группа S. Yamanaka). Исследователи полагают, что временной экспрессии генов-индукторов плюрипотентности явно недостаточно для изменения статуса дифференцированной клетки и ее возвращения к плюрипотентному состоянию. Важным моментом в поиске эффективной технологии перепрограммирования соматических клеток без векторной интеграции служил выбор адекватного типа клеток. Так, для трансфекции гепатоцитов требуется меньшее количество молекул вектора (20^50 на клетку) по сравнению с фибробластами (50^250 на клетку).
К. Hochedlinger с соавт. в результате трансфекции генов Sox2, Klf4 и с-Мус в составе аденовирусного вектора получили 9 колоний iPS-клеток из 0ct4IND фетальных клеток печени. Для этого потребовалось длительное (24^30 сут.) культивирование гепатоцитов в присутствие доксициклина, стимулировавшего устойчивую экспрессию 0ct4. При этом из 500 тыс. клеток 20^30% несли все три аденовирусных трансгена. В результате полученные колонии ЗСК-подобных клеток экспрессировали маркеры плюрипотентности (Sox2, SSEA-1) и могли пролиферировать в культуре в отсутствие доксициклина. Далее, авторы этой работы провели трансфекцию фибробластов — клеток, более устойчивых к генетической модификации. С целью визуализации 0ct4-экспрессирующих клеток исследователи использовали флуоресцентный 0ct4-GFP репортер. В результате была получена одна колония iPS-клеток.
Группа под руководством S. Yamanaka не использовала индуцибельный ген 0ct4, а трансфецировала известные гены в составе как аденовирусных, так и ретровирусных векторов. Для обнаружения перепрограммированных клеток репортерным геном служил Nanog, под контролем которого находилась экспрессия GFP и гена резистентности к пиромицину. Интересно отметить, что колонии iPS-клеток формировались лишь в тех случаях, когда 0ct4 трансфецировался с составе ретровирусного вектора, что говорит о необходимости стабильной экспрессии 0ct4 для индукции перепрограммирования.
Начальные эксперименты послужили основой для перепрограммирования соматических клеток без участия стабильно экспрессирующихся генетических конструктов. М. Stadtfeld с соавт. смогли получить три колонии iPS-клеток из постнатальнх гепатоцитов путем трансфекции всех четырех факторов (0ct4, Sox2, Klf4, с-Мус) в аденовирусных векторах, при этом в гепатоци-тах отсутствовал 0ct4IND аллель. Аналогично, колонии iPS-клеток были получены S. Yamanaka и коллегами из мышиных эмбриональных фибробластов с использованием плазмидных векторов (гены 0ct4, Klf4 и Sox2 располагались в одной плазмиде, с-Мус — в другой).
Таким образом, обе исследовательские группы наглядно продемонстрировали возможность формирования плюрипотентных iPS-клеток без интеграции трансгенов в геном соматической клетки.
Плюрипотентность полученных iPS-клеток была подтверждена хорошо известными молекулярными и функциональными тестами. Действительно, iPS-клетки экспрессировали характерный для ЗСК профиль генов плюрипотентности (Nanog, ЕСАТ1, Rex1, Fbx15 и др.), формировали тератомы при введении иммунодефицит-ным SCID мышам и давали начало здоровым химерным животным после трансплантации отдельных iPS-клеток в бластоцисту. Более того, К. Okita с соавт. получили жизнеспособное потомство от скрещивания химерных самцов с самками дикого типа, при этом все клетки полученных зародышей экспрессировали флуоресцентный репортерный белок GFP. Важно отметить, что ни у одной из химерных мышей не было отмечено опухолевых процессов в течение 4—13 мес. после рождения, что свидетельствует о безопасности применения предложенного набора трансгенов.
Особое внимание в обеих публикациях отведено анализу возможной (хотя и не характерной для аденовирусных и плазмидных векторов) интеграции векторной ДНК в геном клеток. С использованием ПЦР и Саузерн-блоттинга было показано, что интеграция генетического материала вектора фактически не является необходимым условием для формирования iPS-клеток, хотя и может наблюдаться в единичных случаях. Это согласуется с предыдущей работой группы S. Yamanaka, в которой не было обнаружено каких-либо определенных сайтов интергации ретровирусных векторов в геном модифицированных соматических клеток [12].
В дополнение, группа S. Yamanaka изучила происхождение полученных iPS-клеток, чтобы исключить возможность контаминации образцов ЗСК, несущими репортерный Nanog-GFP трансген. Метод SSLP показал, что iPS-клетки формируются именно из линий мышиных эмбриональных фибробластов. Важность данного эксперимента обусловлена предположением, что iPS-клетки формируются из клеток, изначально являющихся мульти- или плюрипотентными. Согласно критическим замечаниям S.V. Liu, популяция iPS-клеток может происходить из стволовых клеток, присутствующих среди дифференцированных клеток печени либо фибробластов [13,14]. Другими словами, речь может идти не о перепрограммировании соматических клеток в плюрипотентные, а лишь о селективной пролиферации стволовых клеток, уже присутствующих в образце. Полностью исключить такую возможность сложно, однако весомым свидетельством в пользу обратного служит отсутствие примитивных постнатальных клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности и функционально соответствующих ЗСК. В частности, 0ct4 не играет какой-либо существенной роли в поддержании функционального состояния стволовых клеток взрослого организма, а его экспрессия в соматических клетках — по-видимому, следствие ПЦР-амплификации присутствующих в геноме псевдогенов [15,16]. С другой стороны, как показали недавние эксперименты, перепрограммировать соматические стволовые клетки в iPS-клетки значительно легче, нежели дифференцированные [17].
Интересно также отметить, что 3 из 1 3 линий iPS-клеток, полученных К. Hochedlinger и коллегами, содержали тетраплоидные клетки. При этом полиплоидия не наблюдалась в предыдущих экспериментах, где использовались ретро- или лентивирусные векторы.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Наиболее очевидным объяснением этого может служить тот факт, что до 90% гепатоцитов взрослого организма изначально полиплоидны (тетра- или октаплоидны) [18]. Это означает, что несмотря на эффективность инфицирования гепатоцитов аденовирусными векторами (требуется 1—4 вектора на клетку), существует реальная опасность дисфункции клеточного генома iPS-клеток вследствие его полиплоидное™.
В целом, обе работы показали, что iPS-клетки могут быть получены без использования интегрирующихся векторов, хотя и в значительно меньшем количестве. Так, по данным S. Yamanaka, используя ретровирусы, можно полностью перепрограммировать более 100 из 1x108 клеток, трансфецированных генами трех факторов плюрипотентности, или более 10ОО в случае использования четырех факторов. В то же
время, новая технология позволила получить от 1 до 29 колоний iPS-клеток, т. е. выход перепрограммированных клеток составил 0,0001^0,001%, что почти на два порядка ниже, чем при использовании интегрирующихся векторов.
Исследования К. Hochedlinger и S. Yamanaka, несомненно, стали существенным шагом к направленному получению плюрипотентных стволовых клеток без использования методов, существенным недостатком которых является потенциальная дестабилизация клеточного генома. Таким образом, перепрограммирование соматических клеток без векторной интеграции может стать ведущим направлением в получении iPS-клеток — одной из главных, и, несомненно, самой популярной на сегодняшний день альтернативы эмбриональным стволовым клеткам человека.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yamanaka S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2007; 1(1): 39—49.
2. Takahashi K., Yamanaka S.. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2DD6; 126(41: 663-76.
3. Бозо И.Я. Новое направление получения ЗСК. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD7; II[41: 9—11.
4. Бозо И.Я. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD8; IIIС1): 22—3.
5. Kennedy D. Breakthrough of the year. Science 2DD7; 318(58581: 1833. [Full Text]
6. Yu J., Vodyanik М., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2DD7; 318(5858): 1917-20.
7. Nakagawa М., Koyanagi М., Tanabe K. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Мус from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 2008; 26(11: 101—6.
8. Huangfu D., Osafune K., Maehr R. et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only 0ct4 and Sox2. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1269-75.
9. Liao J., Wu Z., Wang Y. et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a
combination of six transcription factors. Cell Res. 2008; 18(5): 600—3.
10. Park I., Zhao R., West J. et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451 (7175): 141—6.
11. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448(7151): 313—7.
12. Aoi T., Yae K., Nakagawa М.. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008; 321 (5889): 699— 702.
13. Liu S. iPS cells: a more critical review. Stem Cells Dev. 2008; 17(3): 391-7.
14. Liu S. Towards a balanced view on iPS cells. Logical Biology 2008; 8(1): 32-8.
15. Lengner C., Camargo F., Hochedlinger K. et al. 0ct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal. Cell Stem Cell 2007; 1(4): 403-15.
16. Григорян A.C. Экспрессия фактора 0ct4 не требуется для самообновления соматических стволовых клеток. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; 111(1): 21—2.
17. Kim J., Zaehres Н., Wu G. et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 2008 ; 454(7204): 646-50.
18. Guidotti J., Brngerie 0., Robert A. et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. J. Biol. Chem. 2003; 278(21): 19095-101.
Подготовил А А. Лелявский
По материалам: Okita K„ Nakagawa M„ Hyenjong H„ Ichisaka T„ Yamanaka S. Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science 2008; 322(5903]: 949-53. Stadtfeld M„ Nagaya M„ Utikal J„ Weir G„ Hochedlinger K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated
Without Viral Integration. Science 2008; 322(5903): 949-53
МикроРНК модулируют активность факторов плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток -Nanog, 0ct4 и Sox2
МикроРНК — это короткие последовательности из 20^25 рибонуклеотидов, основной функцией которых является подавление трансляции определенных матричных РНК (мРНК), что приводит к остановке синтеза белка (1^2). В течение многих лет они привлекают интерес научного мира, являясь одним из основных регуляторов экспрессии генов. Считается, что микроРНК связываются с нетранслируемыми областями мРНК, расположенных на З’-конце, что справедливо для большинства микроРНК (3, 4). Исключений из этого правила очень немного
(5, 6). Вместе с тем вопрос о мишенях микроРНК остается крайне важным, так как детальное знание о механизмах их действия в каждом конкретном случае совершенно необходимо для понимания регуляции экспрессии генов, что неразрывно связано со всеми процессами, происходящими в клетке — как нормальными, так и патологическими.
Научная группа Y. Тау длительное время занимается изучением функциональных особенностей микроРНК. Именно в их лаборатории была предсказана возможность
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, 1У» 4, 2008
