Оцінка цитотоксичної дії екзометаболітів Lactobacillus plantarum in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

М1КРОБ1ОЛОГ1Я

© Коротких О. О., Кал^ченко С. В. УДК 615.277.3:576.3:579.262 Коротких О. О., Кал'1н'1ченко С. В.

ОЦ1НКА ЦИТОТОКСИЧНОТ Д1Т

ЕКЗОМЕТАБОЛ1Т1В LACTOBACILLUS PLANTARUM IN VITRO

Державна установа «1нститут мшробюлогм та iмунологГí iM. I. I. Мечникова НацюнальноТ академм медичних наук УкраТни» (м. Харкт)

kalinichenko [email protected]

Дана робота е фрагментом науково-дослщно'| роботи лабораторп профтактики краплинних Ыфек-цiй ДУ «1М1 НАМН» «Бiологiчнi основи розробки син-бiотичних комплексiв за умов застосування елек-тромагнiтних й ультразвукових хвиль», № державно'| реестраци 0113U001517.

Вступ. На сьогоднi вже встановлена провщна роль мiкробiоти органiзму людини в збереженн ÏÏ здоров'я [10-12]. Пробютичы препарати розгляда-ються найбiльш перспективними засобами проти антибютикорезистентних субпопуляцiй патогенних бактерм, оскiльки вони проявляють зовЫм iнший механiзм впливу на життедiяльнiсть патогенiв [5,8]. Пробiотики широко застосовують для етiотропного лiкування та вщновлення мiкрофлори при запальних iфекцiйних процесах в кишковому та урогенггально-му трактах [2,6].

Одним з основних критерив, як зараз пред'яв-ляються для оцiнки пробiотикiв та пробютичних властивостей продуктiв функцiонального харчуван-ня е визначення |'х токсичностi (сумюне засiдання експертно'| ради Продовольчо'| та стьськогоспо-дарсько'| оргаызаци ООН (FAO) та Всесв^ньо'| ор-гаызаци охорони здоров'я (WHO), що проходила в м. Кордоба (Аргентина) 1-4 жовтня 2001 р.). Ви-вчення токсичного впливу будь-якого лкарського препарату для подальшого застосування люди-ною проводиться з застосуванням лабораторних тварин.

Ще у 1885 роц нiмецький дослiдник Roux запо-чаткував застосування культур кл™н у бiологiчних дослiдженнях, а з середини ХХ столбя почався ш-тенсивний розвиток технологiй, пов'язаних з культурами клмтин, завдяки чому було отримано першу перещеплювальну клггинну культуру з карциноми шийки матки - клггинна лiнiя HeLa.

На цей час перещеплювальн культури кл™н, або кJliтиннi лши, широко використовуються в бю-логи, медицинi, бютехнологи завдяки вiдноснiй простотi i стандартних умов культивування, а також

стабтьно! морфологи кттин. В ocTaHHi роки кли тинн культури привертають увагу як модель докли нiчного тестування лкарських засобiв, бiоnогiчно активних речовин тощо, оскinьки кniтиннi культури здатн специфiчно реагувати на вплив бютичних чинникiв. Специфiчнiсть, як правило, проявляеться у вигnядi цитотоксичного ефекту, який оцшюють за ступенем морфоnогiчних змш, порушень морфоло-гiчного апарату та пролiферативних властивостей кniтин [4].

Виходячи з вище зазначеного нами була поставлена наступна мета: за ступенем морфолопчних змiн оцiнити можливють застосовування кniтинноI культури для визначення цитотоксично! дИ пробю-тичних штамiв.

Об'ект i методи дослiдження. Об'ектом досл^ дження були субстратзаnежнi культури кжтин niнiй HeLa, Vero, Hep-2, якi за морфоnогiею е етте^аль-ними кniтинами.

Для досniдiв готували суспензiю кniтин з по-Ывною концентрацiею 0,5Ч106/мл. Культури кnliтин культивували в середовищi DMEM/F-12 (Sigma, Гер-манiя) з додаванням 5% фетально! сироватки кровi ембрiонiв корiв, розчиыв гентамiцину та нiстатину в 80% етанолi з кiнцевою концентрацiею 50 од/мл, у герметичному культу рал ьному посудi в умовах СО2-iнкубатора при (37±1)°С, постмнм воnогостi 95% та вмюту СО2 5%. До середовища культивування додавали екзометаболгги L. plantarum в кшькост 0,3 мл; 0,2 мл; 0,1 мл; 0,05 мл; 0,025 мл; 0,0125 мл; 0,00625 мл на 1,0 мл середовища, осктьки саме ц ктькост не викликали змЫи рН ростового середовища (титрування агенту впливу). Як контролi ви-користовували кnliтиннi культури, яю культивували в ростовому середовищi з додаванням вщповщно! кinькостi цукрового бульйону, що застосовувався для отримання екзометаболтв (контроль впливу бульйону), та культури клггин, якi культивували в ростовому середовищi без додавання цукрового бульйону та екзометаболтв (контроль клггин).

Через 24 год. iнкубування за ступенем розпласту-вання, клiтин визначали 1х адгезивну здатнiсть. Що-денно, протягом 3 дiб, контролювали кгмтины моно-шари на наявнiсть/вiдсутнiсть порушення цiлiсностi моношару, появi осередкiв дегенераци, виникнення яких характеризуе цитотоксичну дт агентiв впливу. Ступень дегенерацiI кгмтинного моношару оцшюва-ли за системою «чотирьох хрестiв»: (4+) - деструк^я всiх клiтин (100%); (3+) - руйнування бтьшост клг тин (75%); (2+) - деструк^я половини клггин у моно-шарi (50%); (1+) - руйнування 25% кгмтин; (±) - руйнування окремих кгмтин; (-) - вiдсутнiсть дегенерацiI клггин.

Для отримання екзометаболтв Ь. plantarum готу-вали суспензiю добово! культури штаму з оптичною щiльнiстю 1,0 МсР [9]. До 45 мл поживного бульйону з додаванням 1% глюкози (цукровий бульйон) додавали 5,0 мл приготовано! суспензи мiкроорганiзмiв. Отриману сумiш iнкубували при (37±1)°С впродовж 72 год., пiсля чого двократно центрифугували при 3000 об/хв. впродовж 30 хв. та вщбирали суперна-тант, що мiстив екзометаболгти.

Статистична обробка даних здiйснювалась у вщ-повiдностi з правилами рядово! i альтернативно! варiацiйноI статистики, як викладено у поЫбниках [1,3,7]. Для вибiрок оцiнювалась вiдповiднiсть ем-тричних розподiлiв нормальному закону (розподг лення Гауса) за критерiями Колмогорова-Смiрнова, Шатро-Утка та Лiллiефорса. Якщо розподiл дослг джуваних вибiрок вiдрiзнявся вiд нормального, для обробки даних використовували непараметричн критерп: Манна-Уiтнi, Краскала-Уоллiса, Вткок-сона, критерм знакiв. Достовiрнiсть розбiжностей нормально розподтених величин визначали за до-помогою критерiю t - Стьюдента, з обчисленням середньо! величини М, середньоквадратичного вщ-хилення Э, середньо! похибки величини т, значення достовiрностi р. Для аналiзу одержаного матерiалу проводилось його групування за атрибутивними та варiацiйними ознаками [1,3,7]. У результат зве-дення матерiалу при пщрахунках одиниць спостере-жень були отриман абсолютнi числа, якi виражали описовi i кiлькiснi ознаки.

Результати дослщжень та Ух обговорення.

Першим етапом дослiдження стало дослiдження впливу цукрового бульйону на адгезивн власти-boctí та наявнiсть/вiдсутнiсть порушення цтюнос-tí моношару клiтинних культур лшм HeLa, Vero, Hep-2.

Встановлено, що додавання цукрового бульйону в ктькост 0,3 мл; 0,2 мл; 0,1 мл; 0,05 мл; 0,025 мл; 0,0125 мл; 0,00625 мл на 1,0 мл ростового серед-овища не впливало на адгезивн властивост кгмтин лшм HeLa, Vero, Hep-2 та не викликало порушення цтюност íx моношару.

Наступним етапом стало вивчення дм екзомате-болiтiв L. plantarum на культури клггин.

Порiвняльний аналiз результатiв показав, що пюля 24-х годинноí експозицií ефективнiсть при-крiплення клiтин HeLa, Vero, Hep-2 до субстрату до-стовiрно не змшювалась. Через 48 та 72 год. шку-бування всi контрольн культури клiтин утворювали моношар без ознак дегенераци.

Щодо ступеню дегенераци кгмтинного моношару культур дослщних лiнiй, то найбiльш стiйкими до дм екзометаболiтiв лактобацил були кгмтини лiнií Vero - тiльки через 72 години шкубування в ростовому середовищi з додаванням зазначеного агенту впливу в ктькост 0,3 мл на 1,0 мл середовища були вiдмiченi поодинокi клiтини з ознаками руйнування. Це може свщчити про не чутливють культури кгмтин до агенту впливу (табл.).

Кттини л i н i í HeLa проявляли помiрну чутливють до ди екзометаболiтiв лактобацил. Так, через 48 годин шкубаци у 25% кгитин, що культивува-ли в ростовому середовищi з додаванням агенту впливу в юлькост 0,3 мл та 0,2 мл на 1,0 мл середовища, були вiдмiченi деструктивы ознаки. Додавання до ростового середовища екзометаболтв L. plantarum в юлькост 0,1 мл призводило, через 48 год. шкубування до руйнування поодиноких кл™н ^eí лши. Через 72 год. шкубаци деструкцт спостер^али у 50% кл™н, що культивувались з додаванням екзометаболтв у юлькост 0,3 мл; 0,2 мл i 0,1 мл на 1,0 мл ростового середовища та були вiдмiченi поодинок кл^ини з ознаками руйнування

Таблиця.

Ступень дегенерацГГ кл1тинного моношару при культивувант культури кл1тин в ростовому середовищ1 з додаванням екзометабол1т1в L. plantarum

Кл1тини л1н1'Г Час спостереження, год. Кшьшсть екзометаболтв на 1,0 мл ростового середовища, мл

0,3 0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 0,00625

HeLa 24

48 + + ±

72 ++ ++ ++ ±

Vero 24

48

72 ±

Hep-2 24 ± ±

48 +++ ++ + + ±

72 ++++ +++ ++ ++ + ±

при куnьтивуваннi кniтин у ростовому середовищi з додаванням екзометабоniтiв в кшькост 0,05 мл.

Самими чутливими до дИ екзометабоniтiв L. plantarum виявились кniтини niнii Hep-2. Так, по-одинокi кттини з ознаками деструкцп при культиву-ваннi кттин у ростовому середовищi з додаванням екзометаболтв в кinькостi 0,3 мл i 0,2 мл були вщ-мiченi вже через 24 год. шкубаци. Пiсnя 48-годинно! iнкубацii ознаки деструкцiI виявляли 75% кттин, як iнкубуваnи з додаванням агенту впливу в кinькостi 0,3 мл; 50% клггин - в кinькостi 0,2 мл; 25% клггин -в кшькост 0,1 мл i 0,05 мл. Нав^ь при додаваннi екзометаболтв лактобацил в кinькостi 0,025 мл були вiдмiченi поодинокi кттини з ознаками руйнування. Через 72 год. Ыкубування деструкцiю спостерiгаnи у 100% кттин, якi iнкубуваnи з додаванням екзометаболтв L. plantarum в ктькост 0,3 мл; 75% кттин -в кшькост 0,2 мл; 50% клггин - в кшькост 0,1 мл i 0,05 мл; 25% - в кшькост 0,025 мл; та поодиною -в кшькост 0,0125 мл.

Узагальнюючи результати зазначимо, що оскшь-ки основним мюцем дii пробiотичних засобiв е сли-зовi оболонки оргаызму людини, якi, перш за все, висланн епiтеniаnьними кniтинами то, за морфоло-гiею вiдiбранi до дослщу niнii перещеплювальних клг тин також були епiтелiальними, проте вiдрiзняnись за походженням: аденокарцинома шийки матки людини (HeLa), нирка африкансько! зелено! мавпи (Vero) та аденокарцинома гортан людини (Hep-2). Експериментально визначено, що чутливими до дм екзометабоniтiв лактобацил виявились клгтини niнiй Hep-2 та HeLa. Встановлено дозозалежний цитоток-

сичний ефект впливу екзаметаболiтiв лактобацил. Зазначене свщчить про можливiсть використову-вати ктмтины культури для доктычного тестування пробютичних засобiв.

Висновки

1. Визначено, що взят до дослiдiв клiтиннi лши (HeLa, Vero, Hep-2) проявляють рiзну чутливiсть до дИ екзометаболiтiв лактобацил.

2. Кттини лiнil Vero проявляли чутливють тiльки через 72 год. шкубування в ростовому середовищi з додаванням екзометаболтв L. plantarum в кть-кост 0,3 мл в ктькост на 1,0 мл середовища.

3. Клiтини л i н i i HeLa проявляли помiрну чутли-вiсть - через 72 год. Ыкубаци деструкцiю спостерг гали у 50% кJliтин, що культивувались з додаванням екзометаболiтiв у кшькост 0,3 мл; 0,2 мл i 0,1 мл на 1,0 мл ростового середовища.

4. За умов низько! концентраци екзометаболг тв L. plantarum у ростовому середовищi (0,0125 мл i 0,025 мл) через 72 год. Ыкубацп дегенера^я клг тинного моношару спостерiгалась тшьки у кJliтин культури Hep-2.

5. Отриман результати свiдчать про можливють використання клiтинних культур лiнii Hep-2 для до-кJliнiчного тестування пробютичних засобiв.

Перспективи подальших дослiджень

Експериментальн результати щодо застосу-вання клггинних культур як можливо! моделi для тестування пробютичних засобiв розкривають пер-спективнiсть !х використання в бютехнолопчних процесах при проведеннi докJliнiчних випробувань замють дослiджень на лабораторних тваринах.

Л^ература

1. Боровиков В.П. Statistica. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows [Текст] / В.П. Боровиков, И.П. Боро-

виков. - М.: Филинъ, 1998. - 592 с.

2. Войда Ю.В. Микроэкология человека и роль пробиотических препаратов в терапии гнойно-воспалительных заболеваний

в акушерстве и гинекологии [Текст] / Ю.В. Войда, Н.Л. Солонина // Annals of Mechnikov Institute. - 2012. - № 2. - С. 27-37. [Електронний ресурс] Режим доступу: http://archive.nbuv.gov.ua/e-journals/AMI/2012_2/12vyvmcr.pdf.

3. Гельман В.Я. Медицинская информатика: практикум [Текст] / В.Я. Гельман. - [2-е изд.]. - СПб.: Питер, 2002. - 480 с.

4. Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Выпуск 31. [Текст] [отв. ред. М.С. Богданова]. - СПб.: Изд-во Политехн.

ун-та, 2015. - 81 с.

5. Кордон Т.1. Принципи створення, мехашзм дм та клЫчне застосування пробютиюв (Огляд) [Текст] / Т.1. Кордон // Аннали

Мечниковського шституту. - 2014. - № 4. - С. 8-16. - Режим доступу: http://nbuv.gov.ua/j-pdf/ami_2014_4_3.pdf.

6. Мокрозуб В.В. Ефективнють застосування штамiв лакто- та бiфiдобактерiй з препаратами цитоюшв при експериментальшй

стафшококовм шфекцп [Текст]: автореф. дис. ... канд. бюл. наук: 03.00.07 / Мокрозуб Вiкторiя Вiкторiвна; 1нститут мкробюлогп i вiрусоnогii iм. Д.К. Заболотного НацюнальноУ академп наук УкраУни. - К., 2014. - 22 с.

7. Прикладная медицинская статистика [Текст] / [под ред. В.М. Зайцева, В.Г. Лифляндского]. - СПб.: СПбГМА им. И.И. Меч-

никова, 2000. - 299 с.

8. Сизенцов А.Н. Эффективность совместного применения пробиотиков и антибиотиков в условиях in vitro [Текст] / А.Н. Си-

зенцов, Р. В. Ильясова // Весник ОГУ. - 2011. - № 12 (131). - С. 355-357.

9. Стандартизащя приготування мiкробних суспензм [Текст]: 1нформацмний лист про нововведення в системi охорони

здоров'я № 163-2006 К.: (Укрмедпатентшформ), 2006. - 10 с. - (Нормативний документ. МОЗ УкраУни; УкраУнський центр науковоУ медичноУ шформацп та патентно-лщензмноУ роботи. 1нформацшний лист).

10. Янковский Д.С. Микрофлора и здоровье человека [Текст] / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент. - К.: ТОВ «Червона Рута-Турс», 2008. - 552 с.

11. Gollwitzer E.S. Microbiota abnormalities in inflammatory airway diseases - Potential for therapy [Text] / E.S. Gollwitzer, B.J. Marsland // Pharmacol Ther. - 2014. - Jan. - № 141 (1). - P. 32-39.

12. Tojo R. Intestinal microbiota in health and disease: role of bifidobacteria in gut homeostasis [Text] / R. Tojo, A. Suárez, M.G. Clemente, C.G. de los Reyes-Gavilán, A. Margolles, M. Gueimonde, P. Ruas-Madiedo // World J. Gastroenterol. - 2014. -Nov. 7. - № 20 (41). - P. 15163-15176.

УДК 615.277.3:576.3:579.262

ОЦ1НКА ЦИТОТОКСИЧНОТ ДМ ЕКЗОМЕТАБОЛ1Т1В LACTOBACILLUS PLANTARUM IN VITRO

Коротких О. О., КалЫченко С. В.

Резюме. У po6oTi наведено дан щодо вивчення цитотоксично! дм екзометаболiтiв L. plantarum за ступе-нем морфологiчних змiн клiтинних культур HeLa, Vero, Hep-2. Визначено, що культури клiтин лiнiI Vero були не чутливими до дм вказанного агенту. Чутливими до дИ екзометаболтв лактобацил виявились клiтини лiнiй Hep-2 та HeLa. Експериментально встановлено дозозалежний цитотоксичний ефект впливу екзометаболг ^в: iз зниженням !х концентрацiI в ростовому середови!^ ступень дегенерацiI кгмтинного моношару зни-жувався. Так, через 72 години шкубацп у 50% клiтин лiнiI HeLa, що культивували в ростовому середовищi з додаванням агенту впливу в юлькост 0,3 мл та 0,2 мл на 1,0 мл середовища, були вiдмiченi деструктивы ознаки. Щодо кгмтин лши Hep-2, то пiсля 72-годинно! шкубацм ознаки деструкцiI були виявленi у 100% кгмтин, якi iнкубували з додаванням агенту впливу в ктькост 0,3 мл; у 75% клггин - в ктькост 0,2 мл; у 50% кгмтин -в юлькост 0,1 мл i 0,05 мл; у 25% клггин - в ктькост 0,025мл та поодинок - в ктькост 0,0125 мл.

Ключовi слова: Lactobacillus, культури клгтин, пробiотики, цитотоксичний ефект.

УДК 615.277.3: 576.3: 579.262

ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ LACTOBACILLUS PLANTARUM IN VITRO

Коротких Е. О., Калиниченко С. В.

Резюме. В работе приведены данные по изучению цитотоксического действия экзометаболитов L. plantarum по степени морфологических изменений клеток культур HeLa, Vero, Hep-2. Определено, что культура клеток линии Vero была не чувствительна к действию указанного агента. Чувствительными к действию экзометаболитов лактобацилл оказались клетки линий Hep-2 и HeLa. Экспериментально установлен дозозависимый цитотоксический эффект воздействия экзометаболитов: со снижением их концентрации в ростовой среде степень дегенерации клеточного монослоя снижалась. Так, через 72 часа инкубации у 50% клеток линии HeLa, что культивировали в ростовой среде с добавлением агента влияния в количестве 0,3 мл и 0,2 мл на 1,0 мл среды, были отмечены деструктивные признаки. Что касается клеток линии Hep-2, то после 72-часовой инкубации признаки деструкции были обнаружены у 100% клеток, которые инкубировали с добавлением экзометаболитов в количестве 0,3 мл; у 75% клеток - в количестве 0,2 мл; у 50% клеток - в количестве 0,1 мл и 0,05 мл; у 25% клеток - в количестве 0,025 мл; и единичные - в количестве 0,0125 мл.

Ключевые слова: Lactobacillus, культуры клеток, пробиотики, цитотоксический эффект.

ийС 615.277.3: 576.3: 579.262

EVALUATION OF THE EXOMETABOLITES CYTOTOXIC EFFECT OF LACTOBACILLUS PLANTARUM IN VITRO

Korotkykh O. O., Kalinichenko S. V.

Abstract. An exceptionally important role of lactobacilli in the microorganisms is determined by the diversity of their functions. They are participating in the regulation of optimal levels in metabolic processes, creating a high colonization resistance of mucosal, inhibit adhesion, penetrate and propagate pathogenic and opportunistic microorganisms, have a broad spectrum antimicrobial mechanisms, produce biologically active substances. One of the main criteria, which are now presented for evaluation of probiotics and probiotic properties of the functional food is to determine their toxicity. In recent years, attention is attracted to the cell cultures as a model for preclinical testing of drugs, biologically active substances, etc. This is due to the fact that the cell cultures are capable to specifically respond to impact of biotic factors. Specificity is typically manifested as a cytotoxic effect which is evaluated by the degree of morphological changes, disorders of morphological apparatus and proliferative properties of cells.

Our next aim was staged proceeding from the above: evaluate the possibility of using cell culture to determine the cytotoxic effect of probiotic strains by the degree of morphological changes.

The study involved the culture substrate dependent cell lines HeLa, Vero, Hep-2, which morphologically is an epithelial cell. For the experiments was prepared suspension of cells with the inoculum concentration 0.5x106 / ml. Cultures of cells were cultured in DMEM / F12 (Sigma, Germany) supplemented with 5% fetal serum of cattle embryos, solutions gentamicin and nystatin in 80% ethanol to a final concentration of 50 U / ml, in a sealed culture dish in a CO2 incubator with (37 ± 1)°C and constant humidity of 95% and a CO2 content of 5%. To the culture medium were added exometabolites L. plantarum in an amount of 0.3 ml 0.2 ml 0.1 ml 0.05 ml 0.025 ml ml 0.0125 0.00625 ml per 1.0 ml of medium, since it did not cause the amount of change pH of the growth medium (titration agent of influence).

A suspension of the daily strain culture with an optical density of 1.0 МсF was prepared for exometabolites L. plantarum. 5.0 mL of microbial suspension was added to 45 ml of nutrient broth supplemented with 1% glucose (sugar broth). The resulting mixture was incubated at (37 ± 1)°C for 72 h. Then it was centrifuged twice at 3000 rev / min for 30 minutes and the supernatant was collected which contains exometabolites. As a result were obtained, while calculating the data, the absolute numbers, which express the descriptive and quantitative traits.

The data which studied the cytotoxic effect of L. plantarum exometabolites by degree of morphological changes HeLa cell cultures, Vero, Hep-2 are given in. The first stage of the study was to investigate the influence of sugar

broth on the adhesive properties and the presence / absence of compromising the integrity of the monolayer cell culture lines HeLa, Vero, Hep-2. The next step was to study the action of ekzomatebolites L. plantarum in the cell culture. It was determined that the culture Vero cell line was not sensitive to the action of specified agent. Hep-2 cells and HeLa lines were sensitive to the action of lactobacilli exometabolites. Dose-dependent cytotoxic effect of exo-metabolites was established experimentally: the degree of degeneration of the cell monolayer is decreased with a reduction of their concentration in the growth medium. Thus, after 72 hours of incubation in 50% HeLa cell lines that are cultured in growth medium supplemented with an agent of influence in an amount of 0.3 ml and 0.2 ml per 1.0 ml of medium destructive signs were noted. As for the cell line Hep-2, after 72 hours of incubation, the signs of degradation were detected in 100% of the cells that were incubated with the addition of exometabolites at 0.3 ml; 75% of the cells - in an amount of 0.2 ml; 50% of the cells - in an amount of 0.1 ml and 0.05 ml; 25% of the cells -in an amount 0,025ml; and unit - in an amount of 0.0125 ml.

Experimental results on the use of cell cultures as a possible model for testing probiotic agents reveal prospects of their use in biotechnological processes during pre-clinical trials instead of research on laboratory animals.

Keywords: Lactobacillus, cell culture, probiotics, cytotoxic effect.

Рецензент - проф. Ф^монова Н. I.

Стаття надшшла 07.03.2016 року