Вплив наночастинок срібла на формування біоплівки бактеріями Enterococcus faecalis Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© Синетар Е. О.

УДК 546.57+615.83:616-022.7 Синетар Е. О.

ВПЛИВ НАНОЧАСТИНОК СР1БЛА НА ФОРМУВАННЯ Б1ОПЛ1ВКИ БАКТЕР1ЯМИ ENTEROCOCCUS FAECALIS

ДУ «1нститут етдемюлопГ та iнфекцiйних хвороб ím. Л. В. Громашевського

НАМН УкраТни» (м. Кив)

Дослiдження виконанi у вiдповiдностi з напря-мом науково-дослщних робiт лабораторiI медично! мiкробiологiI з музеем патогенних для людини мк-роорганiзмiв ДУ «1нститут епiдемiологiI та Ыфекцм-них хвороб iм. Л. В. Громашевського НАМН Укра!ни» та е фрагментом теми: «Патогенетичне значення бюлопчних властивостей збудникiв та мiжмiкробноI взаемодiI при iнфекцiях, обумовлених умовно пато-генними мiкроорганiзмами, та удосконалення дiа-гностики i профiлактики цих захворювань» (№ державно! реестраци 0113и000074).

Вступ. Одним iз факторiв розвитку катетер-асоцiйованих iнфекцiй сечовивщних шляхiв (КА-1СВШ) е тривалють катетеризацiI, яка подiляеться на короткотермшову (до 7 дiб) та довготермшову (бiльше 7 дiб) [1]. Тривала катетериза^я створюе екологiчну нiшу для надмiрного розвитку популяцi,i резидентно! мiкрофлори людини. Насамперед, це зумовлено властивостями мiкроорганiзмiв, якi коло-нiзують епiтелiальнi поверхнi урогенiтального тракту та формують бiоплiвки, спричинюючи у мюцях !х локалiзацiI запальнi процеси, що лежать в основi патогенезу цисти^в, уретритiв, пiелонефритiв тощо [4]. З огляду на це попередження первинно! конта-мiнацií iмплантатiв (в нашому випадку - катетерiв) i пригычення формування бiоплiвок на цих медичних засобах е актуальною проблемою сучасно! медици-ни i бiологií [4,5]. Згщно лiтературних даних видовий склад як мiкроорганiзмiв-контамiнантiв катетерiв, так i збудникiв КА1СВШ надзвичайно рiзноманiтний. Серед грампозитивних бактерм в останнiй пер^ од у розвитку КА1СВШ переважають представники роду Enterococcus [5]. Застосування наночастинок металiв може бути одним iз перспективних шляхiв запобiгання формуванню бiоплiвки мкрооргаызма-ми [8,9].

Мета дослщження. Дослiдити вплив наночастинок срiбла на бiоплiвкоутворення Enterococcus faecalis на поверхнi силiконового катетера.

Об'ект i методи дослiдження. Для моделюван-ня бактерiального бiоплiвкоутворення на поверх-нi силiконового катетера використовували штам Е. faecalis 49, який видтено з сечi хворого, який пе-ребував на лiкуваннi у вдцшены реанiмацií та штен-сивно! терапи ДУ «1нститут нейрохiрургií iм. А. П. Ро-моданова НАМН Укра!ни», м. Ки!в i не мав патологи з боку сечовивщно! системи.

Editsinetar@rambler.ru

Препарат наночастинок срiбла у виглядi коло!д-ного розчину (люб'язно наданий Товариством з обмеженою вщповщальнютю «Нано ТехнологiI в Медицинi», м. Ки!в) був отриманий за методикою Sivaraman et al. [10] з деякими модифка^ями. Для цього у розчин гщроксиду натрiю з концентра^ею [NaOH] = 1х10-2 моль/л при штенсивному перем^ шуваннi добавляли розчин таншу з концентрацiею [танiн] = 0,2 мас. % та розчин ытрату срiбла з кон-центращею [AgNO3] = 1х10-3 моль/л. Пюля завер-шення синтезу коло!дний розчин нейтралiзували до рН 6.5 - 7.0 шляхом краплинного додавання оцтово! кислоти. Таю коло!ди стабiльнi i не змшюють сво!х властивостей нав^ь при термообробцi протягом

2 годин при 80еС. У дослiдженнях використовували коло!дний розчин наночастинок срiбла з м^маль-ною iнгiбуючою концентрацiею (М1К) дiючоI речови-ни 0,02 мг/мл. М1К наночастинок срiбла попередньо визначали методом сермних розведень у вщповщ-ному живильному середовищi [2].

Бiоплiвкоутворення моделювали шляхом шку-бування фрагмен^в силiконових катетерiв (Jiangsu Suyun Medical Materials Co., КНР) у суспензп E. faecalis з концентрацiею клггин 107 кл/мл на трип-тиказосоевому бульйон (TSB), (BioMeriеux, Франтя) протягом 24, 48 та 72 годин. Для оцшки впливу препарату наночастинок срiбла на адгезiю мiкробних клiтин фрагменти силiконових катетерiв шкубували у сумiшi коло!дних наночастинок срiбла та бактерiаль-нiй суспензiI у стввщношены 1:1 протягом 24 годин.

3 метою вивчення здатност дослщжуваного препарату срiбла запобiгати бiоплiвковому росту бактерiй виду E. faecalis на поверхн катетера до бактерiаль-но! суспензiI додавали розчин наночастинок срiбла у спiввiдношеннi 1:1 через 24 i 48 годин шкубаци фрагмен^в катетера. Концентрацiя наночастинок срiбла в iнкубацiйнiй сумiшi становила 0,01 мг/мл.

Оцшку бiоплiвкоутворення проводили морфоло-гiчно за допомогою скануючого електронного мкро-скопу Tescan Mira 3 LMU (Чехiя). Для вiдображення нашарувань наночастинок срiбла використовувався детектор вторинних, пружньо вщбитих електронiв. Для електронно! мiкроскопiI препарати готували за методикою [3] з незначними модифка^ями. Для цього фрагменти катетера пюля шкубаци промива-ли дистильованою водою, фарбували ген^ан-вюле-том, потiм знову промивали дистильованою водою

i фiксували 30 хвилин 96% етиловим спиртом. Зраз-ки перед вмiщенням в камеру мiкроскопа з високим вакуумом (« 6х10-2 Па) висушували при кiмнатнiй температурi.

Результати дослщжень та Гх обговорення. Перiод найбiльшоí бiологiчноí активностi збудника припадае на першу добу його культивування у трип-тиказосоевому бульйонi. Теоретично цей перюд вщ-далено моделюе процеси, якi вiдбуваються в першi днi пiсля введення катетеру в сечовивщну систему хворого. На першому етапi дослiджень ми шкубу-вали фрагменти катетерiв у пробiрках з Е. 1веоа!1Б з концентрацiею кл^ин 10 7 кл/мл при 37°С упродовж 24 годин, пiсля чого шкубований фрагмент обро-блявся як зазначено у методичному роздЫ i п^дда-вався скануючiй мiкроскопií.

На поверхш силiконового катетера пiсля добовоТ iнкубацií бактерií виду Е. 1аеоа!1Б адгезувались у ви-глядi поодиноких одшеТ-двох кттин, а також утворю-вали мiкроколонií з 15-20 щтьно об'еднаних кл^ин, що були розаяш на поверхнi катетеру у локусах ад-гезií (рис.1).

Iнкубацiя фрагменту катетера у сумш бактерiй з наночастинками срiбла в концентрацií 0,01 мг/ мл протягом 24 годин запоб^ала адгезп Е. 1веоа!1Б, 1х розмноженню та утворенню мiкроколонiй на поверхш дослщжуваного катетера у порiвняннi з контролем.

Через 48 годин шкубацп на контрольних зразках катетерiв у бактерiальнiй суспензií спостер^ались острiвцi щiльних шарiв бактерiальних кл^ин, якi на-лiчували сотнi i тисячi мiкроорганiзмiв (агломерати). Агломерати являли собою об'еднаш мiкроколонií кттин Е. 1веоа!1Б. Через 72 години шкубацп фраг-ментiв катетера нами спостер^ався бiоплiвковий рiст Е. 1веоа!1Б, який виглядав як процес багатоша-

Рис. 1. Фрагмент силшонового катетера пiсля 24 години шкубацп у суспензп клiтин E. faecalis з концентращею 10 7 кл/мл у TSB

Прим1тка: чорними стрiлками вiдмiчено адгезш поодиноких клiтин E. faecalis; бшими стрiлками - мiкроколонií E. faecalis.

рового оброщення nüBepxHi катетера мiкpооpганiз-мами (рис. 2).

З метою вивчення здатност дослiджуваного препарату сpiбла гальмувати розмноження та запоб^а-ти утворенню агломepатiв eнтepококiв на поверхш фрагмент силiконового катетера, через 24 години шкубацп до бактepiальноí суспензп додавали розчин наночастинок сpiбла у спiввiдношeннi 1:1. На 48 годину шкубацп при 370С на поверхш фрагменту катетера спостер^али адгезю, мiкpоколонií кттин E. faecalis, проте без формування агломера^в кл^ин eнтepококiв у поpiвняннi з ростом бiоплiвки без наночастинок, який виконував мюю контролю. Отже, шкубащя фpагмeнтiв силiконового катетера в сум^ шi бактepiальноí суспeнзií з наночастинками сpiбла знижуе iнтeнсивнiсть процесу розмноження кл^ин E. faecalis та запоб^ае формуванню агломepатiв на поверхш катетера у поpiвняннi з контролем. На-ступним етапом наших дослщжень було встанов-лення можливостей впливу наночастинок сpiбла на бiоплiвковий рют eнтepококiв через 2 доби шкубацп на поверхш катетера за умови додавання розчину препарату сpiбла на 48-у добу. Через 72 години ш-кубацп дослщжуваних фpагмeнтiв нами не виявлено бiоплiвкового росту на поверхш катетера. Спостер^ гались окpeмi мiкpоколонií, угруповання E. faecalis та сорбщя наночастинок сpiбла на поверхш мiкpоко-лонiй eнтepококiв як через 24, 48 годин шкубацп, так i через 72 години (рис. 3).

Слщ вщзначити, що дослщжуючи вплив наночастинок сpiбла на бiоплiвковий piст E. faecalis на модeлi уpологiчниx катeтepiв, було виявлено, що наночастинки сpiбла осаджувались нepiвномipно на повepxнi катетера, утворюючи при цьому невелик скупчення через 24 години шкубацп (рис. 4). Тщ як, на 48 i 72 години шкубацп спостер^али дифузно

Рис. 2. Бiоплiвковий рiст штаму E. faecalis на фрагментi силiконового катетера шсля 72 годин iнкубацГГ

Рис. 3. Сорбщя наночастинок срiбла (Ад) на поверхнi клiтин Е. faecalis через 48 годин шкубацГГ

Прим1тка: стрiлками вiдмiчено сорбцiю наночастинок срiбла на поверхнi клiтин Е. РавсаИв

розкидан1 наночастинки ср1бла на поверхш досл1-джуваного катетера.

Проведен! дослщження показали, що пусковим мехашзмом б1опл1вкоутворення е адгез1я мкроорга-н1зм1в п1д час активно! фази Ух розмноження у трип-тиказосоевому бульйош протягом перших 24 годин. Але в цю бюлопчно активну фазу м1кроорган1зми 61-опл1вок не утворюють, а тшьки адгезуються поодин-ц1. Деяк1 з них утворюють мкроколонп з 2-3 кл1тин. М1кроколон1У - початок прист1нного розмноження I дшення м1кробних кл1тин. 1х виявлення е ознакою початку розростання I наступного утворення бюпл1-вок.

Отже, б1опл1вкоутворенння для росту популяцп бактер1й в першу добу бюлопчно не потр1бно. Бю-пл1вки починають утворюватись на другу добу, коли життя мкробноУ популяцп пюля логарифм1чноУ фази I досягнення М-концентрацп переходить у фазу при-пинення розмноження через фактор Оиогит звпз1пд з наступним в1дмиранням. Це е початок «старшня» культури, якому в свм час були придшеш досл1джен-ня М. О. ЙолшиноУ та УУ школи в нашому 1нститут1, яка показала, що бюлопчш властивост1 стар1ючих культур змшюються. Можна припустити, що першою змшою на цьому шляху е здатнють бактер1й до розмноження на поверхнях пюля адгезп на них. В по-дальшому це призводить до утворення бюпл1вок. Тому, характерною ознакою бюпл1вкового росту е щшьне розташування кл1тин, яке виникае через кл1-тинний под1л та призводить до оброщення. Проте, метою наших дослщжень було гальмування виник-нення бюпл1вок на поверхн1 досл1джуваного катетера за допомогою наночастинок ср1бла. Проведен! досл1дження показали, що наночастинки в суб1нпбу-юч1й концентрац1У 0,01 мг/мл ефективно затримують рют бактерм Е. ТавсаИв.

Висновки

1. Бюпл1вкоутво-рення на катетерах започатковуеться ад-гез1ею Е. ТавсаИв на-прик1нц1 першоУ доби росту в бульйоншй культур!.

2. Характерною ознакою бюпл1вково-го росту е щшьне розташування мкробних кл1тин на поверхн1 катетера, яке виникае через кл1тинний под1л.

3. Виразш форми б1опл1вок - агломе-рати - виникають на мюц1 м1кроколон1й на другу добу I в найбшьш розвинен1й багатоша-ровм форм1 спостер1-гаються на третю добу.

4. Встановлено, що 1нкубування фрагмент1в сил1конового катетера протягом 24 годин у сум1ш1 бактер1альноУ суспенз1У Е. ТавсаИв з наночастинками ср1бла у субшпбуючм концентрац1У 0,01 мг/мл запобкае розмноженню та утворенню м1кроколон1й Е. ТавсаИв.

Перспективи подальших дослiджень. Отри-ман1 дан1 св1дчать про перспективнють застосування наночастинок ср1бла з метою попередження форму-вання б1опл1вки мкрооргашзмами на поверхн1 сил1-конового катетера.

Рис. 4. Сорбфя наночастинок срiбла на поверхнi фрагменту силiконового катетера через 24 години шкубацГГ

Прим1тка: стрiлками вiдмiчено наявнiсть наночастинок срiбла та Ух скупчення.

Лiтература

1. Винник Ю. С. Микробные биопленки в хирургии: механизмы образования, лекарственная устойчивость, пути решения про-

блемы / Ю. С. Винник, О. В. Перьянова, Е. В. Онзуль, О. В. Теплякова // Новости хирургии. - Т. 8, № 6. - 2010. - С. 115 - 125.

2. Визначення чутливост мiкроорганiзмiв до антибактерiальних препара^в: методичш вказiвки МВ 9.9.5-143-2007. Офщмне

вид. - К.: МОЗ УкраУни, 2007. - 79 с.

3. Галюн М. Б. Формування бiоплiвки Pseudomonas aeruginosa за присутност вюмутових комплекЫв порфiринiв: автореф. дис.

канд. мед. наук: 03.00.07 // М. Б. Галюн; КиУв, Нацюнальна академiя наук УкраУни, 1нститут мкробюлогп i вiрусолопi iм. Д.К. Заболотного. - Х., 2013. - 20 с.

4. Пинегина О. Н. Изучение видового состава микроорганизмов в биопленках на венозных и уретральных катетерах в отделе-

ниях реанимации и интенсивной терапии / О. Н. Пинегина, А. В. Сатурнов, Г. Г. Выборнова // Проблемы мед. микол. - Т. 11, № 2. - 2009. - С. 105.

5. Синетар Е. О. Антибютикостшкють та адгезивш властивост збудниюв катетер-асоцмованих шфекцм сечовивщних шляхiв /

Е. О. Синетар, О. I. Брич, М. М. Лоскутова, I. П. Ткачик // Мiкробiологiчний журнал. - 2014 - Т. 76, № 3. - С. 41-46.

6. Ульберг З. Нанотехнологп в медицина роль колоiднохiмiчних процеав / З. Ульберг, Т. Грузша, О. Карпов // Вюн. НАН УкраУни. -

2008. - № 8. - С. 28 - 41.

7. Чекман I. С. Наноматерiали i наночастинки: класифкащя / I. С. Чекман, Н. О. Горчакова, О. Ю. Озейчук // Науковий вюник

Нацюнального медичного ушверситету iменi О. О. Богомольця. - 2009. - № 2. - С.188 - 201.

8. Шуб Г. М. Изменение адгезивной активности Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa под влиянием наночастиц серебра /

Г. М. Шуб, О. Г. Шаповал, С. Е. Вельмакин, Л. Б. Сакулина // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 6. - С.1453 -1455.

9. Kim J. S. Antimicrobial effects of silver nanoparticles / J. S. DVM Kim, Ph. Da, E. MSb Kuk et al. // Nanomedicine: Nanotechnology,

Biology and Medicine. - 2007. - Vol. 3, N. 1. - P. 95 - 101.

10. Sivaraman S. K. Venugopal Santhanam A green protocol for room temperature synthesis of silver nanoparticles in seconds / S.K.Sivaraman, I. Elango, S. Kumar // Current science - 2009. - Vol. 97, N. 7. - P. 1055 - 1059.

УДК 546.57+615.83:616-022.7

ВПЛИВ НАНОЧАСТИНОК СР1БЛА НА ФОРМУВАННЯ Б1ОПЛ1ВКИ БАКТЕР1ЯМИ ENTEROCOCCUS FAECALIS

Синетар Е. О.

Резюме. Метою було дослщити вплив наночастинок срiбла на бiоплiвкоутворення Enterococcus faecalis на поверхн силконового катетера. Методи: бактерюлопчы та електронно^кроскотчы. Результати: шку-ба^я фрагмен^в силконового катетера у сумш бактерм E. faecalis з наночастинками срiбла у рщкому по-живному середови!^ знижуе Ытенсивнють процесу адгезп бактерiальних клггин упродовж 24 годин та при-гычуе бiоплiвковий рют на поверхн катетера протягом наступних 48 i 72 годин. Висновок. Отриман дан свщчать про здатнють наночастинок срiбла попереджувати формування бiоплiвок E. faecalis на поверхн силiконових катетерiв.

Ключовi слова: еnterococcus faecalis, силконовий катетер, бiоплiвка, наночастки срiбла.

УДК 546.57+615.83:616-022.7

ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНКИ БАКТЕРИЯМИ ENTERO-COCCUS FAECALIS

Синетар Э. А.

Резюме. Целью явилось исследовать влияние наночастиц серебра на биопленкообразование Enterococcus faecalis на поверхности силиконового катетера. Методы: бактериологические и электронно-микроскопические. Результаты: инкубация фрагментов силиконового катетера в смеси бактерий E. faecalis с наночастицами серебра в жидкой питательной среде снижает интенсивность процесса адгезии бактериальных клеток на протяжении 24 часов и подавляет биопленочный рост на поверхности катетера в течение следующих 48 и 72 часов. Вывод. Полученные данные свидетельствуют о способности наночастиц серебра предупреждать формирование биопленок E. faecalis на поверхности силиконовых катетеров.

Ключевые слова: еnterococcus faecalis, силиконовый катетер, биопленка, наночастицы серебра.

UDC 546.57+615.83:616-022.7

THE INFLUENCE OF SILVER NANOPARTICLES ON THE FORMATION OF BIOFILM BACTERIA ENTEROCOCCUS FAECALIS

Synetar E. A.

Abstract. Introduction. In modern times in hospitals prolonged catheterization of patients creates an ecological niche for excessive population of resident microflora rights, in particular bacteria of the genus Enterococcus sp, Candida sp. First of all, this is due to the properties of microorganisms that colonize the urogenital tract epithelial surfaces and form biofilms, causing their localization in places inflammatory processes underlying the pathogenesis of cystitis, urethritis, pyelonephritis and more. Given this primary prevention of contamination of implants, in particular catheters, and inhibition of the formation of biofilms on medical devices is an actual problem of modern medicine and biology. The use of metal nanoparticles can be one of the promising ways to prevent the formation of biofilm microorganisms. Objective: To investigate the effect of silver nanoparticles on Enterococcus faecalis biofilm formation on the surface of the silicone catheter. Methods: bacteriological and electron microscopy. Ihe formation

of biofilm modeled by incubation fragments silicone catheters (Jiangsu Suyun Medical Materials Co., China) in suspension with a concentration of E. faecalis cells 107 cells/ml tryptykazosoy broth (TSB) (BioMerieux, France) for 24, 48 and 72 hours. To assess the impact of silver nanoparticles for drug the formation of biofilm pieces of silicone catheters were incubated in a mixture of colloidal silver nanoparticles and bacterial suspension in a ratio of 1:1 for 24, 48 and 72 hours. The concentration of silver nanoparticles in the incubation mixture was 0.001 mg/ml.

Results: Studies have shown that the trigger is the formation of biofilm adhesion of microorganisms during the active phase of reproduction in tryptykazosoy broth during the first 24 hours. In this phase of biologically active microorganisms don't form biofilms. Some form of microcolonies 2-3 cells. Microcolonies - beginning wall multiplication and division of microbial cells. Their detection is a sign of early overgrowth and subsequent formation of biofilms.

Established that incubation fragments silicone catheter in a mixture of bacteria E. faecalis with silver nanoparticles in a liquid medium reduces the intensity of adhesion of the bacterial cells for 24 hours and inhibits biofilm formation on the catheter surface during the next 48 hours. Not found the formation of biofilm growth on the surface of the catheter 72 hours after adding the drug solution of silver on the 48th hour of incubation studied fragments. There were some microcolonies grouping E. faecalis and sorption of silver nanoparticles on the surface of microcolonies enterococci as 24, 48 hours of incubation, and 72 hours. Conclusion. The findings suggest that the ability of nanoparticles of silver to prevent the formation of biofilms on the surface of E. faecalis silicone catheters.

Keywords: enterococcus faecalis, silicone catheter, biofilm, silver nanoparticles.

Рецензент - проф. Лобань Г. А.

Стаття надшшла 28.09.2015 р.