CC BY
75
УДК 619:578.835.2: 616-076
Ключевые слова: ципрофлоксацин, цефотаксим, полимиксин В, ампициллин, гентамицин, нистатин, цитотоксич-ность, клеточная линия BHK-21/2-17
Key words: ciprofloxacin, cefotaxime, polymyxin B, ampicillin, gentamicin, nystatin, cytotoxicity, cell line "BHK-21"
Доронин М.И., Шишкова А.А., Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Гусева М.Н., Стариков В.А., Борисов А.В., Шевченко М.А.
ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА, ЦЕФОТАКСИМА, ПОЛИМИКСИНА В, АМПИЦИЛЛИНА, ГЕНТАМИЦИНА И НИСТАТИНА В СОЧЕТАНИИ ДРУГ С ДРУГОМ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК BHK-21
CYTOTOXICITY EVALUATION OF CIPROFLOXACIN, CEFOTAXIME, POLYMYXIN B, AMPICILLIN, GENTAMICIN AND NYSTATIN IN COMBINATION WITH EACH OTHER IN THE SUSPENSION CELL CULTURE OF "BHK-21"
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин М.И., к.б.н., науч. штрудник. E-mail: midarriah89@mail.ru. Тел. +7 900 589-96-33
Doronin M.I., PhD of Biological Sciences, Researcher. E-mail: midarriah89@mail.ru. Tel. +7 900 589-96-33 Шишкова А.А., к.в.н., главный технолог. E-mail: shishkova@arriah.ru Shishkova A.A., PhD of Veterinary Sciences, Chief Technologist. E-mail: shishkova@arriah.ru Лозовой Д.А., к.в.н., директор. E-mail: lozovoy@arriah.ru Lozovoy D.A., PhD of Veterinary Sciences, Director. E-mail: lozovoy@arriah.ru Михалишин Д.В., к.в.н., зав. лабораторией. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D.V., PhD of Veterinary Sciences, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Гусева М.Н., к.б.н., ст. науч. сотрудник. E-mail: guseva@arriah.ru Guseva M.N., PhD of Biological Sciences, Senior Researcher. E-mail: guseva@arriah.ru Стариков В.А., к.в.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: starikov@arriah.ru Starikov V.A., PhD of Veterinary Sciences, Leading Researcher. E-mail: starikov@arriah.ru
Борисов А.В., к.в.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov@arriah.ru Borisov A.V., PhD of Veterinary Sciences, Leading Researcher. E-mail: borisov@arriah.ru Шевченко М.А., вед. ветеринарный врач. E-mail: shevchenko@arriah.ru Shevchenko M.A., Leading DVM. E-mail: shevchenko@arriah.ru
Аннотация. Проведена оценка цитотоксичности ципрофлоксацина, цефотаксима, полимиксина В, ампициллина, гентамицина и нистатина в комплексе друг с другом в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21. Определены варианты сочетания и оптимальные концентрации указанных антибиотиков, не вызывающие морфологических изменений и не снижающие продуктивности данной клеточной линии.
Summary. Cytotoxicity of ciprofloxacin, cefotaxime polymyxin B, ampicillin, gentamicin and nystatin in combination with each other was evaluated in the suspension culture of "BHK-21" cells. Combination variants and optimal concentrations of these antibiotics which don't cause morphological changes and don't reduce cell line productivity are determined.
Введение
В ветеринарной практике для профилактики микробной контаминации и лечения ее последствий используют различные группы антибиотиков, обладающих определенной безопасностью и высокой эффективностью в отношении большинства грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий, грибов и микоплазм. Спектр показаний к профилактическому и терапевтическому применению антибактериальных препаратов не ограни-
чивается перечисленными выше причинами, что актуализирует существующую проблему, которая должна основываться не только на диапазоне активности антибиотика, но и на профиле безопасности его использования (то есть практические рекомендации).
В последнее время в ветеринарии стали применять антибиотики, принадлежащие к классам фторхинолонов, цефалоспоринов, по-лимиксинов в сочетании друг с другом, а также с пенициллинами и аминогликозидами [1, 8].
Выраженным бактерицидным действием в отношении микоплазм, а также грампо-ложительных и грамотрицательных микроорганизмов из группы фторхинолонов обладает ципрофлоксацин, который активно ингибирует ДНК-гиразу, нарушая репликацию ДНК и синтез клеточных белков бактерий. Для эукариот данный антибиотик проявляет низкую токсичность, что объясняется отсутствием в них бактериальной ДНК-гира-зы [7]. По данным исследований Rodriguez, Ridgway, Schmitt и др. [1], при культивировании клеточных линий животных высокую активность против микоплазм проявляет именно ципрофлоксацин. Так, Fisher и др. [9] доказали его эффективность в рабочей дозе 10 мкг/см3 против Mycoplasma hyorhinis, M. gallisepticum, M. orale и др.
Широким бактерицидным действием обладает цефотаксим, антибиотик Ш-го поколения цефалоспоринового ряда, который вызывает гибель некоторых грамположи-тельных и большинства грамотрицательных микроорганизмов, устойчивых к В-лактазам, а также к другим цефалоспоринам и пени-циллинам [6]. Механизм противомикроб-ного действия цефотаксима заключается в ингибировании ферментов, участвующих в синтезе биохимических структур мембраны микроорганизма, что вызывает нарушение целостности клетки с последующими нарушениями метаболических процессов [5, 6].
Высокую активность в отношении грамо-трицательных бактерий, а также плесневых грибков и микоплазм проявляет полипептидный антибиотик полимиксин В, представляющий собой смесь полимиксинов В1 и В2, продуцентом которых является бактерия Bacillus polymyxa. Данный антибиотик присоединяется к липиду А цитоплазматической мембраны бактерий и грибов, нарушая тем самым ее проницаемость [6].
Ампициллин, полусинтетический В-лак-тамный антибиотик III-го поколения с аминогруппой, присоединенной к молекуле пенициллина, ингибирует синтез белковых структур в стенках бактерий за счет перекрестного сшивания пептидогликанов путем инактивации транспептидаз на внутренней поверхности клеточной мембраны.
Ампициллин активен в отношении грам-положительных, а также некоторых грамотрицательных микроорганизмов, спирохет и актиномицетов, устойчивых к бензилпе-нициллину [5, 6].
Среди аминогликозидов высокую активность в отношении микроорганизмов проявляет гентамицин, оказывающий бактери-остатическое воздействие на микоплазмы, протеи и бактерии, устойчивые к пенициллину. Механизм противомикробного действия гентамицина обусловлен нарушением правильного считывания кодонов путем связывания с протеином L6-рибосомальной субъединицы 50S, а также блокировкой транспорта пептидил^РНК от 30S акцепторного участка к донору [6].
Выраженное фунгицидное действие против дрожжевых и плесневых грибов, а также активность в отношении микоплазм отмечается у нистатина, принадлежащего к группе по-лиенов. Нистатин увеличивает проницаемость клеточных мембран чувствительных грибков и микоплазм путем связывания со стеролами мембран, что вызывает их гибель [6].
Одновременное применение двух и более антибиотиков может оказывать цито-токсическое действие. Цитотоксичность представляет собой гибель клеток, при которой не происходит запуск естественных механизмов клеточной смерти. При этом возможно проявление одного из двух цитоцидных механизмов: 1) апоптоз, при котором происходят аутолитические процессы, характеризующиеся долитической фрагментацией геномной ДНК, агрегацией клеток с их последующей фрагментацией; 2) некроз, при котором наблюдаются флок-куляция хроматина, потеря целостности мембраны, заметное увеличение размеров и в дальнейшем дезинтеграция клеток. Следует отметить, что цитотоксичность носит дозозависимый характер и является продукт-специфичной [7].
Цель исследования заключалась в оценке цитотоксичности ципрофлоксацина, це-фотаксима, полимиксина В, ампициллина, гентамицина и нистатина в сочетаниях друг с другом в разных дозах в суспензионной культуре клеток ВНК-21.
Материалы и методы
Тест-система. Для оценки общей ци-тотоксичности антибиотиков в качестве тест-системы применяли суспензионную перевиваемую клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) с посевной концентрацией (0,7-1060,8-106) клеток/см3.
Антибиотики. Исследовали общую цито-токсичность антибиотиков в сочетаниях друг с другом с разными дозами, указанными в таблице 1. Значения оптимальных концентраций антибактериальных препаратов, применяемых в
отдельности, определены по итогам ранее проводимых исследований [4]. В качестве контроля использовали ростовую среду, содержащую набор антибиотиков с общепринятыми концентрациями: бензилпенициллин (90 мкг/см3), не-омицин (175 мкг/см3) и нистатин (10 мкг/см3) [5, 6, 7].
Культивирование клеток. Суспензионное культивирование клеток линии ВНК-21 проводили в ростовой среде, содержащей комплекс протеиногенных аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов в сочетании с 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС)
Таблица 1
Сочетания антибиотиков с разными концентрациями, используемых в работе, для оценки их цитотоксичности в клеточной линии BHK-21
Вариант сочетания антибиотиков Название антибиотика Спектр действия антибиотиков в предложенных сочетаниях Концентрация антибиотика, мкг/ см3 (доза антибиотика, ЕД/ см3)
оптимальная для каждого антибиотика, взятого отдельно снижена в 2 раза снижена в 3 раза
№ 1 ампициллин большинство грам(+) и грам(-) бактерий, актино-мицеты, грибы 1500 (2400) 750 (1200) 500 (800)
цефотаксим 60 (55) 30 (27,5) 20 (18,3)
нистатин 10 (40)*** 10 (40) 10 (40)
№ 2 ампициллин грам(+) и некоторые грам (-) бактерии, микоплаз-мы, актиномицеты, грибы 1500 (2400) 750 (1200) 500 (800)
ципрофлоксацин 18 (-) 9 (-) 6 (-)
нистатин 10 (40) 10 (40) 10 (40)
№ 3 полимиксин В микоплазмы, грам(-) и некоторые грам(+) бактерии, грибы 20 (150) 10 (75) 6,7 (50)
гентамицин 200 (120) 100 (60) 66,7 (40)
нистатин 10 (40) 10 (40) 10 (40)
№ 4 цефотаксим грам (-) и некоторые грам(+) бактерии, микоплазмы, грибы 60 (55) 30 (27,5) 20 (18,3)
гентамицин 200 (120) 100 (60) 66,7 (40)
нистатин 10 (40) 10 (40) 10 (40)
№ 5* цефотаксим микоплазмы, грам(+) и грам(-) бактерии, грибы 60 (55) 30 (27,5) 20 (18,3)
ципрофлоксацин 18 (-) 9 (-) 6 (-)
нистатин 10 (40) 10 (40) 10 (40)
№ 6** полимиксин В микоплазмы, грам (-) бактерии, некоторые грам (+) бактерии. грибы 13 (100) 10 (75) 7 (54)
ципрофлоксацин 18 (-) 9 (-) 6 (-)
нистатин 10 (40) 10 (40) 10 (40)
контроль пенициллин большинство грам(+) и грам(-) бактерий, грибы 90 (150)
неомицин 175 (112)
нистатин 10 (40)
Примечание:
«*» - данные о соотношении концентрации и дозы антибиотиков в литературе не указаны; «**» - опубликованные сведения о совместимости данных антибиотиков отсутствуют; «***» - концентрацию нистатина сохраняли неизменной.
и 0,2 % гидролизата белков крови (ГБК) [2]. Выращивание клеток осуществляли в стеклянных флаконах объёмом 500 см3, помещенных в термостатируемый шейкер со скоростью перемешивания суспензии (150±5) об./мин при температуре (37,0±0,5) °С. Водородный показатель (рН) клеточной суспензии поддерживали в диапазоне (7,0-7,2) с помощью стерильного 7,5 % раствора гидрокарбоната натрия. Объем суспензии клеток в каждом из флаконов составлял 300 см3. Пересев клеток проводили через каждые 48 ч в течение 7-ми последовательных пассажей.
Культуральные флаконы с клеточной суспензией разделяли на 7 групп: 6 опытных (клетки выращивали в среде с указанными в таблице 1 сочетаниями и дозами антибиотиков) и контрольную группу с антибиотиками (культивирование клеток проводили в ростовой среде с добавлением следующих антибиотиков: бензилпенициллина (90 мкг/см3), неомицина (175 мкг/см3) и нистатина (10 мкг/см3).
Количественный метод оценки действия антибиотиков на культуру клеток.
Действие антибиотиков на суспензионную клеточную линию ВНК-21 оценивали по их влиянию на жизнеспособность клеток, культивируемых в ростовых средах при добавлении исследуемых антибактериальных препаратов. Для определения жизнеспособности клеток на протяжении 7-ми последовательных пассажей проводили количественный анализ, который заключался в подсчете количества живых и мертвых клеток с помощью счетной камеры Горяева. Интенсивность роста и развития оценивали по кратности прироста (Кпр), пользуясь формулой Кпр = а/Ь, где а - концентрация живых клеток через 48 ч после посева, Ь - посевная концентрация.
Прижизненное наблюдение за морфологическим состоянием клеток.
Качественную оценку влияния антибиотиков на клеточную линию ВНК-21 проводили в процессе наблюдения за морфологическим состоянием клеток под инвертированным микроскопом с использованием изотонического 0,4 % водного раствора трипанового синего с последующей фотофиксацией. Данный метод позволял визуально оценивать морфоло-
гию клеток по итогам их культивирования в условиях опыта и сравнивать с контролями.
Статистическая обработка данных. Исследование проводили в трех повторностях. Полученные данные статистически обрабатывали, вычисляя средние арифметические значения, степень достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фи-шера [3]. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2010. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,005.
Результаты и обсуждение
На начальном этапе проводили анализ влияния на суспензионную культуру клеток BHK-21 исследуемых антибиотиков в разных сочетаниях и концентрациях, определенных в качестве оптимальных с учетом их применения по отдельности (табл. 1). Оценивали влияние токсического действия ампициллина (1500 мкг/см3) в сочетании с цефотаксимом (60 мкг/ см3) (вариант № 1), а также ампициллина (1500 мкг/см3) с ципрофлоксацином (18 мкг/см3) (вариант № 2). По данным ранее проведенных исследований [4, 5, 6, 7], ампициллин характеризуется невысокой токсичностью, что позволило его тестировать в концентрации 1500 мкг/см3. В работе также исследовали действие на клетки полимиксина В (20 мкг/см3) в сочетании с гентамицином (200 мкг/см3) (вариант № 3) и с ципрофлоксацином (18 мкг/см3) (вариант № 6). Тестировали влияние цефотаксима (60 мкг/см3) в комплексе с гентамицином (200 мкг/см3) (вариант № 4) и ципрофлоксаци-ном (18 мкг/см3) (вариант № 5). Результаты серии экспериментов по оценке продуктивности клеток приведены в таблице 2 и на рисунке 2.
Из данных таблицы 2 следует, что по итогам 7-ми последовательных пассажей продуктивность клеток в экспериментальных образцах № 1, 2, 3, 4, 5, 6 была ниже в 7, 6, 26, 8, 13, 24 раз соответственно по сравнению с контролем, включающим стандартный набор антибиотиков.
Проводили оценку цитоморфологических различий в контрольных и опытных образцах. Контрольные клетки имели выраженную цитоплазматическую мембрану, четкую
Таблица 2
Влияние сочетания антибиотиков на кратность прироста клеточной линии BHK-21/2-17 (дозы оптимальны для каждого антибиотика в отдельности) (п=3, p<0,005)
Вариант сочетания антибиотиков Название антибиотика Концентрация антибиотика, мкг/см3 Значения Пкл через 48 ч после посева
после 1-го пассажа после 3-го пассажа после 7-го пассажа
№ 1 ампициллин 1500 0,94±0,06 0,80±0,04 0,70±0,05
цефотаксим 60
нистатин 10
№ 2 ампициллин 1500 1,15±0,04 0,97±0,05 0,83±0,03
ципрофлоксацин 18
нистатин 10
№ 3 полимиксин В 120 0,36±0,04 0,30±0,05 0,20±0,04
гентамицин 200
нистатин 10
№ 4 цефотаксим 60 0,84±0,06 0,72±0,06 0,67±0,05
гентамицин 200
нистатин 10
№ 5 цефотаксим 60 0,51±0,04 0,48±0,03 0,40±0,03
ципрофлоксацин 18
нистатин 10
№ 6 полимиксин В 13 0,45±0,04 0,34±0,05 0,22±0,05
ципрофлоксацин 18
нистатин 10
контроль пенициллин 90 5,32±0,05 5,28±0,04 5,20±0,04
неомицин 175
нистатин 10
оболочку ядра и характеризовались типичной для суспензионной линии ВНК-21/2-17 динамической округлой формой.
Наиболее близкими к контролю по этим морфологическим признакам были клетки варианта № 2 с ампициллином, ципрофлок-сацином и нистатином, но при этом был отмечен сильный цитостатический эффект.
Клетки остальных экспериментальных групп испытывали выраженное цитотокси-ческое действие, что проявлялось в активной клеточной гибели. После 1-го и 2-го пассажей наблюдали большое количество деформированных клеток с зернистой структурой, крупными вакуолями, что свидетельствовало об их плохом физиологическом состоянии. По итогам 2-го и 3-го пассажей отмечали агрегацию клеток, которая во время (4-7) пассажей сменялась доминированием апоп-тозных популяций культуры и некротических клеток.
Наибольшее токсическое действие было выявлено при использовании сочетания антибиотиков 3 (полимиксин В - 20 мкг/см3, ген-тамицин - 200 мкг/см3, нистатин - 10 мкг/см3). Наименьший цитотоксический эффект отмечали для варианта № 2 (ампициллин -1500 мкг/см3, ципрофлоксацин - 18 мкг/см3, нистатин - 10 мкг/см3).
Полученные результаты исследования послужили основанием для тестирования тех же сочетаний антибиотиков в уменьшенных дозах.
На следующем этапе работы суспензионную культуру клеток ВНК-21 выращивали в ростовой среде с теми же сочетаниями антибиотиков, но в дозах, сниженных в 2 раза относительно исходных значений (табл. 1). Оценку цитотоксического влияния антибиотиков на культуру клеток проводили в течение 7-ми последовательных пассажей, определяя продуктивность клеток через 24 и 48 ч
после посева, а также оценивая возможное появление цитоморфологических изменений и признаков микробной контаминации. Результаты исследования отражены в таблице 3 и на рисунках 1, 2.
В течение всех последовательных пассажей отмечали незначительное снижение Кпр внутри каждой экспериментальной группы (табл. 3). По итогам 7-ми пассажей продуктивность клеток, выращенных при использовании сочетания антибиотиков № 2, составляла (5,20±0,05), что соответствовало контрольным значениям. Прирост клеток ВНК-21 в экспериментальной группе № 1 был на 15 % выше по сравнению с контролем. Применение ростовой среды с вариантами сочетания антибиотиков № 3, 4, 5 и 6 относительно контроля вызывало снижение концентрации клеток на 7 %, 5 %, 9 % и 8 % соответственно.
Морфологическое состояние клеток линии ВНК-21, культивируемых в ростовых средах с разными вариантами сочетания антибиотиков в концентрациях, уменьшенных в 2 раза, представлено на рисунке 1.
Как видно на фотографиях, представленных на рисунке 2, клетки ВНК-21 в контрольной
группе имели типичную для них морфологию. Клетки, выращенные в экспериментальных средах со всеми сочетаниями антибиотиков с концентрациями, сниженными относительно исходных значений в 2 раза, характеризовались нормальным физиологическим состоянием, за исключением группы № 6. Наличие в ростовой среде полимиксина В, ципрофлоксацина и нистатина с концентрациями по 10 мкг/см3 каждого вызывало увеличение клеток и их вакуолей, потерю целостности цитоплазматической мембраны, появление зернистости содержимого клетки, что являлось признаком угнетения жизнеспособности (рис. 1Е).
Полученные данные позволили сделать вывод об отсутствии общей цитотоксично-сти комплексов антибиотиков в дозах, уменьшенных в 2 раза относительно исходных значений, для культуры клеток ВНК-21.
На заключительном этапе исследования тестировали те же сочетания антибактериальных препаратов в дозах, сниженных в 3 раза относительно исходных значений (табл. 1). Оценку влияния антибиотиков на клеточную культуру проводили, как описано выше. Результаты исследования продемонстрированы на рисунке 2.
Таблица 3
Оценка кратности прироста клеток суспензионной линии BHK-21, выращенных в средах с различными группами антибиотиков в концентрациях, сниженных в 2 раза
относительно исходных значений (п=3, p<0,005)
№ пассажа Время учета результата, ч Значения продуктивности клеток в исследуемых образцах
№ 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 контроль
1 24 2,67±0,05 2,32±0,06 1,86±0,05 2,20±0,07 1,97±0,04 1,95±0,04 2,38±0,04
48 6,15±0,08 5,35±0,06 4,92±0,06 5,08±0,06 4,85±0,05 4,95±0,09 5,32±0,05
2 24 2,66±0,06 2,31±0,08 1,85±0,07 2,19±0,08 1,96±0,08 1,94±0,07 2,35±0,04
48 6,13±0,07 5,33±0,04 4,96±0,08 5,06±0,04 4,83±0,04 4,92±0,06 5,31±0,06
3 24 2,65±0,07 2,30±0,08 1,84±0,08 2,19±0,07 1,98±0,08 1,92±0,06 2,33±0,04
48 6,12±0,05 5,32±0,05 4,96±0,07 5,08±0,05 4,82±0,05 4,91±0,05 5,28±0,04
4 24 2,56±0,06 2,23±0,04 1,78±0,06 2,12±0,04 1,87±0,04 1,90±0,08 2,24±0,04
48 6,09±0,05 5,29±0,04 4,93±0,05 5,03±0,04 4,79±0,08 4,88±0,04 5,25±0,05
5 24 2,53±0,08 2,20±0,07 1,76±0,07 2,09±0,07 1,85±0,07 1,85±0,07 2,23±0,04
48 6,04±0,04 5,25±0,05 4,90±0,04 4,99±0,04 4,76±0,05 4,85±0,04 5,25±0,05
6 24 2,51±0,06 2,18±0,07 1,74±0,06 2,06±0,07 1,85±0,07 1,82±0,07 2,20±0,04
48 6,03±0,06 5,25±0,06 4,88±0,09 4,97±0,05 4,75±0,06 4,82±0,06 5,23±0,07
7 24 2,45±0,05 2,15±0,05 1,72±0,06 2,04±0,05 1,83±0,06 1,79±0,06 2,18±0,04
48 6,00±0,07 5,20±0,05 4,86±0,06 4,95±0,07 4,73±0,05 4,80±0,05 5,20±0,06
щж
©о
I
о
о
о
о
о
о
а
с
о
о о
8
о
о
о
О
е о
о
© о О
О
О О
о о
о
О о с
в
о о 0 б
<г> 0© 0
о о °о0 о о о Со о
г
© 0 о Г\
0 ||| о с/ 0 ° ^
0О о
о о
о о| о
0 0 о
О о о
& О #
О о 0 о
# * 0
© о о о ж Чо° °
о о о о
о
о о °
Рис. 1. Морфология клеток линии ВНК-21, выращенных в среде с сочетаниями антибиотиков № 1 (А), № 2 (Б), № 3 (В), № 4 (Г), № 5 (Д), № 6 (Е) с концентрациями, сниженными в 2 раза относительно исходных значений, и в контроле (Ж) после 7-го пассажа (*20).
При использовании предложенных сочетаний антибиотиков с дозами, сниженными в 3 раза относительно исходных, отмечали высокую продуктивность клеток суспензионной линии ВНК-21. На протяжении 7-ми последовательных пассажей в экспериментальных пробах с вариантами сочетания антибиотиков № 3, 5 и 6 Пкл составляла (5,21±0,05), (5,20±0,05), (5,19±0,07) соответственно, что приравнивалось к контрольным показаниям - (5,20±0,06). Прирост клеток в опытных группах № 1, 2 и 4 превышал значения контроля на 38 %, 17 % и 12 % соответственно. Таким образом, при введении в ростовую среду предложенных сочетаний антибиотиков со сниженными в 3 раза концентрациями Кпр находилась на уровне показаний контроля или превышала их. При этом наибольшую активность роста и деления клеток наблюдали в экспериментальной группе № 1 (ампициллин - 500 мкг/см3, цефотаксим - 20 мкг/см3, нистатин - 10 мкг/см3).
Проводили оценку морфологического состояния суспензионных клеток линии ВНК-21, выращенных в средах со снижением дозы антибиотиков в 3 раза относительно исходных значений. По результатам прижизненного наблюдения за клеточной культурой выявили, что в контроле и во всех экспериментальных образцах клетки имели характерную для них морфологию: выраженную цитоплазматическую мембрану, четкие контуры ядра, одинаковый размер, нахождение всех клеток в одной фазе митоза. В суспензиях отсутствовали увеличенные клетки с нарушением целостности мембраны, избыточным количеством вакуолей и зернистым содержимым.
Заключение
Проведенное исследование показало возможность использования клеток суспензионной линии ВНК-21 в качестве тест-системы для сравнительной оценки цитотоксического действия сочетаний антибиотиков из групп фторхинолонов, цефалоспоринов, полимик-синов, полиенов, пенициллинов и аминогли-козидов в разных концентрациях. Представленные в работе результаты исследований по оценке цитотоксичности ампициллина, ци-
s б
S
5 4 ¡- _
о —
¡2 з
0.7 »-83-
ш ш
Варианты сочетания антибиотиков в ростовой среде (исходные концентрации)
4.73 ¿i
Варианты сочетания антибиотиков в ростовой среде (концентрации снижены в 2 раза относительно исходных значений)
Варианты сочетания антибиотиков в ростовой среде (концентрации снижены в 3 раза относительно исходных значений)
Рис. 2. Оценка кратности прироста клеток суспензионной линии ВНК-21 после 7-ми пассажей в контрольной и опытных средах с разными сочетаниями антибиотиков и их концентрациями (А - исходные значения концентраций, Б - концентрации снижены в 2 раза относительно исходных значений, В - концентрации снижены в 3 раза относительно исходных значений).
профлоксацина, цефотаксима, полимиксина В, гентамицина и нистатина in vitro демонстрировали, что данные препараты отличались по своему цитотоксическому влияни-ию. Выявлены сочетания антибиотиков и их концентрации, при которых отсутствовал общий цитотоксический эффект (при высоком бактерицидном действии), а клетки имели высокую степень эффективности при репродукции клеток:
1) ампициллин (500 мкг/см3), цефотаксим (20 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3);
2) ампициллин (500 мкг/см3), ципрофлок-сацин (6 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3);
3) полимиксин В (6,7 мкг/см3), гентами-цин (66,7 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3);
а
б
в
4) цефотаксим (30 мкг/см3), гентамицин (66,7 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3);
5) цефотаксим (20 мкг/см3), ципрофлокса-цин (6 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3);
6) полимиксин В (7 мкг/см3), ципрофлок-сацин (6 мкг/см3), нистатин (10 мкг/см3).
Предложенные сочетания антибиотиков в указанных дозах возможно применять в профилактических целях в ветеринарной вирусологии и биотехнологии изготовления биопрепаратов.
Список литературы
1. Абашева Е.С., Хамзина Е.Ю. Использование ципрофлоксацина и зинаприма при культивировании клеток МДБК // Матер. Межд. науч.-исслед. конф. ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемииг. Покров, 2008. С. 3-4.
2. Бабик В.А. Культивирование суспензионной линии клеток BHK-21 (с-13) / В.А. Бабик, К.Э. Чаплыго, Т.П. Кураш, А.А. Гусев // Эпизоотология. Иммунология. Фармакология. Санитария. 2009. № 1. С. 63-70.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
4. Доронин М.И. Использование ампициллина, ципрофлоксацина, цефотаксима и полимикси-на В для профилактики микробной контаминации клеточной линии BHK-21/2-17 / М.И. Доронин, А.А. Шишкова, Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин, Н.Д. Клюкина / Сб. Тр. ФГБУ "ВНИИЗЖ", 2017. С. 159-176.
5. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) ; под ред. Дьяконова Л.П. М.: Спутник+, 2009. 656 с.
6. Жуленко В.Н., Горшков Г.И. Фармакология : учебник для студ. вузов, обуч. по спец. «Ветеринария». М.: КолосС. 2008. 512 с.
7. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток : практическое руководство ; пер. 5-го англ. изд. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2011. С. 158.
8. Benko M. A heteroploid permanent cell line originating from embryonic calf thyroid supporting the replication of all known bovine adenovirus serotypes / M. Benko, A. Bartha, K. Mostl, F. Burki // Veterinary Microbiology. 1989. V. 19. Iss. 4. P. 317-324.
9. Fischer O. Use of Ciprofloxacin for Decontamination of LSCC-H 32 Cell Line of Chicken Embryona Fibroblasts Contaminated by Mycoplasma arginini / O. Fischer, M. Hajkova, Z. Hoiinova [et al.] // Acta vet. Bmo. V. 61. 1992. P. 51-56.
