CC BY
114
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК 579.61: 579.261:579.222.3
© С.В. Гиззатуллина, К.А. Лукманова, Н.Ф. Галимзянова, А.И. Мелентьев, Г.Э. Актуганов, Г.Е. Ефимов, Н.Х. Салихова, Т.В. Кайданек, 2010
С.В. Гиззатуллина1, К.А. Лукманова2, Н.Ф. Галимзянова3, А.И. Мелентьев3,
Г.Э. Актуганов3, Г.Е. Ефимов2, Н.Х. Салихова1, Т.В. Кайданек2 ОЦЕНКА ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВОГО ПРОТИВОГРИБКОВОГО СРЕДСТВА,
СОДЕРЖАЩЕГО ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ИБ-54 1ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат», г. Уфа 2ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа 3 Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа
Изучена безопасность антимикотического штамма Bacillus subtilis ИБ-54 в тестах определения острой токсичности, реакции гиперчувствительности «замедленного» типа и сенсибилизирующего действия жидкой бактериальной культуры. Биологическая активность препарата на основе данного штамма, оценена на модели зоофильного дерматомикоза. Проведенные испытания доказали безопасность B. subtilis ИБ-54, наличие противогрибковой активности in vivo и эффективность биопрепарата на его основе при профилактике и лечении дерматомикозов.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, Trichophyton gipseum, дерматомицеты, острая токсичность, противогрибковая активность.
S.V. Gizzatullina, K.A. Lukmanova, N.F. Galimzianova, A.I. Melentiev,
G.E. Aktuganov, G.E. Efimov, N.H. Salihova, T.V. Kaidanek THE EVALUATION OF TOXIC-PHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF NOVEL ANTIMYCOTIC DRUG, CONTAINING BACTERIAL STRAIN BACILLUS SUBTILIS ИБ-54
The safety of antimycotic strain of Bacillus subtilis IB-54 was studied in estimation tests of acute toxicity, reaction of “delayed” hyperresponsiveness and sensitizing action of liquid bacterial culture. The biologic activity of the preparation on base of the strain is evaluated in model of animal dermatomycosis. The carried out studies evidenced safety of B. subtilis IB-54 and occurrence of anti-mycotic activity in this strain in vivo and effectiveness of the preparation on its base at prevention and therapy of dermatomycoses.
Key words: Bacillus subtilis, Trichophyton gipseum, dermatomycetes, acute toxicity, antimycotic activity.
Дерматомикозы являются широко рас- поиска естественных антагонистов дермато-
пространенными инфекционными заболева- фитов являются бактерии рода Bacillus, ши-
ниями, которыми страдают, по данным раз- роко применяемые в качестве пробиотиков [2,
личных авторов, от 20 до 70 % взрослого на- 3, 7]. На основе ряда штаммов бацилл разра-
селения России [12]. В дерматологии для ле- ботаны также средства наружного действия,
чения грибковых поражений кожи использу- например ранозаживляющие препараты [6],
ются химически синтезированные соедине- что указывает на принципиальную возмож-
ния, обладающие серьезными противопоказа- ность их использования в создании новых
ниями и побочными эффектами, кроме того, средств лечения дерматомикозов [8]. В Ин-
курс лечения ими длителен и недешев [4]. Со- ституте биологии УНЦ РАН были выделены и
кращение применения синтетических антими- изучены штаммы эндоспорообразующих бак-
котиков системного и местного действий при терий - антагонистов микроскопических гри-
индивидуальной терапии дерматомикозов бов [9]. Направленный поиск среди них анта-
может быть достигнуто за счет расширения гонистов дерматомицетов выявил наиболее
спектра альтернативных средств, в частности перспективный штамм Bacillus subtilis ИБ-54
биологических препаратов, не обладающих [5].
побочным эффектом. Опыт успешного при- Целью данной работы являлось изуче-
менения биопрепаратов на основе микроорга- ние токсико-фармакологических характери-
низмов для лечения ряда инфекционных забо- стик штамма B. subtilis ИБ-54, а также оценка
леваний и коррекции дисбиотических состоя- эффективности применения биопрепарата на
ний свидетельствует о перспективности поис- его основе на модели дерматомикоза у лабо-
ка штаммов бактерий для борьбы с дермато- раторных животных.
мицетами [1, 3, 10]. Удобным объектом для
Материал и методы
Объектом исследования был штамм B. subtilis ИБ-54, выделенный и идентифицированный в Институте биологии УНЦ РАН и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). В качестве тест-объекта использовали зоофиль-ный штамм Trichophyton gipseum. Культуральную жидкость (КЖ) штамма получали его выращиванием в питательной среде следующего состава (г/л): (NH^HPO^ 1,0; KH2PO4,
1,0; K2HPO/3H2O, 1,0; MgSO4*7H2O, 0,2; пептон, 2,0; дрожжевой экстракт, 5,0; кукурузный экстракт, 3,0; глицерин, 5,0. Культивирование осуществляли в конических колбах на установке УВМТ-12-250 в течение 48 ч при 36,5±0,5°С и 165 об/мин. Среднее значение достигаемого титра бактериальных клеток в КЖ составляло 109 КОЕ/мл.
В качестве экспериментальной лекарственной формы использовали гель на основе карбопола (Ultres 21) с оптимизированным составом [6], содержащим клетки и экзометаболиты B. subtilis ИБ-54 (не менее 107 КОЕ/г).
Исследование острой токсичности жидкой культуры B. subtilis ИБ-54 проводили на белых мышах обоего пола весом 16,0 - 20,0 г. Животных распределяли на 3 группы (1 - контрольная и 2 - опытные). Исследуемую культуральную жидкость вводили внутрибрю-шинно в терапевтической (107 КОЕ/мл) и 100-кратной дозах (109 КОЕ/мл) из расчета 5 мл/кг массы тела животных. Животные контрольной группы получали 0,9 % раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме. Через 24 часа и 14 суток после окончания введения препарата равные количества животных из каждой группы подвергали одномоментной декапита-ции, производили забор крови для гематологических исследований, после чего определяли весовые коэффициенты органов [11].
Изучение реакции гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) проводили на группе мышей путем их сенсибилизации. ГЗТ оценивали по индексу воспалительной реакции. Для этого в основание хвоста мышей вводили 0,06 мл исследуемой культуральной жидкости B. subtilis ИБ-54, контрольной группе мышей вводили 0,06 мл стерильного 0,9 % раствора хлорида натрия. Через 5 суток мышам опытной группы в подушечку задней левой лапы вводили 0,04 мл изучаемой культуральной жидкости, мышам контрольной группы вводили стерильный 0,9 % раствор хлорида натрия в том же объеме. Интенсивность воспалительной реакции учитывали через 24 часа, для чего мышей забивали, обе
задние лапки ампутировали на уровне голеностопного сустава и взвешивали [11].
Исследование сенсибилизирующего действия культуральной жидкости штамма B. subtilis ИБ-54 и биопрепарата на его основе в тесте активной кожной анафилаксии в нашей модификации проводили на 30 белобоких морских свинках массой 200-250 г путем 20 повторных накожных аппликаций на выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища размером 2x2 см по 5 раз в неделю. В контрольной группе животным наносили
0,9 % раствор хлорида натрия. Спустя 20 суток проводили тестирование, вводя внутри-кожно на интактном выстриженном участке кожи 0,05 мл соответствующего препарата и для контроля реактивности - на другом выстриженном участке внутрикожно 0,05 мл растворителя. Через 20 мин внутривенно вводили по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Спустя 30 минут животных забивали эфиром и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата (при положительной реакции диаметр пятна не менее 6 мм) [11].
Изучение эффекта препарата на модели дерматомикоза лабораторных животных (белые мыши) проводили в соответствии с методическими указаниями по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ [11]. В качестве инфицирующего агента использовали суспензию спор 7-суточной культуры Trichophyton gipseum, выращенной на среде Сабуро (не менее 107 КОЕ на 1 мл). Заражение производили нанесением и втиранием 0,05 мл суспензии спор на выстриженные и скарифицированные участки кожи (2х2 см) на боковой поверхности туловища животных. Регистрацию результатов проводили с 3-го по 30-й день. В первой серии опыта препарат применяли со следующего дня после заражения. В качестве препарата сравнения использовали синтетическое средство «Экзодерил» (1% крем) фирмы “Sandoz”. Контрольная группа животных получала гелевую основу (карбопол) без B. subtilis ИБ-54. Во второй серии опытов лечение препаратом начинали при возникновении инфекционного процесса. Через 15 суток заболевших мышей рандомизировали на три группы: 1-я группа -животные продолжали получать гелевую основу без B. subtilis ИБ-54, 2-ю группу мышей лечили с применением испытуемого биопрепарата, при лечении 3-й группы использовали экзодерил. Критерием эффективности препарата было различие в сроках излечения подопытных и контрольных групп животных, ко-
торое характеризовалось исчезновением клинических проявлений дерматомикоза (чешуек, корочек, участков без пушка, обломанных волосков) и появлением волосяного покрова на пораженных участках.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета STATISTICA 6.0 фирмы StatSoft. В зависимости от вида распределения признака (по тесту Шапиро-Вилка) использовали следующие критерии параметрической и непараметрической статистики: средняя арифметическая и ее стандартная ошибка, медиана, нижний и верхний квартили, непарный критерий Стьюдента, в трех группах - с поправкой по К. Бонферро-ни, при асимметричном распределении - критерий Манна-Уитни. Достоверными считали различия между сравниваемыми выборками при уровне достоверной вероятности 95% (p<0,05).
Результаты и обсуждение
Ранее нами была продемонстрирована способность штамма B. subtilis ИБ-54 сильно подавлять in vitro рост и развитие грибов-дерматофитов [9]. В опытах на животных штамм не обнаруживал вирулентных, токсичных и токсигенных свойств [5], что позволило использовать его для дальнейших доклинических испытаний в качестве основы гелевого биопрепарата наружного действия.
В экспериментах по определению острой токсичности при однократном внутри-брюшинном введении терапевтической и 100-кратной терапевтической дозы культуральной жидкости B. subtilis ИБ-54 гибели животных не наблюдалось. Общее состояние и масса тела мышей опытных и контрольных групп не отличались. Двигательная активность (метод "открытого поля") и исследовательский рефлекс у испытуемых животных оставались в пределах нормы (табл.1). В гемограмме (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты) животных отклонений не выявлено (табл. 2).
Изучение реакции гиперчувствительности «замедленного» типа показало, что в контроле индекс реакции составил 1,5%, в опыте (под действием культуральной жидкости) -2,8 %. В обеих группах индекс воспалительной реакции не выходил за рамки положительной реакции (5,0 %), то есть исследуемая культуральная жидкость не обладает аллергическим действием.
При изучении сенсибилизирующего действия культуральной жидкости штамма B. subtilis ИБ-54 и биопрепарата на его основе, диаметр окрашенного пятна не превысил 2 мм. Это свидетельствует об отсутствии аллер-
гизирующих свойств штамма и биопрепарата при накожном применении.
Таблица 1.
Влияние культуральной жидкости B. subtilis ИБ-54 на двигательную активность и исследовательский _____________рефлекс мышей (п=10)________________
Группы животных Сроки исследо- вания Число пересеченных квадратов Число исследуемых отверстий
1-я (контроль) 24 часа 10,6 ± 2,8 16,9 ± 2,1
14 суток 9,4 ± 1,8 15,2 ± 2,7
2-я (терапевтическая) 24 часа 9,9 ± 1,4 18,1 ± 2,8
14 суток 9,7 ± 1,6 13,6 ± 3,0
3-я (100-кратная терапевтическая) 24 часа 12,9 ± 2,9 18,0 ± 2,4
14 суток 10,7 ± 3,3 17,4 ± 3,7
При статистической обработке данных с использованием критерия Манна-Уитни для всех групп животных значения Иэмп находились в зоне незначимости (отсутствие статистически значимых различий между показателями контрольной и опытных групп).
Таблица 2.
Влияние культуральной жидкости B. subtilis ИБ-54 на морфологические показатели крови белых мышей (п =10)
При статистической обработке данных с использованием критерия Манна-Уитни для всех групп животных значения Иэмп находились в зоне незначимости (отсутствие статистически значимых различий между показателями контрольной и опытных групп).
Таблица 3.
Сроки выздоровления животных, зараженных T. gipseum
Группа Исходные 7 суток 14 суток 21 сутки 30 суток
животных больные/ здоровые больные/ здоровые больные/ здоровые больные/ здоровые больные/ здоровые
1-я кон- 6/0 6/0 5/1 3/3 2/4
трольная
2-я опытная 6/0 4/2 2/4 0/6 0/6
3-я сравнения (экзо-дерил) 6/0 3/3 3/3 0/6 0/6
Оценка специфической активности разработанного противогрибкового биопрепарата на модели зоофильного дерматомикоза показала, что в течение срока наблюдения в группах, получавших профилактическое лечение исследуемым препаратом и экзодерилом, больные животные не выявлены (первая серия опыта). В контрольной группе заболели все животные. Поражение характеризовалось появлением на поверхности оголенных участков, шелушащихся очагов, покрытых чешуйками, обламыванием стержней волосков, в отдельных случаях встречались папулы, изменение цвета кожи в очагах болезни до темно-бордового цвета. Во второй серии опытов в группах, получавших лечение биопрепаратом на основе B. зчЫШз ИБ-54 и экзодерилом, на 21-е сутки наступало излечение всех жи-
Группы животных Сроки иссле- дования Гемоглобин, г/л Эритроци- ты, млн/мкл Лейкоциты, тыс/мкл
1-я (контроль) 24 часа 13,1 ± 0,14 4,95 ± 0,26 3,76 ± 0,28
14 суток 13,07 ± 0,03 6,68 ± 0,15 4,08 ± 0,20
2-я (терапевтическая) 24 часа 13,2 ± 0,12 4,94 ± 0,24 3,10 ± 0,18
14 суток 13,0 ± 0,06 6,30 ± 0,17 3,45 ± 0,23
3-я (100-кратная терапевтическая) 24 часа 13,1 ± 0,19 5,24 ± 0,2 3,52 ± 0,34
14 суток 13,03 ± 0,03 6,18 ± 0,23 3,67 ± 0,26
вотных, тогда как в группе получавших лече- В эксперименте на модели дерматоми-
ние гелевой основой биопрепарата больными коза у лабораторных животных показана ан-
животные оставались до 30 суток. Сроки из- тимикотическая активность нового биопрепа-
лечения животных представлены в табл. 3. рата in vivo.
Сходные результаты были получены и при Полученные результаты доказывают
проведении испытаний на морских свинках. перспективность использования B. subtilis ИБ-
Заключение 54 для создания противогрибкового препарата
Таким образом, проведенные доклини- наружного применения.
ческие испытания культуральной жидкости Работа поддержана грантом РФФИ №
штамма B. subtilis ИБ-54 и биопрепарата на 10-04-97031-р_поволжье_а.
его основе свидетельствуют об отсутствии токсического и аллергизирующего действий.
Сведения об авторах статьи:
Гиззатуллина Светлана Вадимовна - микробиолог ФГУП «НПО «Микроген». E-mail: saperka@inbox.ru Лукманова Клара Абдулловна - д.м.н., старший научный сотрудник ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет». Тел.: (347)2236679. E-mail: dissovetkm@mail.ru
Галимзянова Наиля Фауатовна - к.биол.н., старший научный сотрудник учреждения Российской Академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН. Тел.: (347)2355704. E-mail: galnailya@yandex.ru
Мелентьев Александр Иванович - д.биол.н., директор учреждения Российской Академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН. Тел.: (347)2356247. E-mail: mlnt@anrb.ru
Актуганов Глеб Эдуардович - к.биол.н., старший научный сотрудник учреждения Российской Академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН. Тел.: (347)2355704. E-mail: gleakt@anrb.ru
Ефимов Георгий Емельянович - д.м.н., профессор ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет». Тел.: (347)2723400. E-mail: epidefim@mail.ru
Салихова Найля Халяфовна - заведующая контрольно-аналитической лабораторией ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат». Тел.: (347)2533200.
Кайданек Тамара Вячеславна - доцент, ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет».
Тел.: (347)2723400. E-mail: kaidaneck@yandex.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко, В.М. Характеристика и терапевтический потенциал пробиотиков по данным клинических испытаний // Биопрепараты. - 2007. - №1. - С. 11-15.
2. Волков, М.Ю. Метаболиты Bacillus subtilis как новые перспективные пробиотические препараты / М.Ю. Волков, Е.И. Ткаченко, Е.В. Воробейчиков [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2007. - №2. - С. 75-80.
3. Гринько, О.М. Выделение и изучение перспективного пробиотического штамма спорообразующих бактерий рода Bacillus / О.М. Гринько, В.В. Зверев, А.А. Калошин [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - №3. - С. 85-89.
4. Лещенко, В.М. Лечение онихомикозов ламизилом / В.М. Лещенко, Г.М. Лещенко // Вестник дерматологии и венерологии. - 1998. - № 2. - С.61-64.
5. Лукманова, К. А. Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus в отношении грибов дерматофитов / К.А. Лукманова, С.В. Гиззатуллина, Р.Ш. Магазов [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - № 4. - С.21-23.
6. Лукманова, К.А. Ранозаживляющий препарат в виде геля / К.А. Лукманова, Ф.Н. Зайнутди-нова, Г.В. Аюпова [и др.]. Патент РФ №2322996, МПКА61К35/74. 2006.
7. Михайлова, Н.А. Лечебно-профилактический биопрепарат «Бактиспорин» / Н.А Михайлова, Т.Н. Кузнецова, О.В. Кунягина. Патент РФ №2130316, МПКА61К35/74. 1999.
8. Мухамадеева, О.Р. Антимикотическая активность препарата-пробиотика «Бактиспорин» in vitro и его использование в комплексном лечении зооантропонозной трихофитии: дис... канд. мед. наук. - Уфа, 2005.
9. Мелентьев, А.И. Подавление развития некоторых грибов-дерматофитов штаммами Bacillus subtilis in vitro / А.И. Мелентьев, Н.Ф. Галимзянова, О.Р. Мухамадеева [и др.]: тез. докл. II Все-рос. конгресса «Успехи медицинской микологии», 24-25 марта 2004 года Москва. - М., 2004. -С. 69-70.
10. Пушкарев, А.М. Использование антагонистических свойств бактерий Bacillus subtilis в терапии госпитальной инфекции мочевых путей / А.М. Пушкарев, В.Г. Туйгунова, Р.Р. Зайнул-лин [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2007. - №2. - С. 90-93.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./ под ред. Р.У. Хабриева. - М., 2005. - 832 c.
12. Сергеев, А.Ю. [и др.] Онихомикозы: на пути к решению проблемы / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // Consilium Medicum. - 2003. - Т. 5, №3. - С. 128-135.
