CC BY
135
УДК 579.64:633.111:577.175.1. [48+557]
КОЛОНИЗАЦИЯ РИЗОСФЕРЫ ПШЕНИЦЫ ШТАММАМИ BACILLUS SUBTILIS С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНИНОВ
© Л. Ю. Кузьмина*, Т. Н. Архипова
Институт биологии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 69.
Тел.: +7 (347) 235 62 47 *Email: ljkuz@anrb.ru
Изучена колонизация поверхности корня (ризопланы) проростков пшеницы интродуциру-емыми штаммами Bacillus subtilis IB-21 и IB-22, различающихся по способности к продукции цитокининов, и аборигенными бактериями. Большая доза внесения препаратов бацилл — 109 КОЕ/растение определяла высокую плотность популяции интродуцированных бактерий в ри-зоплане (108—109 КОЕ/г корней). При меньшей дозе обработок (105—106 КОЕ/семя или 0.2 кг/т семян) численность популяции интродуцированных штаммов в ризоплане составляла 106 КОЕ/г. Количество аборигенных бактерий в ризоплане составляло 108 КОЕ/г, вне зависимости от штамма бацилл и метода инокуляции. Внесение в ризосферу пшеницы клеток B. subtilis IB-22 вызвало значительные изменения в содержании цитокининов в растениях, сопровождающееся ростстимулирующим эффектом. Напротив при обработке штаммом B. subtilis IB-21 — содержание цитокининов в растениях не отличалось от контроля, а рост-стимулирующий эффект был выражен слабо.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, цитокинины, пшеница, колонизация, ростстимулиру-
ющий эффект.
Применение бактерий для обработки семян или растений, с целью повышения устойчивости растений к болезням и повышения урожайности сельскохозяйственных культур, рассматривается как направление связанное с экологически чистой технологией производства продуктов питания [3, 7]. Бактерии рода Bacillus Cohn являются перспективными агентами защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, продуцентами фитогормонов, обладают способностью к фосфат-мобилизации, имеют высокую приспособляемость и выживаемость в неблагоприятных условиях. Однако, применение бациллярных препаратов в сельскохозяйственной практике зачастую оказывается малоэффективным. Главную причину неудач в таких случаях объясняют не изученностью поведения бацилл в ризосфере обрабатываемых растений [6, 8].
В настоящей работе была поставлена задача, исследовать приживаемость бацилл, обладающих различной специфичностью по продукции цитоки-нинов в корневой системе проростков пшеницы.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований служили два штамма бацилл из коллекции Института биологии УНЦ РАН: Bacillus subtilis IB-22 - обладающий способностью к продукции цитокининов [5] и мобилизацией фосфора из органических соединений и B. subtilis IB-21 - не продуцирующий фитогормонов. Эффективность инокуляции семян и численность бацилл в ризосфере и ризоплане изучали на проростках пшеницы (Triticum durum L.) сорта Безен-чукская 139.
Изучение колонизации бациллами прикорневой зоны пшеницы проводили в вегетационных опытах при разных методах внесения бактерий:
поливом культуральной жидкостью растений и обработкой семян сухим препаратом.
Семена пшеницы не стерилизовали для сохранения аборигенной микрофлоры семян. Песок для выращивания растений просеивали, промывали и прокаливали. Растения выращивали в сосудах объемом 500 см3. В каждый сосуд помещали по 10 семян растений. Влажность поддерживали весовым методом регулярным поливом стерильной водопроводной водой. Растения выращивали на све-топлощадке с 14 ч режимом освещения при 90 Вт/м2.
Препараты бактерий культивировали в колбах на ротационных качалках (п = 120 об/мин-1) при 37 С в течение 72-96 ч на среде КШ, содержащей 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0; кукурузный экстракт — 1.0; 1.0; К2НРО4ЗН2О — 1.0; дистил-- 1 л; рН в среде — 7.6—7.8.
При инокуляции бацилл в корневую систему растений использовали 72 ч культуры. Препарат вносили в виде культуральной жидкости с титром клеток 109 КОЕ/мл.
Сухие препараты для инокуляции семян получали высушиванием культуральной жидкости (96 ч) на лиофильной сушилке «Иней 3-2». Инокуляцию зёрен препаратом бактерий производили в колбах в присутствии прилипателя ^-карбокси-метилцеллюлозы (0.01%). При использовании сухих препаратов бацилл их применяли в дозе 0.2 кг/т семян, что соответствовало численности интродуцированных бактерий на семени — 105—106 КОЕ.
Корневую систему трех — суточных растений для варианта обработки культуральной жидкостью анализировали через два часа и на четвертые сутки после обработки. В другом варианте опыта числен-
(г/л): крахмал -пептон — 4.0; NaH2PO4-2HiO -лированная вода
ность бактерий определяли на семени и на шестые сутки выращивания растений.
Корни с прилипшим грунтом, стерильно отделяли от растений, помещали в ступку и увлажняли 100 мл водопроводной стерильной воды. Затем отмытые корни извлекали крючком, а смытый песок — ризосферный грунт и воду переносили в колбы. Для микробиологического анализа поверхности корней (ризопланы) их вносили стерильно в ступку с кварцевым песком и легко растирали, а затем помещали в колбы со 100 мл водопроводной воды. Колбы с грунтом или корнями встряхивали в качалках в течение 20 мин.
Численность интродуцированных и аборигенных бактерий определяли методом разведений и посевом на картофельный агар. Через 3 суток инкубирования в термостате при 37 °С подсчитывали количество выросших колоний и пересчитывали на численность колониеобразующих единиц (КОЕ) в расчете на 1 зерно, 1 г массы сухих корней или грунт. Численность интродуцированных бацилл анализировали на семенах, в ризосфере (грунте прилипшем к корневой системе) и ризоплане (на поверхности корневой системы).
В опытах с инокуляцией растений культураль-ной жидкостью бацилл через 42, 78 и 144 часа после внесения препаратов определяли динамику содержания цитокининов в корнях и побегах, а также производили оценку показателей развития (сырой, сухой вес побега и длина растений). Содержание цитокининов (сумма зеатина, зеатинрибозида, зеа-тиннуклеотида, изопентениладенина, зеатин-О-глюкозида) определяли методом ИФА после спиртовой экстракции растительного материала, очистки на картридже С18 и разделении с помощью тонкослойной хроматографии [2].
Результаты исследований и их обсуждение
В проведенных микровегетационных опытах использовали разные дозы и способы внесения
препаратов. При использовании препаративной формы в виде рабочего раствора - «культуральной жидкости» способом полива применяли дозу — 1 мл на растение. Эта доза и форма внесения препарата на основе штамма В. subtilis 1В-22 была эффективно апробирована в лабораторных микровегетационных опытах на растениях пшеницы и салата [1, 4].
В сельском хозяйстве при применении бактериальных препаратов в жидкой форме методом полива используют дозы 0.5—1% рабочего раствора (из препаративной формы) в количестве 200— 2000 л/га в зависимости от сельскохозяйственной культуры. Препаративную форму сухих микробиологических препаратов получают из порошка микробной биомассы, в состав которого входят жизнеспособные клетки микроорганизмов и продукты метаболизма (фитогормоны, внеклеточные ферменты, антибиотические вещества и т.д.) и наполнители (носители или биоудобрения), в соотношении 1:20.
В варианте внесение по 1 мл культуральной жидкости на растение пересчет на дозы по рабочему раствору для жидких форм дает расход — 17 600 л/га, что в 350 раз превышает общепринятые дозы использования биопрепаратов.
В опыте при инокуляции семян сухими препаратами бацилл доза внесения составляла 0.2 кг/т семян, что соответствует дозам промышленных препаратов с наполнителями — 4 кг/т и соотносится с общепринятыми нормами использования биопрепаратов 0.4—4 кг/т семян.
В табл. 1 представлены данные по колонизации интродуцируемыми бациллами прикорневой зоны (ризосферы) и корневой системы (ризопланы) при разных дозах и способах внесения бактериальных клеток в корневую систему пшеницы. Как следует из представленных данных (табл. 1) во всех вариантах интродукции бацилл и без обработок наблюдалась высокая численность аборигенных и
Таблица 1
Численность аборигенных и интродуцированных бактерий на поверхности корня (ризоплане) пшеницы и в ризосферном грунте
при инокуляции препаратов В. subtilis на семени или в прикорневую зону
106 КОЕ/семя (г сухих корней или грунт)
в Й Время, КОЕ/ Контроль B. subtilis IB-21 B. subtilis IB-22
я & §■с © часов аборигенные интродуцирован-ные аборигенные интродуцирован-ные аборигенные
§ Ö & §
й ! £
°!
Г1 u
и &
0* 2
96 0
144
растение г грунта г грунта + корней г грунта
г корней
семя г грунта г корней
нд нд
4.43 ± 2.58 7.85 ± 3.02 197.46 ±78.19
0.001 ± 0.0005
7.75 ± 0.98 271.45 ± 127.59
2891.58 ± 125.63 48.18 ± 15.14
32.04 ± 12.51
34.83 ± 10.92
1947.27 ± 398.49
0.61 ± 0.07 0.01 ± 0.007 1.75 ± 0.08
нд нд
9.99 ± 4.79
19.37 ± 7.19 185.86 ± 97.39 0.001 ± 0.0005 1.01 ± 0.29 172.61 ± 87.71
1718.76 ± 371.61 28.65 ± 11.39
50.99 ± 22.19
43.92 ± 17.92
161.32 ± 56.38
1.33 ± 0.14 0.12 ±0.07 7.04 ±2.15
нд нд 0.001 ± 0.0005 17.49 ± 6.99 635.84 ± 225.38 0.001 ± 0.0005 5.28 ± 1.14 243.76 ± 78.73
Величина численности бактерий расчетная по количеству внесенного препарата бацилл; нд - нет данных.
интродуцированных бактерий в ризоплане по сравнению с ризосферой. В вариантах обработок растений культуральной жидкостью бацилл численность интродуцированных бактерий в ризоплане была в 4-56 раз больше чем в ризосферном грунте, а для аборигенных бактерий это соотношение составляло 10-36 раз.
В случае обработки растений сухими препаратами бацилл численность интродуцированных и аборигенных бактерий в ризоплане была в 40-170 раз больше чем в ризосферном грунте.
При внесении препаратов бацилл методом полива культуральной жидкостью через два часа численность аборигенных бактерий на корнях во всех вариантах обработок была того же порядка, что и в контроле (табл. 1). Однако, на четвертые сутки после внесения бацилл численность аборигенных бактерий в грунте около корней возрастала на порядок. Увеличению численности аборигенных бактерий на корнях растений способствует внесение микробных метаболитов, содержащихся в культу-ральной жидкости.
На четвертые сутки после полива растений культуральной жидкостью численность бацилл в ризосфере (грунте), примыкающей к корням, оставалась неизменной. В тоже время в ризоплане количество интродуцированных бацилл возрастало в десятки и сотни раз (табл. 1).
При инокуляции семян сухими препаратами бацилл, через шесть суток выращивания растений, интродуцированные штаммы колонизировали ри-зоплану в численности 106 КОЕ/г корней и обнаруживались в ризосфере 104-105 КОЕ/г грунта (табл. 1).
Оба исследуемых штаммов штамма бацилл, в т.ч. продуцент цитокининов В. subtilis 1В-22 и штамм, не обладающей способностью к продукции фитогормонов — В. subtilis 1В-21, при разных дозах и способах использования препаратов, успешно колонизировали корневую систему пше-
ницы на ранних стадиях её развития. Следует отметить что использование штаммов даже в очень высокой дозе не вызывало угнетения растений как в этом опыте, так и в ранее проведенных экспериментах.
Было показано (табл. 2), что внесение в ризосферу пшеницы суспензии клеток цитокининпро-дуцирующего штамма В. subtilis 1В-22 в дозе 109 КОЕ/растение вызвало значительные изменения в содержании цитокининов в инокулированных растениях и, как следствие, наблюдался значительный ростстимулирующий эффект. Ростстимулирующее действие бактерий проявлялось в усилении роста листьев и в накоплении сырой и сухой массы растений (табл. 2). Тогда как интродукция штамма В. suЫШs 1В-21 не сопровождалась изменениями в содержании гормонов, а ростстимулирующий эффект был выражен слабо и был статистически недостоверным.
Полевые мелкоделяночные опыты с предпосевной обработкой семян препаратом из клеток и продуктов метаболизма цитокининпродуцирующих бактерий также показывали повышение продуктивности растений. В зависимости от дозы обработки (105-107 КОЕ/семя) урожай пшеницы увеличивался на 40-70% (рис.). Повышение урожая складывалось из увеличения количества подгона (в среднем на 62%), веса зерен в подгоне одного растения (93%), числа колосков (6%) и семян (15%) в главном колосе, массы 1000 семян (7%).
Таким образом, даже возможно непродолжительное присутствие в ризосфере растений цитоки-нинпродуцирующих микроорганизмов (из-за вытеснения в дальнейшем интродуцированных микроорганизмов аборигенной микрофлорой) приводит к значительным положительным последствиям для роста и урожая как за счет притока цитокининов в растение, стимуляции выработки эндогенных фито-гормонов, так и за счет создания благоприятного микробного сообщества.
Таблица 2
Динамика содержания цитокининов в корнях и побегах, показатели развития (сырой, сухой вес побега и длина растений)
при инокуляции растений пшеницы бактериальными суспензиями штаммов В. subtilis в прикорневую зону
Варианты Час после обработки
48 72 144
ЦК, нг/г сырого веса Сырой вес, мг/ растение Сухой вес, мг/ растение Длина первого листа, мм ЦК, нг/г сырого веса ЦК, нг/г сырого веса Сырой вес, мг/ растение Сырой вес, мг/ растение Длина листьев
Корень/ побег Корень / побег Корень / побег 1 2
Контроль 656750/ 110 14.2 121.0 ^^ 202 23.6 219.6 116.0
53 7 32 4 39 0 /
1В-21 ^9 116 13.4 120.5 /42347 3299°2' 212 23.5 223.4 117.5
103 1* / .. 23 5 / 292* /
1В-22 ЛЛ ' 130** 13.2 125.3 1;.; ; 2,9,2 *' 233** 25.8** 226.7** 124.4** 62.9 90.2 42.5
ЦК - цитокинины; контроль - не инокулированные растения; 1Б-21, 1В-22 - штаммы В. subtilis, непродуцирующий и продуцирующий цитокинины соответственно; * и ** - различия по сравнению с контролем достоверны с вероятностью более 95% по критерию Стьюден-та (п=9) и (п=25) соответственно.
2,5 2 1,5 • 1
0,5 0
□ Контроль
□ IB-22 105 КОЕ/семя
□ IB-22 106 КОЕ/семя
□ IB-22 107 КОЕ/семя
Зёрен с главного Зёрен с подгонов, Урожай с делянки, колоса, г/растение г/растение кг/1.8*10-4 га
Рис. Урожайность пшеницы в полевом мелкоделяночном опыте при обработке семян суспензией штамма B. subtilis IB-22 в разных дозах.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 14-04-97049).
ЛИТЕРАТУРА
1. Архипова Т. Н., Веселов С. Ю., Кудоярова Г. Р. Влияние цитокининпродуцирующих микроорганизмов на рост растений салата при различном уровне их влагообеспеченно-сти // Агрохимия. 2003. №5. С. 36-41.
Веселов С. Ю. Использование антител для количественного определения, очистки и локализации регуляторов роста растений и их метаболитов: автореф. дис. ... д-ра. биол. наук. Уфа, 1999. 48 с.
Гарипова С. Р. Экологическая роль эндофитных бактер-ний в симбиозе с бобовыми растениями и их применение в растениеводстве // Успехи современной биологии. 2012. Т. 132. №5. С. 493-505.
Мартыненко Е. В. Влияние цитокининпродуцирующих бактерий рода Bacillus Cohn на рост растений салата и пшеницы: автореф. дис. ... к-та. биол. наук. Уфа, 2009. 22 с. Bacillus subtilis ИБ-22 продуцент цитокининов / Меленть-ев А. И., Кудоярова Г. Р., Веселов С. Ю., Архипова Т. Н., Гильванова Е. А., Усанов Н. Г., Кузьмина Л. Ю., Симонян М. В. Россия. Патент RU 2178970 C2, МПК A01N63/00. Заявл. 13.03.2000. Опубл. 10.02.2002. Бюл. № 4. С. 1-10. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of arabidopsis roots by Pseudomonas sy-ringae Is facilitated by biofilm formation and surfactin production // Plant Physiology. 2004. V. 134. P. 307-319. Compant S., Duffy B., Nowak J., Cle'ment C., Barka E. A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Applied and environmental microbiology. 2005, V. 71. No. 9. P. 4951-4959.
Gardener B. B. M. Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp. in agricultural systems // Phytopatology. 2004. No. 94. P. 1252-1258.
4.
Поступила в редакцию 23.09.2014 г.
COLONIZATION OF WHEAT RHIZOSPHERE BY BACILLUS SUBTILIS STRAINS PRODUCING DIFFERENT LEVELS OF CYTOKININS
© L. Y. Kuzmina*, T. N. Arkhipova
Institute of Biology of Ufa Scientific Centre of RAS 69 Oktyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 62 47.
*Email: ljkuz@anrb.ru
Wheat germs rhizoplane colonization by introduced Bacillus subtilis, strains IB-21 and IB-22, differencing in ability to cyto-kinin production, and aboriginal bacteria was studied. Large dose of treatment with bacillar preparations (109 CFU/plant) determined high density of introduced bacterial populations in rhizoplane (108-109 CFU/g of roots). Abundance of introduced bacteria in rhizoplane was 106 CFU/g at smaller treatment doses (105-106 CFU/seed or 0.2 kg/t of seeds). Number of aboriginal bacteria in rhizoplane was 108 CFU/g regardless of bacilli strains and method of treatment. Introduction of B. subtilis, strain IB-22 cells into wheat rhizosphere resulted to remarkable changes in cytokinin content in the plants accompanied with growth-promoting effect. In contrast, at treatment by B. subtilis, strain IB-21, cytokinin concentration in plants no differed with control plants and growth-promoting influence was mild.
Keywords: Bacillus subtilis, cytokinins, wheat, colonization.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Arkhipova T. N., Veselov S. Yu., Kudoyarova G. R. Agrokhimiya. 2003. No. 5. Pp. 36-41.
2. Veselov S. Yu. Ispol'zovanie antitel dlya kolichestvennogo opredeleniya, ochistki i lokalizatsii regulyatorov rosta rastenii i ikh metabo-litov: avtoref. dis. ... d-ra. biol. nauk. Ufa, 1999.
3. Garipova S. R. Uspekhi sovremennoi biologii. 2012. Vol. 132. No. 5. Pp. 493-505.
4. Martynenko E. V Vliyanie tsitokininprodutsiruyushchikh bakterii roda Bacillus Cohn na rost rastenii salata i pshenitsy: avtoref. dis. ... k-ta. biol. nauk. Ufa, 2009.
5. Bacillus subtilis IB-22 produtsent tsitokininov / Melent'ev A. I., Kudoyarova G R., Veselov S. Yu., Arkhipova T. N., Gil'vanova E. A., Usanov N. G, Kuz'mina L. Yu., Simonyan M. V. Rossiya. Patent Pp. 2178970 C2, MPK A01N63/00. Zayavl. 13.03.2000. Opubl. 10.02.2002. Byul. No. 4. Pp. 1-10.
6. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. Plant Physiology. 2004. Vol. 134. Pp. 307-319.
7. Compant S., Duffy B., Nowak J., Cle'ment C., Barka E. A. Applied and environmental microbiology. 2005, V. 71. No. 9. Pp. 4951-4959.
8. Gardener B. B. M. Phytopatology. 2004. No. 94. Pp. 1252-1258.
Received 23.09.2014.
