CC BY
0
DOI: 10.24412/2074-5036-2024-262-11-14 УДК: 579.62: 577.29
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, гены устойчивости, Escherichia coli, диско-диффузионный метод, плазмида
Key words: antibiotic resistance, resistance genes, Escherichia coli, disk diffusion method, plasmid
1,3Сыромятников М. Ю., 2Шабунин С. В., 1,3Нестерова Е. Ю., Чладких М. И., 2Манжурина О. А., 1Корнеева О. С., 2Михайлов Е. В.
ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ ПЕРЕДАЧИ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕТКАМИ ESCHERICHIA COLI ИЗ КИШЕЧНИКА ПОРОСЯТ С ПОМОЩЬЮ ПЛАЗМИД
ASSESSMENT OF THE ABILITY TO TRANSFER ANTIBIOTIC RESISTANCE BY ESCHERICHIA COLI CELLS FROM THE INTESTINES OF PIGLETS USING PLASMIDS
'ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет инженерных технологий». Адрес: 394036, Россия, Воронеж, пр. Революции, 19
Voronezh State University of Engineering Technologies. Address: 394036, Russia, Voronezh, Revolutsii Pr., 19 2ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии».
Адрес: 394087, Россия, Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy. Address: 394087, Russia, Voronezh, Lomonosova st., 114-b 3ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет». Адрес: 394018, Россия, Воронеж, Университетская пл., 1
Voronezh State University. Address: 394018, Russia, Voronezh, 1, Universitetskaya sq.
Сыромятников Михаил Юрьевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. Е-mail: mihan.vm@mail.rn
Syromyatnikov Mikhail Yurievich, PhD of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Metagenomics
and Food Biotechnologies. E-mail: mihan.vrn@mail.ru Шабунин Сергей Викторович, доктор ветеринарных наук, научный руководитель. Е-mail: svshabunin@rambler.ru Shabunin Sergey Viktorovich, Doctor of Veterinary Sciences, Scientific Supervisor. E-mail: svshabunin@rambler.ru Нестерова Екатерина Юрьевна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. Е-mail: katya.nesterova.1997@mail.ru Nesterova Ekaterina Yurievna, Junior Researcher of the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies. E-mail: katya.nesterova.1997@mail.ru Гладких Мария Ивановна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. Е-mail: mariya221095@yandex.ru Gladkikh Maria Ivanovna, Junior Researcher of the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies. E-mail: mariya221095@yandex.ru Манжурина Ольга Алексеевна, кандидат ветеринарных наук, заведующая лабораторией диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний. Е-mail: manol65@mail.ru Manzhurina Olga Alekseevna, PhD of Veterinary Sciences, Head of the Laboratory for Diagnostics of Infectious
and Invasive Diseases. E-mail: manol65@mail.ru Корнеева Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, заведующий кафедрой биохимии и биотехнологии. Е-mail: korneeva-olgas@yandex.ru Korneeva Olga Sergeevna, Doctor of Biological Sciences, Head of the Department of Biochemistry and Biotechnology. E-mail: korneeva-olgas@yandex.ru Михайлов Евгений Владимирович, кандидат ветеринарных наук, заведующий отделом экспериментальной
фармакологии. Е-mail: voronezh81@rambler.ru Evgeniy Vladimirovich Mikhailov, PhD of Veterinary Sciences, Head of the Department of Experimental
Pharmacology. E-mail: voronezh81@rambler.ru
Аннотация. Изучена возможность переноса генов резистентности к антибиотикам различных групп с помощью плазмид. В работе было использовано 20 антибиотиков, принадлежащих к 11 группам. Диско-диффузионный метод позволил провести фенотипическую оценку трансформации компетентных клеток Escherichia coli плаз-мидами, изолированными из штаммов E. coli кишечника поросят. Для 25 % антибиотиков (ампициллин, амокси-циллин, цефотоксим, цефоперазон и цефтиофур) передача антибиотикорезистености не была зарегистрирована. Передача устойчивости к остальным исследованным антибиотикам была установлена, но проявлялась в различ-
ной степени. Наиболее высокие уровни антибактериальной устойчивости были отмечены к тилозину, энрофлок-сацину, тетрациклину и левомицетину.
Summary. The possibility of transferring resistance genes to antibiotics of various groups using plasmids has been studied. 20 antibiotics belonging to 11 groups were used in the study. The disk diffusion method made it possible to carry out a phenotypic assessment of the transformation of competent Escherichia coli cells by plasmids isolated from E. coli strains of the gut of piglets. For 25 % of antibiotics (ampicillin, amoxicillin, cefotaxime, cefoperazone and ceftiofur), transmission of antibiotic resistance was not recorded. Transmission of resistance to the remaining antibiotics studied was established, but manifested itself to varying degrees. The highest levels of antibacterial resistance were noted for tylosin, enrofloxacin, tetracycline and chloramphenicol.
Введение
Изучение сложной организации кишечного микробиома свиней является основополагающим предметом ветеринарной науки, поскольку с ним напрямую связано здоровье поголовья [2]. Современные животноводческие комплексы внедряют антибиотикотерапию для лечения, профилактики и роста производительности на предприятиях [7]. Основной механизм действия антибиотиков направлен на подавление важных клеточных процессов: репликации ДНК, биосинтеза ключевых белков, ферментов, синтеза клеточной стенки и др. Несмотря на это, бактерии-патогены за длительный период применения антибиотиков смогли выработать широкий спектр вариантов устойчивости. Так, у бактерии Streptococcus suis сформировались целевые мутации генов к антибиотику, изменение проницаемости клеточной оболочки, а также различные модификации мишеней [11].
Некоторые устойчивые к антибиотикам бактерии вызывают большую озабоченность во всем мире, среди которых особенно выделяется Escherichia coli [4]. Показано, что колибациллез, возбудителем которого является E. coli, активно проявляется у поросят разных возрастных групп, в том числе подсосных, а также у новорожденных телят [6]. Именно это заболевание является наиболее частой причиной гибели молодого поголовья, тем самым вызывая серьезные экономические потери в хозяйствах [8]. Резистентность, сформированная у конкретной бактерии, может предаваться другим организмам с помощью мобильных генетических элементов, таких, как плазмиды [1]. Большое опасение для животноводства вызывает всё нарастающая устойчивость патогенов к антибиотикам тетрациклиновой группы, поскольку такая резистентность зачастую является плазми-доопосредованной [12]. Так, например, штаммы E. coli, полученные от больных колибактериозом бройлеров, характеризовались устойчивостью к тетрациклинам (не менее 95 % изолятов) [3]. Нерациональное применение антимикробных препаратов на птицеферме в Иране способствовало формированию множественной резистентности к ряду антибиотиков, при этом самый высокий уровень устойчивости был характерен для тилозина
(88 %) [10]. Использование энрофлоксацина у телят приводило к увеличению распространенности штаммов кишечной палочки, устойчивых к фтор-хинолам [9]. Аналогичные результаты были получены в исследовании действия данного препарата в терапии сальмонеллезной инфекции у птиц [5].
Важным является понимание степени передачи антибиотикорезистентности между бактериями с помощью плазмид. В связи с этим, целью исследования являлась оценка фенотипической резистентности E. coli к антибактериальным препаратам, а также возможности ее передачи с помощью плазмид.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования выступали 7 бактерий E. coli, выделенных из кишечника поросят возрастом 1-5 суток, а также компетентные клетки E. coli XL1-Blue («Евроген», Россия). Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом (ДДМ), который предусматривает использование стандартных дисков с антибиотиками.
Посев был осуществлен на питательную среду на чашки Петри, которые инкубировались в течение 24 часов. Экстракцию плазмидной ДНК из культуры клеток E. coli осуществляли коммерческим набором Plasmid Miniprep («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. Трансформацию компетентных клеток E. coli штамма XL1-Blue («Евроген», Россия) изолированными плазмидами проводили, согласно рекомендациям производителя («Евроген», Россия).
При определении чувствительности методом ДДМ использовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5 10 КОЕ/мл. Инокулюм использовали в течение 15 мин после приготовления. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром стандартный инокулюм наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1 мл. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Аппликацию дисков проводили не позднее чем через 15 мин после инокуляции, на
поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиком. В работе было использовано 20 разновидностей антибиотиков, принадлежащих к 11 группам: пенициллины (2), макролиды (1), полипептиды (1), амфениколы (1), рифамицины (1), аминогликозиды (2), нитрофураны (2), фторхино-лы (2), цефалоспорины (6), тетрациклины (1) и ка-тионоактивные полипептидные антибиотики (1).
После аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 35 °С в течение 24 ч. Учет результатов проводили после окончания инкубации. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм штангенциркулем (в соответствии с МУК 4.2.1890-04). В течение 24 часов чашки находились в инкубаторе для роста колоний. Регистрировали зону задержки роста (ЗЗР).
Дизайн эксперимента представлен на рисунке 1.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Statistica (tatSoft Inc., США). Различия анализировали с помощью дисперсионного анализа Anova и считали значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Был проведен анализ эффективности трансформации компетентных клеток E. coli плазми-дами. Передача резистености к ампициллину, амоксициллину, цефотоксиму, цефоперазону и цефтиофуру не была зарегистрирована. Исследуемые штаммы E. coli остались полностью чувствительны к перечисленным антибиотикам после трансформации. Интерпретация показателей зоны задержки роста для рифампицина позволила определить неэффективность данного антибиотика по отношению к исследуемым штаммам E. coli, поскольку «пороговое» значение зоны задержки роста превышало этот показатель для референтного штамма (таблица 1).
Таблица 1
Анализ ЗЗР для первой группы антибиотиков (высокая задержка роста), п = 7
Антибиотик ЗЗР для референта (E. coli XL1-Blue), мм ± SEM «Пороговая» ЗЗР для E. coli, мм ЗЗР для E. coli из кишечника, мм ± SEM ЗЗР для E. coli XL1-Blue после трансформации, мм ± SEM
Ампициллин 23 ± 2,1 17 0 ± 0,0 22 ± 0,9
Амоксициллин 20 ± 1,2 18 4 ± 2,1 21 ± 0,7
Рифампицин 16 ± 1,5 20 4 ± 2,0 13 ± 2,2
Цефотаксим >30 19 4 ± 3,7 23 ± 1,8*
Цефоперазон 27 ± 0,8 19 0 ± 0,0 22 ± 1,0*
Цефтиофур 24 ± 2,3 19 5 ± 3,2 22 ± 1,7
* - различия в ЗЗР E. coli XL1-Blue до и после трансформации статистически достоверны, p < 0,01
Среда с антибиотиками
Рис. 1. Дизайн эксперимента
Для остальных 14 антибиотиков трансформация оказалась успешной. Отличия заключались в различной степени сформировавшейся устойчивости к антимикробным препаратам (таблица 2).
Были зафиксированы статистические значимые различия для всех препаратов, кроме цефалексина и цефазолина. Наиболее высокие значения бактериальной устойчивости были характерны для тилозина, энрофлоксацина, тетрациклина и левомицетина. Зона задержки роста для данных препаратов не превышала 5 мм. К следующей группе можно было отнести 6 антибиотиков. Зона задержки роста для гентамици-на, стрептомицина, полимиксина, фурозолидона, норфлоксацина и доксициклина не превышала 10 мм. Рост колоний кишечной палочки на чашках Петри с такими антибиотиками, как фура-донин, цефалексин, цефокситин и цефазолин, был наименее активным. Зона задержки роста составляла 15 мм для нитрофуранового антибиотика и 17 мм для цефалоспоринов.
* - различия в ЗЗР E. coli XL1-Blue до и после трансформации статистически достоверны, p < 0,01; ** - различия в ЗЗР E. coli XL1-Blue до и после трансформации статистически достоверны, p < 0,05
Таблица 2
Анализ ЗЗР для второй группы антибиотиков (задержка роста менее 5 мм), п = 7
Антибиотик ЗЗР для референта (E. coli XL1-Blue), мм ± SEM «Пороговая» ЗЗР для E. coli, мм ЗЗР для E. coli из кишечника, мм ± SEM ЗЗР для E. coli XL1-Blue после трансформации, мм ± SEM
Тилозин 21 ± 1,9 21 0 ± 0,0 4 ± 2,5*
Тетрациклин 20 ± 2,4 18 6 ± 2,4 5 ± 1,9*
Левомицетин 22 ± 2,6 19 7 ± 2,5 5 ± 3,5*
Энрофлоксацин 27 ± 2,3 22 7 ± 3,3 4 ± 3,9*
Гентамицин 20 ± 1,8 17 8 ± 2,3 10 ± 3,5**
Стрептомицин 17 ± 1,3 16 5 ± 1,8 9 ± 3,3**
Полимиксин 20 ± 2,1 15 8 ± 2,3 7 ± 3,5*
Фуразолидон 18 ± 1,6 18 8 ± 2,0 8 ± 4,0**
Норфлоксацин 29 ± 3,1 17 8 ± 3,0 9 ± 4,4*
Доксициклин 22 ± 3,3 19 7 ± 1,3 6 ± 2,3*
Фурадонин 26 ± 2,1 17 14 ± 0,9 15 ± 4,0**
Цефалексин 21 ± 2,2 19 0 ± 0,0 17 ± 2,8
Цефокситин 21 ± 0,7 19 4 ± 2,6 17 ± 0,8*
Цефазолин 24 ± 2,6 18 8 ± 3,0 17 ± 3,1
Заключение
Проведена фенотипическая оценка резистентности бактерий E. coli и возможности ее передачи с помощью плазмид. Для ампициллина, амоксициллина, цефотоксима, цефоперазона и цефтиофура передача антибиотикорезистено-сти не была зарегистрирована. Для остальных 14 антибиотиков передача антибиотикорезисте-ности оказалась успешной. Отличия заключались в различной степени сформировавшейся устойчивости к антимикробным препаратам. Были детектированы статистические значимые различия для всех антибиотиков, кроме цефа-лексина и цефазолина. Таким образом, показано, что плазмиды позволяют осуществлять передачу клеткам E. coli антибиотикорезистено-сти к таким антибиотикам, как тилозин, тетрациклин, левомицетин, энрофлоксацин, гентами-цин, стрептомицин, полимиксин, фуразолидон, норфлоксацин, доксициклин, фурадонин, цефа-лексин, цефокситин.
Список литературы
1. Carattoli A. Plasmids and the spread of resistance / A. Carattoli // Int J Med Microbiol. 2013. V. 303. № 6-7. 298-304.
2. Isaacson R. The intestinal microbiome of the pig / R. Isaacson, H. Kim // Ani Health Res Rev. 2012. V. 13. № 1. P. 100-109.
3. Jahantigh M. Antimicrobial drug resistance pattern of Escherichia coli isolated from chickens farms with colibacillosis
infection / M. Jahantigh, R.E. Dizaji // OJMM. 2015. V. 5, № 4. P. 159.
4. Leekitcharoenphon P. Genomic evolution of antimicrobial resistance in Escherichia coli / P. Leekitcharoenphon, M. H. K. Johansson, P. Munk et al. // Sci Rep. 2021. V. 11. P. 15108.
5. Li J. Resistance and virulence mechanisms of Escherichia coli Selected by enrofloxacin in chicken / J. Li, H. Hao, M. Dai et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2019. V. 63, № 5. P. e01824-28.
6. Liu W. Frequency of virulence factors in Escherichia coli isolated from suckling pigs with diarrhoea in China / W. Liu, C. Yuan, X. Meng et al. // Vet J. 2014. V. 199, № 2. P. 286-9.
7. Loeb J. Aminoglycoside use rises in pig sector / J. Loeb, A. Gray // Vet Rec. 2021. V. 188, № 12. P. 450-451.
8. Luppi A. Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance / A. Luppi // Porcine Health Manag. 2017. V. 3. P. 16.
9. Pereira R. V. Genotypic antimicrobial resistance characterization of E. coli from dairy calves at high risk of respiratory disease administered enrofloxacin or tulathromycin / R. V. Pereira, C. Foditsch, J. D. Siler et al. // Sci Rep. 2020. V. 10, № 1. P. 19327.
10. Talebiyan R. Multiple Antimicrobial resistance of Escherichia coli Isolated from chickens in Iran / R. Talebiyan, M. Kheradmand, F. Khamesipour, M. Rabiee-Faradonbeh // Vet Med Int. 2014. V. 2014. P. 491418.
11. Uruen C. How Streptococcus suis escapes antibiotic treatments / C. Uruen, C. Garcia, L. Fraile, J. Tommassen, J. Arenas // Vet Rec. 2022. V. 53, № 1. P. 91.
12. Verraes C. Antimicrobial resistance in the food chain: a review / C. Verraes, S. Van Boxstael, E. Van Meervenne et al. // Int J Environ Res Public Health. 2013. V.10, № 7. P. 2643-69.
