CC BY
3УДК 579.89, 579.62
ОЦЕНКА ПАТОГЕННОГО ВЛИЯНИЯ ГЕННОМОДИФИЦИРОВАННЫХ ШТАММОВ S. TYPHIMURIUM14028S ARELA НА ОРГАНИЗМ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Миндолина Ю.В., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: yliamindolina@mail.ru
Лавренова М.А., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: marichka-20.07@mail.ru
Михайлова В.А., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: mihaylova.valerya@mail.ru
Научный руководитель: Плотников А.О., кандидат медицинских наук, доцент, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург
В статье представлены данные по оценке патогенного влияния генномодифицированных штаммов S. typhimurium 14028S ArelA на организм лабораторных животных. Особенностью исследуемых микроорганизмов является отсутствие у них гена, ответственного за синтез гуанозинтетрафосфата. По результатам эксперимента были сделаны выводы, что в организме лабораторных животных с первых суток шло активное размножение сальмонелл, и протекала острая бактериальная инфекция, а так же был проведен сравнительный анализ по изучаемым показателям с диким штаммом S. typhimurium 14028S WT. Полученные данные позволяют иметь представление о тяжести инфекционного процесса и влиянии на макроорганизм бактерий с отсутствующим геном ArelA.
Ключевые слова: Salmonella typhimurium, сальмонеллез, желудочно-кишечный тракт, патогенез, антибиотикорезистентность, гуанозинтетрофосфат, лейкоцитарный профиль.
Актуальность. Инфекционные болезни - большая группа заболеваний, которые вызываются патогенными возбудителями, и особое значение уделяется инфекционным поражениям желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Возбудителями данных заболеваний могут быть как патогенные, так и условно патогенные микроорганизмы. Для кишечных инфекций характерна локализация возбудителя в кишечнике, который проникает в организм алиментарным путем (через рот, чаще с пищей или водой). К основным симптомам заболеваний органов желудочно-кишечного тракта относятся изжога, отрыжка, тошнота, рвота, метеоризм, расстройство стула. Не неся за собой серьезной опасности для здоровья, данные симптомы значительно снижают работоспособность и влияют на общее состояние, однако в некоторых случаях могут переходить в хронические формы заболеваний [1].
Сальмонеллез - одно из острых кишечных заболеваний, характерным проявлением которого является энтероколит. Возбудитель данного заболевания - серовары Salmonella enterica, а прежде всего Enteritidis и Typhimurium, последний из которых наиболее часто выделяемый серовар сальмонелл. Возбудители сальмонеллеза в настоящее время объединены в семейство Enterobacteriaceae, род Salmonella, насчитывающий более 2200 серотипов. Сальмонеллы - это мелкие подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером в длину от 0,7 до 1,5 мкм, ширину от 2 до 5 мкм, спор и капсул не образуют. Патогенез сальмонеллеза зависит от количества проникших в организм сальмонелл, их вирулентности, а также от состояния иммунитета. Причинами возрастающего интереса к проблеме сальмонеллеза выступают глобальное распространения данного заболевания вследствие пренебрежения правилами личной гигиены, развитие вспышек внутри больниц, а так же антибиотикорезистентность микроорганизмов. В связи с этим интенсивно изучается
патогенез сальмонеллезной инфекции, в развитии которого участвуют различные гены, т.к. в результате изменчивости микроорганизмы часто приобретают вредные для человека свойства: повешенную вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Суть исследований заключается в том, чтобы оценить, как отсутствие того или иного гена повлияет на патогенные свойства бактерий. Характерной особенностью генномодифицированного штамма S. typhimurium 14028S ArelA является отсутствие у него гена, отвечающего за синтез гуанозинтетрафосфата (ффГфф). Гуанозинтетрафосфат (гуанозин-5'-дифосфат-3'-дифосфат), внутриклеточный регулятор метаболизма бактерий, оказывающий как позитивное, так и негативное воздействие на транскрипции многих генов, играет важную роль в вирулентности патогенных бактерий. В ряде исследований было показано участие ффГфф не только при выживании в периоды стресса, но и при взаимодействии бактерий с их хозяином [2 - 6].
На основании вышеизложенного перед нами была поставлена цель: изучить влияния генномодифицированных штаммов микроорганизмов на организм лабораторных животных.
Материалы и методы. Объектами исследования выступали S. typhimurium 14028S WT (дикий) и генномодифицированный штамм S. typhimurium 14028S ArelA. В качестве живой модели в эксперименте использовались белые лабораторные крысы чистой линии Wistar в количестве 45 животных, из которых были сформированы группы - аналоги (с учетом половой принадлежности, возраста и веса). Для эксперимента брали три группы животных по 15 особей в каждой группе. Первая группа (К0) включала в себя интактных животных, вторая (Ki) -группа заражения S. typhimurium 14028S WT, третья (О1) - опытная группа, в которой в качестве инфицированного агента применялся штамм S. typhimurium 14028S ArelA. Штаммы бактерий Salmonella typhimurium вводили перорально в дозе 1*109 КОЕ/мл.
Исследование проводилось на базе экспериментально - биологической клиники (вивария) Оренбургского государственного университета.
В задачи эксперимента входило проведение бактериологического анализа, которое включало определение КОЕ патогенных бактерий в фекалиях лабораторных животных, и изучение лейкоцитарного профиля крови. Отбор фекалий производился ежедневно, в течение двенадцати суток. Отобранный материал подвергался гомогенизации, после чего надосадочную жидкость высевали на среду Плоскирева в чашках Петри, в разведениях с 10-1 по 10-4. Инкубация занимала 24 часа при температуре 37 °С. После чего определяли число выросших колоний и подсчитывали количество КОЕ патогенных бактерий.
Подсчет лейкоцитарной формулы крови производили с помощью мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Подсчет проводили ближе к концу мазка в самом тонком месте, не менее 100 клеток (исключение составляют выраженные лейкопении), а затем выводили процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов.
Результаты и обсуждения. На первом этапе нашего исследования мы получили данные, свидетельствующие о развитии иммунных процессов в ответ на введение инфицирующих агентов. Динамику изменения КОЕ а фекалиях экспериментальных животных можно наблюдать на графике (рисунок 1).
По графику видно, что максимальные концентрации в обеих группах были достигнуты на первый же день эксперимента. Максимально значение в опытной группе составляет 58,99 х 105 КОЕ/г, что в 4,4 раза превышает показания в группе Ki. Далее наблюдается снижение КОЕ исследуемых микроорганизмов, как в первой, так и во второй группе. Минимальные значения сохраняются до заключительного дня эксперимента.
Рисунок 1. Динамика изменения КОЕ в фекалиях экспериментальных животных (Примечание: К1 - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; О1 - группа заражения S. typhimurium 14028S ArelA.)
Анализ морфологических показателей крови показал, что значительным изменениям подверглись палочкоядерные (ПЯ) и сегментоядерные (СЯ) нейтрофилы, лимфоциты и моноциты.
• КО -• — К1 —• Верхняя граница нормы • Нижняя граница нормы
25
0
0 3 6 9 12
Сроки исследования, сутки
Рисунок 2. Динамика изменения количества палочкоядерных нейтрофилов в крови экспериментальных животных (Примечание: К0 - контрольная группа; К1 - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; О1 - группа заражения S. typhimurium 14028S ArelA.)
На протяжении всего эксперимента показатели концентрации ПЯ нейтрофилов в обеих группах находятся выше верхней границы нормы, что видно из графика (рисунок 2). В группе К1 наблюдается постепенное возрастание показателей концентрации палочкоядерных нейтрофилов. В группе О1 концентрация ПЯ нейтрофилов на третий день эксперимента достигает своего максимума, после чего идет на снижение и доходит до верхней границы нормы к девятому дню, затем снова идет на повышение. Рост концентрации палочкоядерных нейтрофилов связан с необходимостью повышения уровня защиты организма и началом борьбы с инфекционными агентами.
Концентрация СЯ нейтрофилов в течение всего срока исследования находится в пределах нормы (рисунок 3). Исключение составляют максимальное и минимальное значение концентрации в группе О1, которые выходят за пределы границы нормы.
В обеих группах показатели концентрации лимфоцитов на протяжении всего эксперимента не выходят выше нижних пределов нормы (рисунок 4). В группе К1 до шестого дня происходит снижение показателей, затем на девятый день концентрация достигает своего максимума и к двенадцатому дню снова снижается. В группе О1 концентрация лимфоцитов с первого дня начинает уменьшаться, но после шестого дня эксперимента отмечается повышение в плоть до заключительного дня эксперимента. Изменение уровня лимфоцитов в организме в ту или иную сторону свидетельствует о развитии патологии.
На протяжении всего срока исследования значения концентрации моноцитов как в группе К1, так и в группе О1 находятся выше верхней границы нормы (рисунок 5). В группе К1 наблюдается увеличение концентрации вплоть до заключительного дня эксперимента. В группе О1 максимум приходится на девятый день, минимум - на двенадцатый. Концентрация моноцитов в крови возрастает при необходимости уничтожения возбудителей болезней, проникших в организм.
■К0 •
■К1
■О1
• Верхняя граница нормы
• Нижняя граница нормы
40
35
* 30 о н <и
§ 25
о ю
H 20
<и сг
§ 15
о «
\
\
10
у-----а-------А-----
Ф ♦
Ф
0
3
6
9 12
Сроки исследования, сутки
Рисунок 3. Динамика изменения сегментоядерных нейтрофилов в крови экспериментальных животных (Примечание: К0 - контрольная группа; К1 - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; О1 - группа заражения S. typhimurium 14028S ArelA.)
■К1
Верхняя граница нормы
80 70
К0 О1
к о т е л к
о в т с е
и л о
M
60
50
40
30
20
-Ф-
— -А Ф
0
3
6
9 12
Сроки исследования, сутки
Рисунок 4. Динамика изменения количества лимфоцитов в крови экспериментальных животных (Примечание: К0 - контрольная группа; Ki - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; Qi - группа заражения S. typhimurium 14028SArelA.)
К0 -• - К1 -А • Верхняя граница нормы -А- Нижняя граница нормы
0 3 6 9 12
Сроки исследования, сутки
Рисунок 5. Динамика изменения количества моноцитов в крови экспериментальных животных (Примечание: К0 - контрольная группа; Ki - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; О1 - группа заражения S. typhimurium 14028S ArelA.)
Выводы. В результате исследования было установлено, что в организме лабораторных животных развитие инфекционного процесса происходит с первого дня после заражения. Изменения показателей лейкоцитарного профиля свидетельствуют об активации иммунных реакций в ответ на проникновение инфекционных агентов.
Литература
1. Прозоркина, Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений / Н.В. Прозоркина, Л.А. Рубашкина. - Изд. 6-е, стер. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2012. - 151 с.
2. Пак, С.Г. Сальмонеллёз / С.Г. Пак, М.Х. Турьянов, М.А. Пальцев. - Москва: Медицина, 1988. - 304 с.
3. Козырева, В.К. Клональное распространение CTX-M-5-продуцирующих нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium в России, Беларуси и Казахстане / В.К. Козырева, М.В. Эйдельштейн, Д.В. Тапальский, И.С. Азизов, А.В. Романов, Р.С. Козлов // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2012. - Т. 14. - №1. - С. 3850.
4. Богуцкий, М.И. Сальмонеллёзная инфекция в современный период / М.И. Богуцкий, А.В. Васильев, В.М. Цыркунов // Медицинская панорама. - 2009. - № 7. - С. 3-4.
5. Дмитраченко, Т.И. Сальмонеллезы, клинико-эпидемиологические и микробиологические аспекты терапии / Т.И. Дмитраченко, В.М. Семенов. - Витебск: изд-во ВГМУ, 2001. - 148 с.
6. Braeken K., Moris M., Daniels R., Vanderleyden J., Michiels J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. - 2006. - Vol. 14. - pp. 45-54.
Научно исследовательская работа проводится в рамках гранта РФФИ «Молекулярно-генетические механизмы, обеспечивающие выживание и размножение протеобактерий в водных экосистемах», № проекта 14-04-01796.
