CC BY
3УДК 579.89, 579.62
ДИНАМИКА РАЗМНОЖЕНИЯ ШТАММА S. TYPHIMURIUM 14028S AYADF В
ОРГАНИЗМЕ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС
Михайлова В.А., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: mihaylova.valerya@mail.ru
Миндолина Ю.В., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: yliamindolina@mail.ru
Лавренова М.А., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: Marichka-20.07@mail.ru
Научный руководитель: Плотников А.О. к.мед.н., доцент, институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
В статье представлены данные по оценке патогенного влияния генномодифицированных штаммами S. typhimurium 14028S с отсутствующим геном AyadF на организм лабораторных животных. Особенностью исследуемых микроорганизмов является отсутствие у них гена, ответственного за синтез карбоангидразу. По результатам эксперимента были сделаны выводы, что в организме лабораторных животных с первых суток шло активное размножение сальмонелл, и протекала острая бактериальная инфекция, а так же был проведен сравнительный анализ по изучаемым показателям с диким штаммом S. typhimurium 14028S WT. Полученные данные позволяют иметь представление о тяжести инфекционного процесса и влиянии на макроорганизм бактерий с отсутствующим геном AyadF.
Ключевые слова: Salmonella typhimurium, сальмонеллез, желудочно-кишечный тракт, патогенез, антибиотикорезистентность, карбоангидраза.
В настоящее время много исследований связано с глобальным распространением сальмонеллеза, ростом заболеваемости, развитием внутрибольничных вспышек, антибиотикорезистентностью возбудителей, тяжестью течения локализованных форм и высокой летальностью при генерализованных формах. В настоящее время интенсивно изучается патогенез сальмонеллезной инфекции, в развитии которого участвуют различные гены.
Сальмонеллез - одно из острых кишечных заболеваний, характерным проявлением которого является энтероколит. Возбудитель данного заболевания - серовары Salmonella enterica, а прежде всего Enteritidis и Typhimurium, последний из которых наиболее часто выделяемый серовар сальмонелл. Возбудители сальмонеллеза в настоящее время объединены в семейство Enterobacteriaceae, род Salmonella, насчитывающий более 2200 серотипов.
Сальмонеллы - это мелкие подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером в длину от 0,7 до 1,5 мкм, ширину от 2 до 5 мкм, спор и капсул не образуют. Патогенез сальмонеллеза зависит от количества проникших в организм сальмонелл, их вирулентности, а также от состояния иммунитета. Причинами возрастающего интереса к проблеме сальмонеллеза выступают глобальное распространения данного заболевания вследствие пренебрежения правилами личной гигиены, развитие вспышек внутри больниц, а так же антибиотикорезистентность микроорганизмов. Характерной особенностью генномодифицированного штамма S. typhimurium 14028S AyadF является
отсутствие у него гена, отвечающего за синтез карбоангидразы. Карбоангидраза имеет важное значение для роста клеток в экстремальных условиях при отсутствии другой карбоангидразы СупТ в кишечной палочке [2 - 6].
На основании вышеизложенного перед нами была поставлена цель: изучить влияния генномодифицированных штаммов микроорганизмов на организм лабораторных животных.
В качестве модели гп \1\о в эксперименте были использованы лабораторные крысы линии Wistar в количестве 45 штук. Животные отбирались в соответствии общепринятых принципов подбора аналогов сходных по возрасту (четырехмесячные крысы), физиологическому состоянию, питанию и поведению, находившиеся в пределах физиологической нормы животных, живой массе (от 200 до 250 грамм), пол лабораторного животного - самцы.
Схема, по которой проводилось составление экспериментальных групп, представлена на рисунке 1.
Рисунок 1 - Схема составления экспериментальных групп из лабораторных животных
В задачи эксперимента входило проведение бактериологического анализа, которое включало определение КОЕ патогенных бактерий в фекалиях и органов - мишеней лабораторных животных. Отбор фекалий производился ежедневно, в течение двенадцати суток. Отобранный материал подвергался гомогенизации, после чего надосадочную жидкость высевали на среду Плоскирева в чашках Петри, в разведениях с 10-1 по 10-4. Инкубация занимала 24 часа при температуре 37 °С. После чего определяли число выросших колоний и подсчитывали количество КОЕ патогенных бактерий.
В качестве органов - мишеней были использованы печень и селезенка. Вскрытие лабораторных животных производилось следующим образом. Труп животного переворачивали на спину, лапы растягивали и фиксировали, шерсть передней половины туловища обрабатывали дезинфектантом, делали ножницами продольный разрез вдоль белой линии живота к конечностям. Кожу отпрепаровывали скальпелем. Вскрывали брюшную полость от разреза под линией диафрагмы до лонной кости, заменив инструменты.
Отобранные органы помещали в стерильную ступку, тщательно растирали пестиком, добавляли стерильный физиологический раствор и смешивали в гомогенную суспензию. Количество физиологического раствора зависит от взвешенного кусочка органа. Полученную суспензию петлей засевали на среду Плоскирева, которая является селективной средой для выделения шигелл и сальмонелл. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. После этого производят учет результатов выросших колоний. На среде Плоскирева колонии БаШопвПа ТурЫшиггиш имеют вид прозрачных или нежно-розовых колоний.
Результаты и обсуждения. По полученным результатам нами были составлены графики изменения КОЕ в фекалиях и органах-мишени лабораторных животных (рисунки 2,
3).
По данным графика видно, что пиковая концентрация в контрольной группе была достигнута на третий день эксперимента и составляет 18,5 х 105 КОЕ/г, напротив, в опытной группе максимальная концентрация достигалась лишь на третье сутки исследования. В
дальнейшем концентрация в обеих группах снижалась. На девятые сутки в опытной группе резко возрастает концентрация КОЕ и составляет 25,83* 105 КОЕ/г, что свидетельствует об активации процессов иммунной системы. В контрольной группе минимальные значения сохраняются до конца эксперимента.
По данным графика видно, что в контрольной группе начиная с третьего дня исследования, были зафиксированы признаки развития инфекционного процесса по средству выделения возбудителя инфекции из внутренних органов, совсем иное наблюдалось в опытной группе, более высокие значения были зафиксированы на шестые сутки.
На шестые дни эксперимента КОЕ исследуемых штаммов достигли своих пиковых концентраций, в той группе, где применялся штамм S. typhimurium 14028S WT - о чем свидетельствуют данные, представленные на графике, и их значения колебались в диапазоне от 66,5 * 10 до 72,23 * 105 КОЕ/г. В группе, S. typhimurium 14028S AyadF, максимальная концентрация достигается лишь на девятые сутки эксперимента, о чем свидетельствуют данные на графике в диапазоне от 84,5 * 105 до 105,5 * 105 КОЕ/г.
Рисунок 2 - Динамика изменения КОЕ в фекалиях экспериментальных животных (Примечание: К1 - группа заражения S. typhimurium 14028S WT; О1 - группа заражения S. typhimurium 14028S AyadF)
К двенадцатому дню эксперимента в обеих группах содержание исследуемых микроорганизмов в исследуемых тканях либо полностью отсутствовало (в группе О1), либо содержалось в минимальных количествах в печени и составило 1 * 105 КОЕ/г в группе К1.
Рисунок 3 - Динамика изменения КОЕ в органах-мишени экспериментальных животных (Примечание: К1 - группа заражения 8. typhimurium 140288 WT; О1 - группа заражения & typhimurium 14028S АуаёЕ)
Выводы. Исходя из результатов, исследования оценки патогенного влияния на организм дикого Salmonella typhimurium 14028S WT и генномодифицированного штаммов Salmonella typhimurium 14028S с удаленным геном AyadF по средству оценки выделения микроорганизмов из внутренних органов и фекалий, можно сделать вывод, что в группах Ki и О1 наблюдается развитие острого инфекционного заболевания и патологических изменений со стороны печени и селезенки.
Литература
1. Прозоркина, Н. В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений / Н. В. Прозоркина, Л. А. Рубашкина. - Изд. 6-е, стер. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2012. - 151 с.
2. Гавриш, В. Г. Сальмонеллезная инфекция у животных / В. Г. Гавриш. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. - 576 с.
3. Мельников, В. И. Ферменты патогенности и токсины бактерий / В. И. Мельников, М. Г. Гимранов. - Москва: Медицина, 2001. - 252 с.
4. Пак, С. Г. Сальмонеллёз / С. Г. Пак, М. Х. Турьянов, М. А. Пальцев. - Москва: Медицина, 1988. - 304 с.
5. Руководство по кишечным инфекциям (бактериальные, вирусные, протозойные, паразитарные и грибковые) / под ред. И. К. Мусабаева. - Ташкент: Медицина, 1980. - 725 с.
6. Руководство по инфекционным болезням / под ред. Ю. В. Лобзина, А. П. Казанцева. - Санкт-Петербург: ТИТ «Комета», 1996. - 720 с.
7. Богуцкий, М. И. Сальмонеллёзная инфекция в современный период / М. И. Богуцкий, А. В. Васильев, В. М. Цыркунов // Медицинская панорама. - 2009. - № 7. - С. 3-4.
Научно исследовательская работа проводится в рамках гранта РФФИ «Молекулярно-генетические механизмы, обеспечивающие выживание и размножение протеобактерий в водных экосистемах», № проекта 14-04-01796.
