CC BY
27
УДК 579.842.14:576.893.12
Балкин А.С.1, Черкасов С.В.12
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия 2 Оренбургский государственный университет, г. Оренбург, Россия E-mail: balkinas@yandex.ru
МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Acanthamoeba castellanii C БАКТЕРИЯМИ Salmonella enterica serovar Тyphimurium 14028S
Способность сальмонелл выживать и размножаться внутри клеток свободноживущих амеб обеспечивает бактериям возможность переживать неблагоприятные условия окружающей среды. Однако, многие аспекты, связанные с выживанием сальмонелл в окружающей среде и взаимодействием с эукариотами остаются малоизученными.
Изучено взаимодействие Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028S с клетками свободно-живущих амеб Acanthamoeba castellanii. Установлено, что бактерии данного штамма способны проникать и выживать внутри фагосом A. castellanii. Большая часть сальмонелл поглощается клетками амеб в течение первого часа сокультивирования. Цитотоксический эффект сальмонелл наблюдается в отношении акантамеб после 8 часов сокультивирования и достигает максимума через 16 часов.
Разработанная модель взаимодействия сальмонелл и акантамеб перспективна для изучения стратегии выживания патогенных микроорганизмов в условиях внешней среды. Данная модель может быть использована для оценки экспрессии генов сальмонелл при фагоцитозе простейшими.
Ключевые слова: Salmonella, Acanthamoeba, вирулентность, фагоцитоз.
Фагоцитоз у свободноживущих протестов представляет собой базовый механизм, как и у фагоцитирующих клеток человека, а условия внутри пищеварительной вакуоли простейших подобны условиям внутри фагосомы макрофагов [1]-[3]. Устойчивость внутриклеточных патогенов к перевариванию со стороны гетеротрофных протистов может способствовать их сохранению в природных очагах инфекции [4]. Доказано, что взаимодействия между патогенами и амебами участвуют в поддержании вирулентности бактерий [5], [6]. Изучение взаимодействия свободноживущих амеб и патогенов человека важно для раскрытия механизмов проникновения бактерий в человеческий организм и преодоления эффекта киллинга со стороны фагоцитов.
Целью наших исследований стало изучение взаимодействия свободноживущих амеб А. cаstellаnii и патогенных бактерий & еШепса 8егоуаг ТурЫшигшш, разработка оптимальной модели взаимодействия Ба1топеНа-Асап-ЛатоеЬа.
Материалы и методы
Штамм & еШепса 8егоуаг ТурЫшигшш 140288, любезно предоставленный к.б.н. Н. Е. Гоголевой (Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН), - факультативный внутриклеточный патоген, вызывающий гастроэнтериты у людей и домашних животных. Геном данного штамма полностью секвенирован [7].
Культура гетеротрофных простейших A. castellanii Neff (ATCC® 30010™) - представитель свободноживущих амеб, обитающих в почвах, водоемах, а также морских экосистемах, где они являются консументами бактерий [8]. Данный штамм является аксенической культурой.
Для культивирования амеб использовали среду PYG (20 г/л пептона, 1 г/л дрожжевого экстракта, 18 г/л глюкозы, 1 г/л цитрат натрия, 0.4 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, 2.5 мМ Na2HPO4, 2.5 мМ KH2PO4, 50 нМ Fe(NH4)2(SO4)2).
Для удаления внеклеточных сальмонелл, а также остатков среды, использовали центрифугирование при 900 об/мин с буферным раствором PAS (0.4 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, 2.5 мМ Na2HPO4, 2.5 мМ KH2PO4, 50 нM Fe(NH4)2(SO24)2). 4 2 4
Инфицирование амеб проводилось по методике Douesnard-Malo [9] с модификациями. Десятичасовая культура S. enterica serovar Typhimurium 14028S выращена на среде LB. Отмытые клетки бактерий помещали в суспензию амеб, сокультивировали в течение 1 часа, внеклеточные бактерии удаляли трехкратным центрифугированием с буфером PAS. В процессе фагоцитоза контролировалась численность жизнеспособных бактерий путем высева на плотную среду. Жизнеспособность амеб оценивали с использованием автоматического счетчика клеток NucleoCounter NC-200 (Chemometec), а также с помощью световой микроскопии. Про-
цесс фагоцитоза и количество поглощенных клеток оценивали флуоресцентной микроскопией с использованием витальных красителей LiveDead (Thermo Fisher). Статистическая значимость определялась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни [10].
Исследования проведены на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов».
Результаты исследований
В исследованиях была оценена динамика численности сальмонелл (рис. 1) и амеб, растущих при различной концентрации питательных веществ в среде. В результате было выявлено, что при инокуляции сальмонелл в среды 1/10 PYG (PYG:PAS = 1:10) и 1/5 PYG (PYG:PAS = 1:5) в первые 2 часа происходит адаптация клеток к новой среде, после чего наблюдается резкое возрастание численности сальмонелл. В свою очередь, при инкубировании на
фосфатно-солевом буфере (PAS) КОЕ сальмонелл в течение первых суток значительно не увеличивается.
Для амеб наблюдается схожая картина динамики численности жизнеспособных клеток. В первые часы эксперимента клетки амеб, помещенные в среду PAS, сохраняют свою жизнеспособность и численность, морфология клеток не претерпевает изменений. Инцистирование происходит только на 3-5 сутки.
Большая часть сальмонелл поглощается клетками амеб в первые минуты сокультиви-рования, после чего количество поглощенных клеток медленно растет. После 1 часа сокуль-тивирования наблюдается максимум поглощенных клеток. В дальнейшем, через 2 часа наблюдается рост популяции внеклеточно локализованных сальмонелл в среде, содержащей PYG. В среде PAS плотность популяции сальмонелл остается на уровне, зафиксированном на старте эксперимента. Установлено,
1,00Е+09
I 1,00 Е+08
ы О bd
SI 1,00 E+D7 О
1,00 Е+06
I............. ..............! А
■V А Т
0 12 4
•<■*■■■ 1/5 PYG
- -D ■ 1/10 PYG —О— PAS
t. часы
24
Рисунок 1 - Динамика численности сальмонелл при росте на питательных средах с различным содержанием органического углерода при 25°С. Ось абсцисс -количество сальмонелл, ось ординат - время инкубации
Таблица 1 - Определение жизнеспособности амеб после 2 часов совместного культивирования клетками сальмонелл при различной исходной плотности сальмонелл. Жизнеспособность амеб определяли с помощью автоматического счетчика клеток №с1еоСои^ег N0-200 (Chemometec)
Соотношение клеток амеб:сальмонелл Количество жизнеспособных амеб, в % log10 КОЕ/мл внутриклеточно локализованных сальмонелл log10 КОЕ/мл сальмонелл в супернатанте
1:0 (Контроль) 87,43±3,68 - -
1:10 82,27±1,78 3,36 -
1:100 81,9±5,45 4,56 -
1:1000 88,57±4,36 5,72 4,66
1:10000 86,3±1,89 6,75 5,66
Балкин А.С., Черкасов С.В.
Модель взаимодействияÄcanthamoeba castellanii..
что в первые часы сокультивирования гибель амеб под воздействием сальмонелл не наблюдается. Цитотоксическое действие сальмонелл на амебы начиналось приблизительно с 8 часа сокультивирования и через 16 часов достигало максимума, в среде культивирования наблюдалось множество амебных цист.
Для определения исходного оптимального соотношения клеток амеб и сальмонелл в среде была оценена жизнеспособность амеб после 2 часов сокультивирования с различным исходным титром сальмонелл при заражении (таблица 1).
Жизнеспособность амеб оценивали с помощью автоматического счетчика NucleoCounter NC-200, а также микроскопически с использованием витальных красителей. Концентрацию внутриклеточно локализованных сальмонелл определяли после троекратного центрифугирования, с последующим лизисом амеб с помощью 1% раствора додецилсульфата натрия, и высевом серийных разведений на МПА. Также высевали супернатант после третьего центрифугирования для определения остаточного количества сальмонелл, находящихся в среде. В результате было выявлено, что при количественном соотношении клеток амеб и сальмонелл, превышающем 1 к 100, невозможно полностью избавится от сальмонелл, находящихся в среде даже после 4 и 5 центрифугирования. По-видимому, данный эффект связан с тем, что при многократных центрифугированиях часть амеб лизируется, и сальмонеллы выходят в среду.
Заключение
Для изучения взаимодействия патогенных сальмонелл и свободноживущих амеб мы использовали среду, лишенную источников углерода. В результате бактерии в данной среде активно не размножались, и можно было оценить влияние внутриклеточно локализованных сальмонелл на жизнеспособность амеб. Установле-
но, что в первые часы сокультивирования более 85% амеб сохраняют свою жизнеспособность. Отсроченный цитотоксический эффект [11], по-видимому связан с адаптацией сальмонелл к изменившимся условиям окружающей среды, и последующей репликацией устойчивых к фагоцитозу клеток сальмонелл внутри амеб
[12], [13].
Результатом проведенных нами исследований стала разработка оптимальной модели сокультивирования аксеничной культуры амеб A. castellanii Neff с вирулентным штаммом сальмонеллы S. enterica serovar Typhimurium 14028s, характеризующейся следующими показателями:
1) наблюдается стабильная численность сальмонелл и амеб в течение эксперимента;
2) сохраняется численность жизнеспособных амеб, а также способность амеб к фагоцитозу;
3) достигается достаточное количество вну-триклеточно локализованных для проведения транскриптомного анализа сальмонелл, при этом количество внеклеточных бактерий не вносит значительной погрешности.
Таким образом, мы рекомендуем следующие параметры сокультивирования S. enterica serovar Typhimurium 14028s с культурой амеб A. castellanii Neff:
1) Среда для культивирования должна содержать минимум органического углерода, что позволяет лимитировать количество внеклеточных бактерий [14];
2) Удаление внеклеточно локализованных сальмонелл следует проводить после 1 часа со-культивирования, так как за это время происходит максимальное количество поглощенных клеток сальмонелл;
3) Соотношение амеб к сальмонеллам не должно превышать 1 к 100, в таком случае наблюдается максимальное количество внутри-клеточно локализованных сальмонелл.
4.07.2017
Авторы выражают благодарность к.м.н. Плотникову А. О. за неоценимую помощь,
оказанную в процессе выполнении работы.
Список литературы:
1. Lock R. Phagocytic recognition mechanisms in human granulocytes and Acanthamoeba castellanii using type 1 fimbriated Escherichia coli as phagocytic prey / R. Lock, L. Ohman, C. Dahlgren // FEMS Microbiology Letters.- 1987. - V. 44.- P. 135-140.
2. Cirillo S. L. G. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae / Cirillo et al. / Microbiology.- 2002.- V. 148.- P. 1667-1677.
3. Cosson P. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria / P. Cosson, T. Soldati // Current Opinion in Microbiology.- 2008.- V. 11.- P. 271-276.
4. Литвин В. Ю. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы / В. Ю. Литвин и др. // Вестник РАМН.- 2000.- № 1.- С. 7-13.
5. Molmeret M. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens / M. Molmeret et al. // Applied and Environmental Microbiology.- 2005.- V. 71.- C. 20-28.
6. Libby S. J. The Salmonella virulence plasmid spv genes are required for cytopathology in human monocyte-derived macrophages / S. J. Libby et al. // Cellular Microbiology.- 2000.- V. 2. - P. 49-58.
7. Jarvik T. Short-term signatures of evolutionary change in the Salmonella enterica serovar typhimurium 14028 genome / T. Jarvik et al. // Journal of Bacteriology.- 2009.- V. 192.- № 2.- P. 560-567.
8. Niyyatia M. A Review of the Current Research Trends in the Application of Medicinal Plants as a Source for Novel Therapeutic Agents Against Acanthamoeba Infections / M. Niyyatia, S. Dodangeha, J. Lorenzo-Morales // Iranian Journal of Pharmaceutical Research.-2016.- V. 15.- № 4.- P. 893-900.
9. Douesnard-Malo F. Increased Persistence of Salmonella enterica Serovar Typhi in the Presence of Acanthamoeba castellanii / F. Douesnard-Malo, F. Daigle // Applied and environmental microbiology.- 2011.- V. 77.- №. 21.- P. 7640-7646.
10. Kerby D. The simple difference formula: An approach to teaching nonparametric correlation / D. Kerby // Comprehensive Psychology. -2014. - V. 3. - № 1. - P. 1-9.
11. Feng Y. Apoptosis-like cell death induced by Salmonella in Acanthamoeba rhysodes / Y. Feng et al. // Genomics. - 2009. - V. 94. -№ 2. - P. 132-137.
12. Tezcan-Merdol D. Uptake and Replication of Salmonella enterica in Acanthamoeba rhysodes / D. Tezcan-Merdol et. al // Applied and Environmental Microbiology.- 2004.- V. 70.- P. 3706-3714.
13. Riquelme S. Relevant Genes Linked to Virulence Are Required for Salmonella Typhimurium to Survive Intracellularly in the Social Amoeba Dictyostelium discoideum [Электронный ресурс] / S. Riquelme et al. // Frontiers in microbiology. - 2016. - V. 7. - P. 1-10. -URL: https://doi.org/10.3389/fmicb. 2016.01305
14. Anderl J. Role of Nutrient Limitation and Stationary-Phase Existence in Klebsiella pneumoniae Biofilm Resistance to Ampicillin and Ciprofloxacin / J. Anderl et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2003. - V. 47. - № 4. - P. 1251-1256.
Сведения об авторах:
Балкин Александр Сергеевич, аспирант Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
Е-шаИ: balkinas@yandex.ru
Черкасов Сергей Викторович, директор Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук Е-шаП: cherkasovsv@yandex.ru 460000, г. Оренбург, Ул. Пионерская, 11
