CC BY
98DOI: 10.24411/9999-007A-2019-10006
УДК 619:579.842.14:577.212.3
Семина Анна Николаевна «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» — филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН
(ВНИВИП), к.в.н., [email protected], Новикова Оксана Борисовна «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» — филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН
(ВНИВИП), к.в.н., [email protected] Абгарян Сусанна Рафиковна ФГБОУ ВО Санкт - Петербургская
государственная академия ветеринарной медицины, ассистент, [email protected]
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМА САЛЬМОНЕЛЛ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ S.ENTERIDIS, S. INFANTIS И S. TYPHIMURIUM.
THE STUDY OF THE GENOME OF SALMONELLA FOR SPECIFIC DETECTION OF S. ENTERITIDIS, S. INFANTIS AND S. TYPHIMURIUM.
Аннотация
В последние годы такое заболевание как сальмонеллез остается одной из актуальных проблем продуктивного животноводства и птицеводства. Учитывая тот фактор, что изменение антигенной структуры сальмонелл может происходить за счет незначительных генетических изменений в относительно небольшом числе генов, нами была поставлена задача изучить геном таких серовариантов как S. Enteridis, S. Infantis и S. Typhimurium с целью дальнейшего специфического определения их молекулярно-генетическими методами.
Annotation
In recent years, such a disease as salmonellosis remains one of the urgent problems of productive livestock and poultry. Given the fact that changes in the antigenic structure of Salmonella can occur due to minor genetic changes in a relatively small number of genes, we have been tasked to study the genes of such
serovariants as S. Enteridis, S. Infantis and S. Typhimurium with the aim of further specific determination by molecular genetic methods.
Ключевые слова: сальмонеллы, организм, сероварианты, гены, антигены. Keywords: salmonella, body, serovariants, genes, antigens.
Сальмонеллы - короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, факультативные аэробы. Они обладают способностью двигаться за счет имеющихся у них жгутиков (исключение S. Gallmarum-риПотт). Все без исключения сальмонеллы принадлежат к 2 типам сероваров: S. Dongori и S. Entérica. Различают 5 подвидов S. Enterica: enteric (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) и indica (V). На долю подвид enterica (I) приходиться значительное количество выделенных на сегодняшний день серовариантов микроорганизма (1400 из 2500). Наибольший интерес представляют серовары такие, как S. Typhimurium (35%) S. Enteritidis (20%) и S. Infantis (11%) на долю которых приходятся все основные токсикоинфекций.По содержанию антигенов сальмонеллы делятся на: О-АГ, Н-АГ, некоторые - капсульный Vi-АГ. Все сальмонеллы по О-АГ делятся на 67 групп (А, В, С, D, Е и т.д.). Наличие специфических антигенных детерминант содержащихся в серогруппах А, B, D сальмонелл определяются по содержанию в их составе таких компонентов как паратозы, абеквозы и тивелозы. Присутствие гена RfbJ гарантирует синтез О-антигена в основе GDP-абеквозы. Ген RfbS синтезирует О-антигены в группах B и D.
Плазмиды сальмонелл различных серовариантов по своим вирулентным качествам обладаю значительной схожестью. Известно, что геном сальмонелл образуется единичной кольцевой хромосомой, состоящей из 4,6 млн пар нуклеотидов, в которой закодированы от 4 до 101 тысяч пар нуклеотидов плазмид. Плазмиды у сальмонелл различных серовариантов обнаруживаются в неодинаковых соотношениях, у многих редких серовариантов могут отсутствовать плазмиды, а у довольно часто встречающихся серовариантов практически нет изолятов, не имеющих плазмид.
S. Typhimurium выявлено, что большая часть представлена патогенными плазмидами величиной примерно 90 т.п.н. [1, 2]. S. Еnteritidis по данным некоторых ученых плазмида имеет размер 60 т.п.н. Хромосома S. Е^епса представлена одной круговой молекулой ДНК имеющий величина которой составляет примерно 3,7 млн пар оснований. В ходящие в ее состав такие основания как цитозин и гуанин достигают 50% [3].
Ферменты, отвечающие за синтезирование и производство полисахаридных частиц О-антигена за шифрованы в родственных генах аллелей Rfb. Модификация О-антигена может совершается в следствии не вирулентной замене некоторых нуклеотидных последовательностей ДНК гомологичными ей последовательностями нуклеотидов аллейных генов бактериофагов либо в следствии мутаций.
3 класса генов осуществляют образование жгутиков, ряд регуляторов контролирует их функции, в т.ч. сигма-фактором FliA и его антагонистом антисигма-фактором FlgM. Множество серовариантов сальмонелл имеют 2 комплекта генов флагеллина, из них в преобразовании белка принимает участие только 1 аллель. Гены, осуществляющие контроль синтезирование любой фазы жгутикового антигена, кроме того шифруют белки синтеза противоположной фазы флагеллина.
Такие гены как InvE, InvA представлены составной частью хромосомного участка Inv включающего 13 генов. Наличием этих генов обеспечивает проникновение микробов через клетки эпителия кишечного тракта [4].
В близкой взаимосвязи с геном Inv действует вблизи находящийся ген Spa. Было выявлено, что среди 12 генов, которые принадлежат ему и плазмидными генами вирулентности шигелл имеется значительный уровень совпадений и аналогичная очередность расположения.
Схожесть линии генов данных участков с генами LcrD, LcrE и YscA Shigella дает возможность допустить, что транспортирование заразных белков сальмонелл исполняется теми же путями, которые используются для
экспортирования жгутиковых белков. Данные гены определяют генетическое многообразие сальмонелл за счет включённых в них островов патогенности.
У сальмонелл к островам патогенности относят ряд генов, содержащих признаки вирулентности. В настоящее время определены двадцать один остров патогенности SPI. SPI-1 имеет фрагмент ДНК, представленный 41 тысяч пар оснований. Этот остров шифрует 34 протеина, в т.ч. элементы секреционной концепции вида III (T3SS), регуляторные и секреционные эффекторные протеины. T3SS применяются микробами с целью внедрения белков, именуемых эффекторами, напрямую в внутрь клеток-хозяев. А кроме того, могут выступать как медиаторы проникновения клеток и изменений, содействующих внутриклеточному увеличению. Вследствие присутствия системы секреции III вида (T3SS) Salmonella способна внедряться в не фагоцитирующие клетки. SPI-2 - состоит из 39 тысяч пар оснований. Он принимает участие в выживаемости внутри клетки и организации установки жгутиков зашифрованном во втором виде секреционной системы типа III. Наличие SPI-2 дало возможность сальмонеллам переключиться с выживания к репродукции в клетках хозяина и от местного инфицирования пищеварительного тракта к системному распространению. SPI-3 - принимает участие в процессе внутриклеточного выживания и шифрует транспорт магния, представлен 37 тысяч пар оснований. Всего лишь единственный его ген (mgtC) связан с вирулентностью - зашифровываемый им продукция гарантирует увеличение бактерии в макрофагах и обнаружение системной вирулентности вследствие приспособления к условиям невысокого нахождения ионов магния и невысокому рН фагосомы. SPI-4 принимает участие в прикреплении к клеткам эпителия, имеет 24 т.п.н. SPI-5 представлен не очень большим островком патогенности величиной меньше 6 т.п.н., его основная роль обеспечить проникновение в клетку эпителия кишечника. SPI-6 шифрует работу T6SS, safABCD фимбриальный кластер генов и инвазивный pagN. SPI-7 наиболее большой участок патогенности в настоящий период (не имеется в S. Typhimurium, однако существует в
S.Typhi). Величина этого модуля представлена 135 т.п.н., что соответствует приблизительно 149 генов. Он отвечает за патогенность бактерии включает гены биосинтеза капсульного антигена Vi. SPI-8 представлен фрагментом ДНК и считается составляющей SPI-13. SPI-9 включает 3 гена, кодирующих T1SS, представленные виде локуса величиной 17 т.п.н. [4]. SPI-10 более подробно исследован в S. typhi, складывается с 34 т.п.н. и имеет ряд функционально разобщенных генов. Опытным путем было определенно, что устранение SPI- 10 из S. Typhimurium приводит к уменьшению вирулентности сальмонелл. SPI-11 поначалу был определен в геномной очередности серовара S. ^o^mes^s, он составлял 13 т.п.н. S. Typhimurium этот остров патогенности намного меньше (6,8 т.п.н.). SPI-11 сальмонелл принимает участие в сохранении длительности инфекции по средствам внедрения в макрофаги и предотвращая нормальное созревание фагосом [5]. SPI-12 в S. Typhimurium образован 15,6 т.п.н. шифрует характерные О-антигены. SPI-13 несет информацию об генах, отвечающих за действие лиазы, гидролазы, оксидазы; патогенность бактерии; внутреннюю репликацию макрофагов. Этот остров патогенности образован 26 т.п.н., но только 9 т.п.н. в разных серотипах сальмонелл определяют различную функциональную нагрузку. SPI-14 имеет размер 8 т.п.н., (не наблюдается в S. Typhi). Роль SPI-14 в настоящий период не выяснена, однако установлено, что этот участок патогенности кодирует цитоплазматические белки. SPI-15 остров патогенности величиной 6,4 т.п.н. (не имеется в S. Typhimurium). Остальные острова патогенности шифрующие гены отвечающие за патогенность бактерии, не были распознаны как модули SPI.
Повышение резистентности бактерии к изменяющимся факторам внешней среды и противомикробным веществам осуществляется регуляторной системой PhoP/PhoQ.
У S. Typhimurium и S. Enteritidis одним из условий патогенности считается наличие Spv оперона, включающего гены патогенности SpvA, SpvB, SpvC и регуляционный ген SpvR [6]. Spv оперон расположен в
большой (размером 51-102 тысяч пар оснований) плазмиде, в то время как у остальных серовариантов отмечено их расположение в хромосоме. Наличие этих факторов обуславливает миграцию сальмонелл по организму, а также осуществляет доставку их в моноциты и кроме того апоптоз последних. Spv оперон генов патогенности определяют, устойчивость сальмонелл к фагоцитозу посредством рибозилирования компонента цитоскелета актина останавливая таким образом объединение фагосомы с лизосомой у макрофагов. Сероварианты сальмонелл, обладающие Spv оперон чаще всего обуславливают, развитие септического течения заболевания у людей и животных, у сельскохозяйственной птицы такие сероварианты в большей степени обнаруживаются во внутренних органах.
Исключительный ген SifA отвечает за образование внутриклеточных цитоплазматических фибриллярных белковых структур, объединяющих микроорганизм с мембраной фагосомой клеток эукариотов. Состоит более чем из 299 пар оснований и имеет не высокое суммарное содержание гуанина и цитозина (42%), в отличие от других фрагментов ДНК.
Сероварианты S. Typhimurium и S. Enteritidis имеют ген Rck, который обуславливает высокую стабильность сальмонелл к комплементу. Продукт гена Rck является мембранным протеином расположенным на поверхности, он предупреждает нарушение оболочки энтеробактериальной клетки за счет блокирования полимеризации комплемента С9 [7]. Имеются сведения, то что бактерии Salmonella enteric серовара Enteritidis проникают в эукариотические клетки за счет имеющихся у них внешних мембранных белков гена Rck .
В последнее время благодаря развитию молекулярно-генетических исследований были установлены геномы многих бактерий, в их числе опасные для здоровья человека. Проведя анализ большинства генов, было установлено, что большая часть ДНК имеет повторяющиеся последовательности. Повторы представлены различными классами, такие как непосредственные повторы, парные повторы, инвертированные повторы и могут иметь различия по величине, нахождению и сложности. К
непостоянству количества повторов могут приводить кластеры повторов, которые являются мишенями для рекомбинации либо сдвигов ДНК -полимеразы. Если подобное явление наблюдается довольно часто, то это приводит к возникновению отличий согласно этому локусу повторов среди различных серовариантов. Стремительные геномные и фенотипические перемены в микроорганизмах осуществляются за счет перестройки в повторённых фрагментах ДНК. Такая перестройка приводит к антигенному сдвигу, что дает возможность бактерии исключить встречу с иммунной системой макроорганизма.
В настоящее время в большинстве работ по изучению тандемных повторов ДНК начали использовать данную особенность с целью идентификации бактериальных штаммов. Создание способов, основанных на данной особенности могут быть использованы для генотипирования сероваров Salmonella, таких, как S. Enteridis, S. Infantis и S. Typhimurium, являющимися особо опасными для человека.
При работе с литературой нами были выбраны следующие гены для специфического определения S. Enteridis, S. Infantis и S. Typhimurium: область гена sefA, ген spvA и invA, также интерес могут представлять такие гены Rck и SPI-16. На основании изучении этих генов предполагается подобрать уникальные образцы олигонуклеотидных праймеров с целью дальнейшего генотипирования возбудителей сальмонеллеза птиц молекулярно-биологическими методами.
Список литературы:
1. Rychlik I. Review: Distribution and function of plasmids in Salmonella enterica / I. Rychlik, D. Gregorova and H. Hradecka // Veterinary Microbiology. -2006. - Vol. 112. - P. 1-10.
2. Hackett J. Mediation of serum resistance in Salmonella typhimurium by an 11 kDa polypeptide encoded by the cryptic plasmid / J. Hackett // J. Infect. Dis. -2012. - Р. 540-549.
3. Lesnick. The Salmonella spvB virulencegene encodes an enzyme that ADP-ribosylates actin and destabilizes the cytoskeleton of eukaryotic cells / Lesnick // Mol. Mcrobiol. - 2011. - Р. 1464-1470.
4. Manon Rosselin. Rck of Salmonella enterica, subspecies enterica serovar Enteritidis, mediates Zipper-like internalization / Manon Rosselin // Cell Research. - 2010. - Р. 647-664. doi:10.1038/cr.2010.45.
5. Yang Hong. Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles / Yang Hong // BMC Microbiology. -2008.- 8:178doi:10.1186 - 178.
6. Jones and Stanley. Salmonella plasmids of the pre-antibiotic era / J. Gen. Microbiol. - 2010. - Р. 189-197.
7. Friedrich M. J. Nucleotide sequence of a 13.9-kilobase segment of the 90-kilobase virulence plasmid of Salmonella typhimurium: the presence of fimbrial biosynthetic genes / M. J. Friedrich // Mol. Microbiol. - 2012. - Р. 543-558.
