CC BY
45
doi: 10.24411/0235-2451-2020-10213 УДК636.2:612.621
Оценка компетентности к развитию ооцитов Bos taurus после интра- или экстраовариальной витрификации*
Т. И. КУЗЬМИНА, И. В. ЧИСТЯКОВА
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального научного центра животноводства ВИЖимени академика Л. К. Эрнста (ВНИИГРЖ), Московское ш., 55а, Санкт-Петербург, 196601, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью сравнения функционирование митохондрий в ооцитах Bos taurus, подвергшихся экстра- и интраовариальной витрификации, а также оценки их способности к созреванию и оплодотворению in vitro. Анализировали функциональное состояние митохондрий и статус хроматина в нативных, экстра- и интраовариально витрифицированных ооцитах - в среднем по 31.. .40 ооциту в группе в 3 повторах. Для получения эмбрионов использовали 462 ооцита, в среднем 44.. .54 ооцита в каждой группе в 3 повторах. При экстраовариальной витрификации ооциты поэтапно обрабатывали криопротекторами (КПА) на основе среды Т-199 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС): 30 с в КПА-1 - 0,7 M диметилсульфоксид (ДМСО) + 0,9 M этиленгликоля (ЭГ); 30 с в КПА-2 - 1,4 M ДМСО + 1,8 M ЭГ; 20 с в КПА-3 - 2,8 M ДМСО + 3,6 M ЭГ + 0,65 M трегалозы. При интраовариальной витрификации фрагменты яичников 15 х 20 мм поэтапно выдерживали в КПА на основе фосфатного буферного раствора Дюльбекко с добавлением 20 % ФБС: КПА-1 - 7,5 % ЭГ + 7,5% ДМСО (25 мин), затем в КПА-2 - 15 % ЭГ + 15 % ДМСО + 0,5 М сахарозы (15 мин). Растворы КПА и среды для размораживания содержали 0,001 % наночастиц высокодисперсного кремнезёма. По интенсивности флуоресценции Mito Tracker Orange CMTMRos функциональная активность митохондрий экстраовариально витрифицированных ооцитов была достоверно выше, чем у интраовариально витрифицированных: 411,0 ± 17,8 и 198,0 ± 10,5|А соответственно. Доля раздробившихся клеток после экстраовариальной витрификации составила 52 %, что существенно больше, чем при интраовариальной витрификации - 32 %. Достоверных различий по выходу эмбрионов на стадиях поздней морулы-бластоцисты из девитрифицированных ооцитов (11 и 6 % соответственно) и доле дегенерированных зародышей (24 и 29 % соответственно) не выявлено.
Ключевые слова: ооцит, экстраовариальная витрификация, интраовариальная витрификация, митохондрии, Bos taurus. Сведения об авторах: Т. И. Кузьмина, доктор биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: [email protected]); И. В. Чистякова, младший научный сотрудник.
Для цитирования: Кузьмина Т И., Чистякова И. В. Оценка компетентности к развитию ооцитов Bos taurus после интра- или экстраовариальной витрификации // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т 34. № 2. С. 61-64. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10213.
*работа выполнена при финансовой поддержке Минобразования (Госзадание №АААА-А18-118021590132-9).
Assessment of competence for the development of Bos taurus oocytes after intra- or extraovarial vitrification
T. I. Kuzmina, I. V. Chistyakova
All-Russian Research Institute of Genetics andBreeding of Farm Animals, branch of Federal Scientific CenterofAnimal Husbandry-ErnstAll-Russian Research Institute of Animal Husbandry, Moskovskoe sh., 55a, Sankt-Petersburg, 196601, Russian Federation
Abstract. The purpose of the studies was to compare the functioning of mitochondria in Bos taurus oocytes subjected to extra- and intraovarial vitrification, as well as to assess their ability to mature and fertilize in vitro. We analyzed the functional state of mitochondria and chromatin status in native, extra- and intraovarially vitrified oocytes. The average number of oocytes in a group was 31-40. The experiment was repeated 3 times. To obtain embryos, we used 462 oocytes. The average number of oocytes in a group was 44-54. The experiment was repeated 3 times. During extraovarial vitrification, oocytes were gradually treated with cryoprotectants (CP) based on T-199 medium with the addition of 10% fetal bovine serum (FBS): 30 s in CP-1 - 0.7 M dimethyl sulfoxide (DMSO) + 0.9 M ethylene glycol (EG); 30 s in CP-2 - 1.4 M DMSO + 1.8 M EG; 20 s in CP-3 - 2.8 M DMSO + 3.6 M EG + 0.65 M trehalose. During intraovarial vitrification, ovarian fragments of15 x 20 mm were kept in CP based on Dulbecco's phosphate-buffered saline with the addition of 20% of FBS: CP-1 - 7.5% EG + 7.5% DMSO (25 min), then in CP-2 - 15% EG + 15% DMSO + 0.5 M sucrose (15 min). CP solutions and defrosting media contained 0.001% of highly dispersed silica nanoparticles. According to the fluorescence intensity of Mito Tracker Orange CMTMRos, the functional activity of mitochondria of extraovarially vitrified oocytes was significantly higher than that of intraovarially vitrified oocytes - (411.0 ± 17.8) uA and (198.0 ± 10.5) uA, respectively. The share of cells crushed after extraovarial vitrification was 52%. For intraovarial vitrification, it was significantly lower - 32%. Significant differences in the yield of embryos at the stages of late blastocyst morula from devitrified oocytes (11% and 6%, respectively) and the proportion of degenerated embryos (24% and 29%, respectively) were not detected. Keywords: oocyte; extraovarial vitrification; intraovarial vitrification; mitochondria; Bos taurus.
Author details: T. I. Kuzmina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: [email protected]); I. V. Chistyakova, junior research fellow. For citation: Kuzmina TI, Chistyakova IV. [Assessment of competence for the development of Bos taurus oocytes after intra- or extraovarial vitrification]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020; 34(2):61-4. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10213.
Криоконсервация репродуктивных клеток животных - один из основных методов сохранения генетического материала высокоценных пород и исчезающих видов. Однако успехи в этой сфере остаются достаточно скромными, что обусловлено несовершенством протоколов витрификации.
При экстраовариальной витрификации женских гамет, в ходе которой используют открытые системы замораживания (криодевайсы), насыщение клеток криопротекторами достигается за короткие сроки при непродолжительной экспозиции в витрифицирующих растворах. Это бесспорное преимущество, по сравнению с закрытой интраовариальной (внутрифоллику-лярной) системой, при использовании которой время экспозиции значительно возрастает.
Тем не менее, при открытом способе замораживания существует риск инвазирования биологического образца, что может повлиять на компетентность ооцита к эмбриональному развитию. В этом случае интраовариальная витрификация может стать альтернативой открытой системе, поскольку нивелирует воздействие резистентных криогенных микроорганизмов на ткани яичника и ооциты [1].
Применение обеих моделей витрификации вызывает температуро- и осмотически зависимые повреждения. Наиболее чувствительны к ним цитоскелет, митохондрии и структуры ядерного аппарата, которые играют важную роль в созревании, оплодотворении и эмбриональном развитии. В результате температурозависимых фазово-структурных переходов внутриклеточных липидов и усиления их перекисного окисления барьерные свойства
мембраны митохондрий нарушаются, происходит утечка транспортируемого Са2+ через систему активного транспорта и вследствие пассивной диффузии. Из-за этого ухудшается энергообеспечение ооцита в период созревания, и создаются условия для запуска реакций апоптоза. При витрификации в ядерном аппарате ооцитов нарушается структура хроматина, и, как следствие, снижается его матричная активность (синтез ДНК и РНК) [2]. Все эти процессы приводят к нарушению жизнеспособности ооцита и его некомпетентности к завершению созревания.
Создание универсальной эффективной системы витрификации, способной максимально сохранить структуру и функции клеточных компартментов, которые обеспечивают полноценное функционирование созревающей клетки, - одна из основных задач, стоящих перед репродуктологами и криобиологами.
Цель исследования - выявить особенности функционирования митохондрий в ооцитах Bos taurus, подвергшихся экстра- или интраовариальной витрификации, а также оценить их компетентность к созреванию и оплодотворению in vitro.
Условия, материалы и методы. Эксперименты проводили в 2018-2019 гг. Материалом служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), выделенные посмертно из антральных фолликулов яичников половозрелых телок черно-пестрой породы. ОКК аспирировали из фолликулов диаметром от 3 до 8 мм.
Сравнивали криорезистентность (митохондриаль-ную активность и статус хроматина) нативных ооцитов и ооцитов, витрифицированных интра- или экстраова-риально, а также их способность к раннему эмбриональному развитию. Для витрификации использовали ооциты с гомогенной цитоплазмой, окружённые 5 и более слоями кумулюсных клеток.
Экстраовариальную витрификацию проводили по методике, предложенной М. Kuwayama [3]. Ооциты, предназначенные для экстраовариальной витрификации, обрабатывали тремя растворами криопротекторов (КПА) на основе среды Т-199 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, HyClone, Logan, USA): КПА-1 - 0,7 M диметилсульфоксид (ДМСО) + 0,9 M этиленгликоля (ЭГ); КПА-2 - 1,4 M ДМСО + 1,8 M ЭГ; КПА-3 - 2,8 M ДМСО + 3,6 M ЭГ + 0,65 M трегалозы. ОКК поэтапно экспонировали в течение 30 с в КПА-1, затем 30 с в КПА-2 и 20 с в КПА-3.
При интраовариальной витрификации препарированные яичники животных делили на 6.. .8 фрагментов размером 15 х 20 мм, помещали в стерильные марлевые мешочки и опускали поэтапно в растворы КПА. КПА готовили на основе фосфатного буферного раствора Дюльбекко (ФБР) с добавлением 20 % ФБС: КПА-1 -7,5 % ЭГ + 7,5 % ДМСО (25 мин), затем в КПА-2 - 15 % ЭГ+ 15 % ДМСО + 0,5 М сахарозы (15 мин) [4].
В растворы КПА и среды для размораживания дополнительно вносили по 0,001 % наночастиц высокодисперсного кремнезёма (нВДК, ИХП им. А. А. Чуйко НАН Украины). При выборе концентрации кремнезема основывались на данных разработчиков [5].
Пайеты с ооцитами и стерильные марлевые мешочки с фрагментами яичников погружали в сосуды Дьюара с жидким азотом (-196 °С). Там они находились не менее 24 ч. ОКК извлекали из пайет и помещали в 0,25 М раствор трегалозы на основе среды Т-199 с добавлением 10 % ФБС при 37 °С, последовательно отмывали в 0,19 М трегалозе, затем в 0,125 М трегалозе. Аспирированные ооциты из фрагментов после оттаивания последовательно обрабатывали 0,5 и 0,25 М растворами трегалозы, приготовленными на основе ФБР с содержанием
ФБС 20 %. Финальную отмывку всех ОКК проводили в среде Т-199 с добавлением 10 % ФБС [3,4].
Нативные и девитрифицированные ОКК культивировали 24 ч при температуре 38,5 °C в атмосфере с содержанием 5 % СО2 в среде следующего состава: среда Т-199 + 10 % ФБС + 106 клеток/мл гранулезы + 50 нг/мл бычьего про-лактина + 0,001 % нВДК [6].
Для оценки функционального состояния митохондрий в нативных и девитрифицированных ооцитах использовали Mito Tracker Orange CMTMRos. В сумме по 3 повторам проанализировали 103 ооцита: нативных - 38 шт., экстрао-вариально витрифицированных - 34 шт., интраовариально витрифицированных - 31 шт. Нативные и девитрифицированные ОКК по 15.20 шт. помещали в капли 500 нМ раствора Mito Tracker Orange CMTMRos объемом 500 мкл и инкубировали в темноте при температуре 37 °С в течение 30 мин. Затем ооциты отмывали от красителя в ФБР с добавлением 0,3 % бычьего сывороточного альбумина. Отмытые ооциты очищали от кумулюсных клеток путем инкубации в 0,1 %-ном растворе трипсина при 37 °С в течение 5.10 мин, переносили в раствор Хенкса, содержащий 3,7 % параформальдегида, затем фиксировали (15 мин, 37 °С). После фиксации ооциты отмывали от параформальдегида в ФБР и помещали на стекла Superfrost. Интенсивность флуоресценции Mito Tracker Orange CMTMRos измеряли с использованием флуоресцентного микроскопа ZEISS AxioLab. A1 и фотометрической насадки (KarlZeiss, Германия). Длины волн возбуждения - 554 нм, излучения - 576 нм. Интенсивность флуоресценции измеряли в цА [8].
Режимы культивирования и оплодотворения ооцитов, а также культивирования эмбрионов коров соответствовали методическим рекомендациями ВНИИГРЖ [7]. Для получения эмбрионов в 3 повторах использовали 462 ооцита: нативных - 161 (в среднем 54 в повторности); экс-траовариально витрифицированных - 168 (в среднем 56 в повторности); интраовариально витрифицированных- 133 (в среднем 44 в повторности).
Для оценки статуса хроматина ооцитов и эмбрионов использовали метод Тарковского [9]. С этой целью в 3 повторностях проанализировали 338 ооцитов: нативных -120 (в среднем 40 в повторности); экстраовариально витрифицированных - 116 (в среднем 39 в повторности); интраовариально витрифицированных - 102 (в среднем 34 в повторности). Также в сумме по 3 повторностям изучали 242 полученных эмбриона: из нативных ооцитов - 112; из экстраовариально витрифицированных - 87; из интраовариально витрифицированных - 43. Ооциты и эмбрионы помещали на 5.10 мин в теплый (37 оС) 0,9 % гипотонический раствор 3-замещенного цитрата натрия. Ооциты очищали от кумулюса механически препаровальной иглой. Затем клетки переносили на сухое обезжиренное стекло, фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3 : 1. Высохшие препараты окрашивали 4 % раствором Романовского-Гимза (азур-эозином) в течение 3.4 мин и обрабатывали 70 % этиловым спиртом.
Реагенты, использовавшиеся при выполнении экспериментов, за исключением обозначенных в тексте, произведены компанией Sigma-Aldrich (США).
Все опыты выполняли в 3 повторах. Данные обрабатывали с помощью программы SigmaStat. Результаты представлены в виде средних (M) и стандартных ошибок средних (± SEM). Для оценки достоверности различий между сравниваемыми средними значениями использовали t-критерий Стьюдента и критерий х2 Пирсона по Лакину (М., 1990).
Результаты и обсуждение. В группе нативных ооцитов интенсивность флуоресценции Mito Tracker Orange CMTMRos (митохондриальный потенциал) составила 475,0
600
5 S <t i
3 W 500
л
0 а
О 5 400
0! 1-
Q. ?
> и 300
о
++ ra
■A H л 200
О л О
X 0) 100
5 О X о л 0
X л
5 5
Нативные ооциты
Девитрифицированные ооциты (экстраовариальная витрификация)
100 90 80 70 ; 60 I 50 : 40 30 20 10 0
Созревшие
Рис. 1. Митохондриальная активность по результатам интенсивности флуоресценции Mito Tracker Orange CMTMRos в нативных и девитрифицированных ооцитах Bos taurus при культивировании in vitro. Достоверность различий сравниваемых значений по t-критерию Стьюдента: b : c, a : c - р < 0,01; a : b - р < 0,05.
± 14,3 цА. В группе интраовариально верифицированных ооцитов она была значительно (р < 0,01) меньше, чем у витрифицированных экстраовариально: 198,0 ± 10,5 цА и 411,0 ± 17,8 цА соответственно (рис. 1).
Реинициировали мейоз 91 % нативных ооцитов и 77 % ооцитов после экстраовариальной витрификации, что значимо ниже (р < 0,01), по сравнению с нативны-ми ооцитами. После интраовариальной витрификации реинициировали мейоз 52 % ооцитов, что существенно ниже, чем в других группах (р < 0,001, рис. 2).
Дегенерация хроматина в экспериментальных группах была значимо выше (р < 0,001), чем в контроле (18 %). Между экспериментальными группами достоверных различий по величине этого показателя не обнаружено: 41 % у экстра- и 47 % у интраовариально витрифицированных ооцитов.
При экстраовариальной витрификации завершающей стадии созревания (метафаза-11) достигло 52 % ооцитов, при интраовариальной- 49 %, что значимо меньше (р < 0,001), чем у нативных (82 %). Между экспериментальными группами достоверных различий по величине этого показателя не обнаружено.
Доля раздробившихся ооцитов после экстраовариальной витрификации составила 52 %, после интраовариальной - 32 %, нативных - 70 %. По величине этого показателя экспериментальные группы существенно различались между собой (р < 0,01), и по сравнению с нативными ооцитами (р < 0,01; 0,001).
Достоверных различий по выходу эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития (поздние морулы-бластоцисты) из экстра- и интраовариально девитрифицированных ооцитов не выявлено: 11 и 6 % соответственно (рис. 3).
Не обнаружено существенных различий и по доле деге-нерированных зародышей при морфологическом анализе эмбрионов, полученных из девитрифицированных ооци-тов обеих экспериментальных групп: при интраовариальной витрификации - 29 % (10 из 35), при экстраовариальной -24 % (9 из 38).
Возможно, снижение величин показателей созревания и выхода эмбрионов из интраовариально витри-
фицированных ооцитов обусловлено тем, что ооциты в фолликулах имеют большее количество межклеточных связей с кровеносными сосудами и капиллярами, которые подвергаются рекристаллизации при оттаивании. Процессы, происходящие при рекристаллизации, нарушают взаимодействие клеток внутри фолликула [10].
Рекристаллизация пагубно влияет и на ооциты, у которых повреждаются мембранные (митохондрии) и немембранные (ядерный аппарат клетки после разрушения ядерной оболочки) органеллы [11]. При воздействии сверхнизких температур вследствие повышения содержания ионов Са2+ в цитозоле клетки, митохондрии подвергаются чрезмерной
Девитрифицированные ооциты (интраовариальная витрификация)
Реинициировавшие мейоз
Дегенерировавшие
Рис. 2. Статус хроматина нативных и девитрифицированных ооцитов Bos taurus после культивирования при использовании витрификации: □ - нативные; - девитрифицированные (экстраовариальная витрификация); ■ - девитрифицированные (интраовариальная витрификация). Достоверность различий сравниваемых значений по критерию х2 Пирсона: a : d, a : h, c : g, e : h, b : i, f : i, c : j - р < 0,001; b : f - р < 0,01.
нагрузке Ca2+. В результате открываются поры высокой проницаемости, что неизбежно приводит к апоптозу клеток [12]. Определяющую роль в открытии высокопроницаемых митохондриальных пор (ВМП) при заморозке играет окислительный стресс, который приводит к раз-
Девитрифицированные ооциты (экстраовариальная витрификация)
Девитрифицированные ооциты (интраовариальная витрификация)
Рис. 3. Развитие доимплантационных эмбрионов Bos taurus из нативных и девитрифицированных ооцитов: ■ - % дробления; - % поздних морул-бластоцист. Достоверность различий сравниваемых значений по критерию х2 Пирсона: b : f; a : e - р < 0,001; a : c, c : e, b : d - р < 0,01.
h
рушению структуры мембранных белков и снижению трансмембранного потенциала митохондрий [13].
Таким образом, снижение митохондриального потенциала при воздействии сверхнизких температур на митохондрии в процессе экстра- и интраовариальной витрификации может быть связано с увеличением концентрации активных форм кислорода, и, как следствие, повышением уровня внутриклеточного Ca2+ и образованием ВПМ. Значительное снижение митохондриальной активности в группе интраовариально витрифицированных ооцитов, по сравнению с эктраовариально витрифици-рованными, может быть обусловлено дополнительными процессами рекристаллизации тканей вследствие недостаточности насыщения яичников криопротекторами.
Снижение числа созревших клеток и увеличение деге-нерированных может свидетельствовать о низком качестве ооцита. Уменьшение величин показателей дробления и выхода доимплантационных эмбрионов при использовании обеих моделей витрификации может быть связано с большим количеством повреждений и недостаточным энергообеспечением девитрифицированного ооцита для завершения раннего эмбрионального развития.
Выводы. В результате исследований показана возможность получения доимплантационных эмбрионов коров из ооцитов после интраовариальной витрификации.
Митохондриальная активность (уровень интенсивности флуоресценции Mito Tracker Orange CMTMRos) при экстраовариальной витрификации была значимо выше, чем при интраовариальной - 411,0 ± 17,8 цА против 198,0 ± 10,5 цА соответственно (р < 0,01). Одна из причин этого -различия в скорости насыщения гамет криопротекторами. Экстраовариально витрифицированные ооциты насыщаются ими быстрее, и, следовательно, криопов-реждения в их клетках выражены меньше, по сравнению с ооцитами, подвергшимися интрафолликулярной витрификации. О большем количестве повреждений в структуре клеточных органелл интраовариально витрифицированных клеток свидетельствует существенное снижение доли раздробившихся клеток, по сравнению с экстраовариально витрифицированными (32 и 52 % соответственно, р < 0,01).
В целом результаты экспериментов свидетельствуют о преимуществе экстраовариальной модели витрификации ооцитов Bos taurus, по сравнению с интраовариальной.
Литература.
1. Campos L. B., da Silva A. M., Praxedes E. C. G. Vitrification of collared peccary ovarian tissue using open or closed systems and different intracellular cryoprotectants// Cryobiology. 2019. No. 91. Pp. 77-83.
2. Possibilities of cattle ovarian tissue conservation: a mini-review/A. Makarevich, M. Foldesiova, L. Olexikova, et al. // Slovak J. Anim. Sci. 2017. Vol. 50. No. 3. Pp. 128-133.
3. Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos // Theriogenology. 2007. Vol. 67. No 1. Pp. 73-80.
4. Ганджа А. И., Леткевич Л. Л., Кузьмина Т. И. Криоконсервация и криотолерантность ооцитов сельскохозяйственных животных// Зоотехническая наука Белоруссии. 2017. Т. 52. № 1. С. 46-52.
5. Биофункциональные наноматериалы на основе высокодисперсного кремнезема, белка и аминоуглеводов / Н. П. Галаган, Н. Ю. Клименко, И. Л. Орел и др. //^ Biopolymers and Cell. 2010. Vol. 26. No. 3. Pp. 205-213.
6. Effects of highly dispersed silica nanoparticles on the cryoresistance of the bovine cumulus-oocyte complexes /1. V. Chistyakova, T. I. Kuzmina, T. I. Stanislavovich, et al. // The 55th Annual meeting of the society for cryobiology (Madrid, 10-13 July, 2018): abstract book. Madrid, Spain, 2018. Pp. 90.
7. Биотехнология получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (методические рекомендации)/Т. И. Кузьмина, В. А. Багиров, А. В. Егиазарян и др. Санкт-Петербург-Пушкин, 2009.44 с.
8. Кузьмина Т. И., ТорнерХ., АльмХ. Функциональная активность митохондрий в нативныхи девитрифицированныхооцитах Bos taurus при созревании in vitro //Генетика и разведение животных. 2018. № 2. С. 67-72.
9. Tarkowski A. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse eggs// Cytogenetic. 1966. No. 1. Pp. 394-400.
10. Comparison of residual dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) concentration in bovine ovarian tissue during warming steps between slow freezing and vitrification / R. Obata, Y. Nakumura, N. Okuyama, et al. // Cryo Letters. 2018. Vol. 39. No. 4. Pp. 251-254.
11. Shahsavari M. H., Moghaddam G., Daghigh Kia H. Effects of newsynthetic cryoprotectant agents on histological characteristics of various classes of vitrified bovine pre-antral follicles//Veterinary Research Forum. 2019. Vol. 10. No. 1. Pp. 9-16.
12. Новодережкина Е. А., Животовский Б. Д. Индукция неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны и ее роль в гибели клеток// Молекулярная биология. 2016. Т. 50. № 1. С. 51-68.
13. Заводник И. Б. Митохондрии, кальциевый гомеостаз и кальциевая сигнализация // Биомедицинская химия. 2016. Т. 62. № 3. С. 311-317.
References
1. Campos LB, da SilvaAM, Praxedes ECG. Vitrification of collared peccary ovarian tissue using open orclosed systems and different intracellular cryoprotectants. Cryobiology. 2019;(91):77-83.
2. Makarevich A, Foldesiova M, Olexikova L, et al. Possibilities of cattle ovarian tissue conservation: a mini-review. Slovak J. Anim. Sci. 2017;50(3):128-33.
3. Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos. Theriogenology. 2007;67(1):73-80.
4. Gandzha AI, Letkevich LL, Kuzmina TI. [Cryopreservation and cryotolerance of farm animal oocytes]. Zootekhnicheskaya nauka Belorussii. 2017;52(1):46-52. Russian.
5. Galagan NP, Klimenko NYu, Orel IL, et al. [Biofunctional nanomaterials based on highly dispersed silica, protein and amino carbohydrates]. Biopolymers and Cell. 2010;26(3):205-13. Russian.
6. Chistyakova IV, Kuzmina TI, Stanislavovich TI, et al. Effects of highly dispersed silica nanoparticles on the cryoresistance of the bovine cumulus-oocyte complexes. In: The 55th Annual meeting of the society for cryobiology: abstract book; 2018 Jul 10-13; Madrid. Madrid; 2018. p. 90.
7. Kuzmina TI, Bagirov VA, Egiazaryan AV, et al. Biotekhnologiya polucheniya embrionov krupnogo rogatogo skota in vitro (metodicheskie rekomendatsii) [Biotechnology for the production of cattle embryos in vitro (guidelines)]. St. Peterburg, Pushkin (Russia); 2009. 44 p. Russian.
8. Kuzmina TI, Torner Kh, Alm Kh. [Functional activity of mitochondria in native and devitrified Bos taurus oocytes upon in vitro maturation]. Genetika i razvedenie zhivotnykh. 2018;(2):67-72. Russian.
9. Tarkowski A. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse eggs. Cytogenetic. 1966;(1):394-400.
10. Obata R, Nakumura Y, Okuyama N, et al. Comparison of residual dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) concentration in bovine ovarian tissue during warming steps between slow freezing and vitrification. Cryo Letters. 2018;39(4):251-4.
11. Shahsavari MH, Moghaddam G, Daghigh Kia H. Effects of new synthetic cryoprotectant agents on histological characteristics of various classes of vitrified bovine pre-antral follicles. Veterinary Research Forum. 2019;10(1):9-16.
12. Novoderezhkina EA, Zhivotovskii BD. [Induction of nonspecific permeability of the mitochondrial membrane and its role in cell death]. Molekulyarnaya biologiya. 2016;50(1):51-68. Russian.
13. Zavodnik IB. [Mitochondria, calcium homeostasis and calcium signaling]. Biomeditsinskaya khimiya. 2016;62(3):311-7. Russian.
