CC BY
88
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10031 УДК 636.2:612.621
Ключевые слова: гранулёза, витрификация, апоптоз, Bos taurus, наночастицы высокодисперсного кремнезема Keywords: granulosa, vitrification, apoptosis, Bos taurus, highly dispersed silica nanoparticles
Кузьмина Т. И., Чистякова И. В.
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЁМА НА АПОПТОЗ В НАТИВНЫХ И ДЕВИТРИФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ
ГРАНУЛЁЗЫ BOS TAURUS
THE EFFECT OF HIGHLY DISPERSED SILICA NANOPARTICLES ON APOPTOSIS IN NATIVE AND DEVITRIFIED BOS TAURUS GRANULOSA CELLS
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста» Адрес: 196625, РФ, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе, 55а. All-Russian researcher Institute of genetics and breeding of farm animals is a branch of Federal state budget scientific institution "Federal scientific center for animal husbandry - VIZH named after of academician L. K. Ernst" Address: 196625, Russia, St. Petersburg - Pushkin, Moscow highway, 55а.
Кузьмина Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биологии
развития, главный научный сотрудник. E-mail: prof.kouzmina@mail.ru. Тел.+7(921)3921947. Kuzmina Tatiana Ivanovna, Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Developmental Biology, Chief researcher, E-mail:prof.kouzmina@mail.ru.Tel. +7(921) 3921947. Чистякова Ирэна Валерьевна, младший научный сотрудник лаборатории биологии развития. E-mail: itjerena7@gmail.com. Тел.+7(952) 3506144. Chistiakova Irena Valeryevna, Junior researcher of Laboratory of Developmental Biology E-mail: itjerena7@gmail.com. Тел. + 7(952) 3506144.
Аннотация. Использование кокультуры или монослоя клеток гранулёзы овариальных фолликулов животных в клеточных репродуктивных технологиях обусловлено их большой значимостью при росте и созревании ооци-тов in vivo. Сохранность клеток гранулёзы после обработки сверхнизкими температурами (витрификация) детерминирует «качество» среды для культивирования ооцит-кумулюсных комплексов. В настоящем исследовании в сравнительном аспекте проанализированы апоптотические процессы (TUNEL-тест) в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы из фолликулов Bos taurus. При использовании наночастиц высокодисперсного кремнезема (ВДК, концентрация 0,001 %) в составе криопротекторных и культуральных сред доля апоптотических клеток в популяции девитрифицированных гранулезных клеток через 24 и 48 часов культивирования снизилась c 61 до 38 %, P<0.001, и с 78 до 45 %, P<0.001, соответственно. Таким образом, анализ результатов проведенных экспериментов выявил положительный эффект наночастиц ВДК на статус хроматина нативных и девитрифицированных клеток гранулёзы коров при пролонгированном культивировании, что позволяет рекомендовать использование наночастиц ВДК при витрификации и культивировании соматических и половых клеток овариальных фолликулов.
Summary. The usage of co-culture or monolayer of granulosa cells from ovarian animal follicles in cellular reproductive technologies is due to their great importance in growth and maturation of oocytes in vivo. The safety of granulosa cells after treatment by ultra-low temperatures (vitrification) determines the "quality" of medium for culture of oocyte-cumulus complexes. In the present study, the apoptotic processes (TUNEL test) in native and devitrified granulosa cells from the follicles of Bos taurus were analyzed in a comparative aspect. In case of use of highly dispersed silica (HDS, concentration - 0.001 %) nanoparticles in cryoprotective and cultural media, the proportion of apoptotic cells in the population of devitrified granulosa cells after 24 and 48 hours of culture decreased from 61 to 38 %, P <0.001 and from 78 to 45 %, P <0.001, respectively. So the analysis of experimental results revealed a positive effect of HDS nanoparticles on the chromatin status of native and devitrified bovine granulosa cells during the prolonged culture, which implies the use of HDS nanoparticles for vitrification and culture of somatic and germ cells of ovarian follicles.
Введение и ДНК-технологий (получение эмбрионов
Интенсификация фундаментальных ис- in vitro, клонирование, трансгенез, редакти-
следований в области физиологии женской рование генома) [9]. В основе вышеперечис-
гаметы млекопитающих определяется не- ленных технологий лежит метод созревания
обходимостью совершенствования инно- донорских ооцитов in vitro. Несмотря на зна-
вационных клеточных репродуктивных чительные успехи в технологии экстракорпо-
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (43), 2019
8
рального созревания ооцитов коров, выход развившихся из них эмбрионов на протяжении многих лет составляет не выше 40% [7]. Одной из важнейших задач технологии экстракорпорального созревания и оплодотворения - создание системы культивирования, адекватно отражающей условия формирования гаметы in vivo. Известно, что использование кокультуры клеток гранулезы при дозревании донорских ооцитов in vitro значительно повышает выход эмбрионов на стадии бластоцисты [6]. Ядра клеток гранулезы используются в качестве донорских в технологии клонирования [8]. Фундаментальные исследования стероидогенеза подразумевает долгосрочное культивирование гранулезных клеток, а использование клеток гранулезы в качестве тест-системы цито- и генотоксич-ности различных реагентов обуславливает использование культуры этих клеток в фармакологии. Понятно, что хранение, в том числе и долгосрочное (криоконсервация) клеток гранулезы, с сохранением их жизнеспособности позволит значительно повысить эффективность вышеперечисленных биотехнологий и сопутствующих им методов. Определяющую роль в технологии витрификации клеток играют состав криопротекторов.
Высокодисперсный кремнезём (ВДК) -аморфная форма диоксида кремния с размером частиц от 4 до 40 нм. Включение наночастиц ВДК (нВДК) в состав криопротекторных агентов может повысить эффективность витрифи-кации за счет изменения свойств растворов, обусловленных структурой и свойствами высокодисперсного кремнезема. Ранее выявлено положительное воздействие наночастиц ВДК в концентрации 0,001 % на жизнеспособность декриоконсервированных сперматозоидов быков, развитие доимплантационных эмбрионов коров, свиней [1, 5]. Цель настоящего исследования - идентифицировать эффекты наноча-стиц ВДК на уровень апоптозов в нативных и девитрифицированых клетках гранулезы коров.
Материал и методы
Клетки гранулезы, использованные в экспериментах, были выделены из антраль-ных фолликулов яичников коров диаметром 3-6 мм, с высоким тургором и обширной
васкуляризацией. Взвесь клеток обрабатывали тремя растворами криопротекторов (КПА), приготовленными на среде ТС-199 с 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, HyClone, Logan, UT). КПА-1: 0.7 M диме-тилсульфоксид (ДМСО) + 0.9 M этиленгли-коля (ЭГ); КПА-2: 1.4 M ДМСО + 1.8 M ЭГ; КПА-3: 2.8 M ДМСО + 3.6 M ЭГ + 0.65 M трегалозы. В каждый раствор криопротекторов вносили по 0,001 % нВДК. Осадок клеток гранулезы после отмыва в фосфат-но-солевом буфере поэтапно экспонировали в течение 3 мин в КПА-1, затем в КПА-2 и 5 минут в КПА-3. Перед каждой обработкой растворами криопротекторов клетки центрифугировали при 300 об/мин в течение 60 секунд при комнатной температуре. Криопробирки с заключительной порцией осадка клеток гранулезы помещали в жидкий азот.
В процессе размораживания пробирки, содержащие витрифицированные клеточные осадки, помещали в водяную баню (37°С) и инкубировали в течение 120 с. Затем клетки поэтапно помещали в три раствора с различными концентрациями трегалозы, приготовленными на основе ТС-199: 0,25 М на 3 минуты, затем отмывали в 0,19 М (3 минуты), и далее в 0,125 М трегалозе (3 минуты), окончательно дважды отмывали в ТС-199 с 10 % ФБС. Каждый этап отмывания включал 60-секундное центрифугирование при 300 об/мин. Культивирование клеток проводили при температуре 38,5°C в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в течение 48 часов в среде следующего состава: ТС199 + 10 % фетальной бычьей сыворотки + 50 нг/мл пролакти-на, 10 мкг/мл гентамицина [3]. Концентрация клеток гранулезы составляла 106 клеток гранулезы на мл среды. В опытные группы сред для культивирования добавляли наноча-стицы 0,001 % ВДК (марка А200оС, институт химии поверхности им. Чуйко, НАН Украины). В отборе концентраций руководствовались указанными разработчиками [2].
Анализу клеток на апоптоз подвергали нативные клетки гранулезы (до культивирования), нативные клетки гранулезы, обработанные и необработанные нВДК (контроль 1 и 2), девитрифицированные клетки грануле-
9
зы, обработанные и необработанные нВДК (опыт 1 и 2). Определение апоптозов в гра-нулезе, проводили перед культивированием через 24 и 48 часов в следующей последовательности. Клетки гранулезы помещали на покрытые poly-L-lysine предметные стекла и подсушивали на воздухе. Далее проводили фиксацию в растворе формалина в течение 30 минут и промывание в фосфатно-буферном растворе (ФБР). Затем клетки выдерживали в течение 2 минут в 10 % растворе Тритона Х -100 на 0,1 % цитрате натрия и повторно отмывали в ФБР. Затем экспонировали клетки с реактивом TUNEL (Kit from Boehringer Mannheim Cat.No. 1684795) и инкубировали в темноте в течение 60 минут при 37°С. После инкубации клетки промывали в растворе ФБР и экспонировали в растворе пропи-диума иодида (1 мг/мл), и вновь промывали в ФБР, оставляли в темноте при комнатной температуре на 1 час, затем помещали в холодильник и хранили в горизонтальном положении. Образцы анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axio Imager A 2m.
Результаты обрабатывали с помощью статистической программы Sigma Stat. Все использованные в исследовании реагенты, за исключением обозначенных, производства фирмы Sigma-Aldrich. Пластиковая лабораторная посуда фирмы BD Falcon™. Досто-
верность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: Р<0.05; Р<0.01; Р<0.001 для 3-5 независимых экспериментов с помощью критерия х2.
Результаты исследований
Исследования проводили в соответствии со схемой, представленной на рисунке 1.
Введение наночастиц ВДК в состав крио-протекторных и культуральных сред способствовало снижению доли клеток в состоянии апоптоза на всех этапах культивирования, так, после замораживания/оттаивания в контрольных девитрифицированных (необработанных наночастицами ВДК) клетках доля апоптотических клеток достигла 51 % против 33 % в опыте (рис. 2, Р<0.001).
Уровень апоптозов через 24 часа культивирования в контрольных нативных клетках составил 22 %, в опытных - 15 %, в контрольных девитрифицированных клетках выше обозначенный показатель составил 61 % против 38 % в опытной группе (рис. 3, Р<0.001).
В девитрифицированных клетках гранулё-зы доля апоптотических клеток значительно превышало таковую в нативных клетках на всех исследованных временных промежутках (24 часа: контроль - 22 % против 61 %; опыт - 15 % против 38 %; 48 часов: контроль
Рис. 1. Структурно-логическая схема экспериментов.
10
33 % против 78 %; опыт - 21 % против 45 %, P<0.001, рис. 2-4).
На рис. 4 представлены результаты анализа деструктивных процессов в нативных и девитрифицированных клетках гранулёзы через 48 часов культивирования. Использование наночастиц ВДК в составе криопро-текторных и культуральных сред обеспечило снижение уровня апоптозов, как в нативных, так и в девитрифицированных клетках. В нативных клетках через 48 часов культивирования уровень апоптозов составил 33 % (контроль) против 21 % (опыт), а в деви-трифицированных ооцитах снизился с 78 % (контроль) до 45 % (опыт), P<0.001.
Обсуждение
Использование кокультуры или монослоя клеток гранулёзы овариальных фолликулов животных в клеточных репродуктивных технологиях обусловлено их большой значимостью при росте и созревании ооцитов in vivo. Гранулёза - продуцент стероидов, вовлеченных в приобретение ооцитом компетентности к оплодотворению и формированию эмбрионов. Кроме того, гранулезные клетки участвуют в реализации эффектов многих гипофизарных гормонов при культивировании in vitro [6]. Понятно, что сохранность клеток гранулёзы после обработки сверхнизкими температурами в значительной степени обеспечит «качество» среды для культивирования женских гамет. Ранее в наших исследованиях выявлены положительные эффекты наночастиц ВДК на сохранность нативных клеток гранулёзы свиней, что выражалось в снижении уровня апоптозов
Н атн вкые о оцепы Девл трнф ицнро в здкые
ооцига
■ Консоль ■0,00!%ВДК
Рис. 2. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий x2):a:c; a:d; b:c; b:d; c:dP<0.001.
(метод проточной цитофлуориметрии), увеличении количества жизнеспособных клеток и снижении доли клеток с пикнотически-ми ядрами [4]. В настоящем исследовании в сравнительном аспекте проанализированы деструктивные процессы (апоптоз) в натив-ных и подвергшихся воздействию сверхнизких температур (витрификация) клетках гранулёзы коров до и после культивирования при введении в состав криопротекторных и культуральных сред наночастиц ВДК. В целом анализ результатов проведенных исследований выявил положительный эффект наночастиц ВДК на статус хроматина нативных и деви-трифицированных клеток гранулёзы коров при их культивировании до 48 часов, что позволяет рекомендовать использование наночастиц ВДК в технологии экстракорпорального созревания ооцитов коров (время созревания гамет in vitro 24 часа). Увеличение количества жизнеспособных клеток обеспечит их функциональную активность и необходимую продукцию
К 70
60
S 50
о о •-- 40
X 30
5 э 20
§ 10
£ 0
с
I
НатнвкьЕе ооциты
Девитр н фн цнро ван н ые
ООЦИТЫ
■ Контроль □ 0.00 ТО ВДК
Рис. 3. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (24 часа культивирования, TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий
Х2)-а:с; а:ё; Ь:с; с:с1р<0 001
Рис. 4. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифи-цированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (48 часов культивирования, TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий х2); а:Ьр<0.01; а:с; а:Л; Ь:с; Ь:Л; с:Лр<0.001
11
биологически активных веществ, вовлеченных в процессы формирования яйцеклетки.
Заключение
Совершенствование клеточных репродуктивных технологий, базовой технологией которых является технология экстракорпорального созревания ооцитов in vitro, зависит от создания унифицированных методов культивирования половых и соматических клеток овариаль-ных фолликулов, создания систем созревания с использованием структурных компонентов фолликулов и, прежде всего, гранулёзы. Модернизация сред культивирования и этапов технологии витрификации с использованием наночастиц вызывает необходимость оценки характера их воздействия на клетки. В настоящем исследовании в результате воздействия наночастиц ВДК (концентрация 0,001 %) выявлены эффекты снижения уровня апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулёзы при пролонгированном культивировании до 48 часов, что свидетельствует о целесообразности их включения в состав криопро-текторных и культуральных сред.
Работа выполнена в соответствии с темой Министерства образования Российской Федерации, номер госрегистрации -АААА-А18-118021590132-9.
Список литературы
1. Бойцева Е. Н. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на апоптоз сперматозоидов Bos
taurus. / Е. Н. Бойцева, Н. В. Бычкова, Т. И. Кузьмина // Цитология, 2017, т. 59, № 5, с. 375-380.
2. Зюзюн А. Б. Застосування наноматерiалу в ембрюгенетичнш OTCTeMi in vitro отриман-ня ембрюшв свиней / А. Б. Зюзюн, О. В. Щербак, О. С. Осипчук, С. I. Ковтун, В. В. Дзщюк // Фактори експериментально! еволюци органiзмiв. 2015. Т. 17. С. 164-168.
3. Кузьмина Т. И. Модернизация этапов технологии экстракорпорального созревания донорских ооцитов Bos taurus / Т. И. Кузьмина, А. В. Молчанов, Т. И. Станиславович, Д. Н. Татарская // Аграрный научный журнал. 2017. № 3. С. 9-14.
4. Кузьмина Т. И. Эффекты наночастиц высокодисперсного кремнезема на статус хроматина соматических клеток фолликулов свиней / Т. И. Кузьмина, Д. А. Новичкова, О. А. Епишко, И. В. Чистякова // Ветеринария. 2017, № 2. С. 43-45.
5. Чистякова И. В. Воздействие кремнийсодержа-щих соединений на развитие доимплантационных эмбрионов Bos taurus / И. В. Чистякова, Т. И. Кузьмина, Т. И. Станиславович, Т. Г. Хонина // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. СПб. 2018. С.105-108.
6. Heleil B. Involvement of Granulosa Cells in Realization of Prolactin Effects on the Developmental Competence of Bovine Oocytes Matured in vitro / В. Heleil, T. I. Kuzmina, H. Alm, O. Scotti, A. Tuchscherer, H. Torner // Journal of American Science. 2010, 6(9). P. 796-805.
7. Paul A. K. Vitrification of bovine matured oocytes and blastocysts in a paper container / A. K. Paul, Y. Liang, K. Srirattana, T. Nagai, R. Parnpai // Anim. Sci. J. 2018. V.89. 2. P. 307-315.
8. Park M. J. Effective oocyte vitrification and survival techniques for bovine somatic cell nuclear transfer / Park M. J. // Cell Reprogram. 2015. V.17(3). P. 199-210.
9. Soo-Young Y. Development of genome engineering technologies in cattle: from random to specific / Soo-Young Y., Ki-Young Y., Woo-Jae C., Goo J. // Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018. 9:16.
Объективная проверка слуха у животных. BAER тест
С 2018 года ЧОУ ДПО "Институт Ветеринарной Биологии" проводит обучающий курс по объективной проверке слуха у животных, проведению BAER-теста у собак, кошек и других видов животных. Курс включает в себя теоретическую и практическую программы. В теоретической части занятий, слушатели знакомятся с теорией процесса регистрации вызванных слуховых потенциалов и основами нейрофизиологии. За время практических занятий каждый курсант обучается самостоятельно проводить осмотр животного перед проведением BAER теста, проверять племенные документы (для выписки сертификата допуска в разведение) непосредственно выполнять BAER тест, фиксировать данные тестирования, интерпретировать данные тестирования, выписывать экспертное заключение о результатах BAER теста. По окончании курсов слушатели, прошедшие итоговое испытание, получают СЕРТИФИКАТ СПЕЦИАЛИСТА по проведению BAER теста.
Курс рассчитан на практикующих ветеринарных врачей. На курсах организована продажа книг по ветеринарии. Вы можете забронировать интересующие вас издания через форму на сайте, а оплатить и получить заказ в первый день занятий. Место проведения: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, д. 3, лит. Б, ЧОУ ДПО "Институт Ветеринарной Биологии" (схема проезда)
Предварительная регистрация обязательна! Для регитсрации на данный курс необходимо прислать заявку в свободной форме на адрес E-mail: virclin@mail.ru
