CC BY
44
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ © НОВИЧКОВА Д.А., КУЗЬМИНА Т.И., 2019
Новичкова Д.А., Кузьмина Т.И.
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЛИПИДОМА В ООЦИТАХ SUS SCROFA DOMESTICUS
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста»,
196601, г. Санкт-Петербург, Пушкин
С помощью визуализации флуоресцентным зондом Nile red интрацеллюлярных липидов в ооци-тах свиней оценены морфофункциональные показатели (морфология и локализация) липидных капель в ооцитах после культивирования с 0,001% наночастицами высокодисперсного кремнезема (ВДК). После культивирования с нВДК сохраняется тенденция к достоверному превышению доли ооцитов с гранулярными липидными каплями над долей гамет со смешанными липидными каплями «диффузной» локализации. Показано, что при введении в среду культивирования 0,001% наночастиц ВДК в ооцитах не происходит негативных изменений, приводящих к нарушениям в функционировании липидома донорских ооцитов свиней, что является одним из свидетельств возможности использования нВДК в системах дозревания женских гамет.
Ключевые слова: ооцит; Sus Scrofa domesticus; липидные капли; наночастицы высокодисперсного кремнезема.
Для цитирования: Новичкова Д.А., Кузьмина Т.И. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на функционирование липидома в ооцитах Sus Scrofa domesticus. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(1): 140-144.
Для корреспонденции: Новичкова Дарья Андреевна, научный сотрудник лаборатории биологии развития Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста», 196601, г. Санкт-Петербург, Пушкин. E-mail: live8avis@mail.ru
Novichkova D.A., Kuzmina T.I. EFFECT OF HIGHLY DISPERSED SILICA NANOPARTICLES ON THE FUNCTIONING OF LIPIDOME IN SUS SCROFA DOMESTICUS OOCYTES
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry, St. Petersburg, Pushkin, 196601, Russian Federation
Using visualization of intracellular lipids in pig oocytes with a Nile redfluorescent probe, morphofunc-tional indices (morphology and localization) of lipid droplets in oocytes after cultivation with 0.001% highly dispersed silica nanoparticles (nHDCs) were evaluated. After cultivation with nHDCs, the tendency to a significant excess of the share of oocytes with granular lipid drops over the share of gametes with mixed lipid drops of "diffuse" localization persists. It that the introduction into the culture medium of 0.001% of nHDCs in oocytes was shown to fail to result in negative changes, leading to disturbances in the functioning of the lipidome ofporcine donor oocytes, which is one of the indications that nHDCs can be used in female gamete maturation systems.
Keywords: oocyte; Sus Scrofa domesticus; lipid drops; highly dispersed silica nanoparticles.
For citation: Novichkova D.A., Kuzmina T.I. Effect of highly dispersed silica nanoparticles on the functioning of lipidome in Sus Scrofa domesticus oocytes. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(1): 140-144. (In Russ.).
For correspondence: Daria A. Novichkova, Researcher, Laboratory of Development Biology, Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding,Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry, St. Petersburg Petersburg, Pushkin, 196601, Russian Federation. E-mail: live8avis@mail.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: February 5, 2019 Accepted: February 21, 2019
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
Введение
Внедрение в практику животноводства и биомедицину инновационных разработок и достижений клеточных репродуктивных технологий позволит значительно интенсифицировать решение задач промышленного свиноводства, активизировать исследования в области ксе-нотрансплантации органов свиней. Технология экстракорпорального созревания ооцитов свиней, несмотря на имеющиеся сведения о получении большого количества потомков от оплодотворенных in vitro гамет, требует совершенствования и дальнейших разработок [1]. Использование в средах для культивирования наноматериалов представляет несомненный интерес с точки зрения необходимости их модернизации. Важным вопросом возможности использования наночастиц в технологии экстракорпорального созревания гамет является их безопасность. Оценка токсического влияния продуктов нанотехнологии (нанообъектов, наночастиц, нанокомпозитов) на живые организмы, а также ткани и клетки, в особенности гаметы, нуждается в разработках тест-систем [2]. В качестве моделей для изучения воздействия наноразмерных веществ можно предложить репродуктивные клетки свиней (Sus Scrofa domesticus), содержащие высокий уровень ин-трацеллюлярных липидных капель (ЛК). Ин-трацитоплазматические липидные капли играют важную роль в энергетическом метаболизме во время созревания яйцеклетки, оплодотворении и раннем эмбриональном развитии [3]. В связи с важной ролью в завершении созревания донорского ооцита липидома ооцита, его функционирование в условиях применения на-номатериалов может явиться одним из маркеров цитотоксичности используемых веществ [4].
Наиболее распространённым веществом, присутствующим практически во всех органах и тканях обитателей нашей планеты, является биогенный микроэлемент - кремний. Этот микроэлемент представляет собой один из объектов для создания наносоединений. Кремний-содержащий нанокомпозит, - гидрофильное вещество, которое проявляет высокую сорбци-онную емкость белков, способность к агглютинации микроорганизмов, при взаимодействии с
клеточной мембраной влияет на биологические объекты. Описанные свойства высокодисперсного кремнезема обусловлены нанодисперсно-стью частиц (4-40 нм) в сочетании с химической активностью поверхности [5, 6]. В предыдущих исследованиях было показано положительное влияние, внесенных в среду созревания наноча-стиц ВДК на синхронизацию ядерно-цитоплаз-матического созревания ооцита in vitro, а также формирование зигот и дробление эмбрионов свиней до стадии ранней морулы [6], на экспансию кумулюсных клеток [7].
В связи с вышеописанным, цель настоящего исследования - идентификация характера воздействия наночастиц высокодисперсного кремнезема (нВДК) на показатели функционального состояния липидома созревших in vitro ооцитов свиней.
Материал и методы
Объектом исследования служили ооцит-ку-мулюсные комплексы (ОКК), выделенные из постмортальных яичников свиней породы лан-драс (6-8 мес). Ооцит-кумулюсные комплексы с гомогенной ооплазмой, окруженные не менее чем 5 слоями клеток кумулюса, аспирировали из фолликулов диаметром 3-5 мм. Контрольную группу ОКК культивировали в среде Sage Media Cleavage (SMC, «Coopersurgical», США) с добавлением 5% Serum Protein Substitute (SPS, «Coopersurgical», США), 10М.Е. хорионического гонадотропина человека («Sigma», США). Культивирование опытной группы клеток проводили в среде с добавлением 0,001% высокодисперсного кремнезема (Украина, г Калуш Ивано-Фран-ковской области). Режим культивирования: 44 ч при 37,5 °С в атмосфере 5% СО2, соответствовал описанному в методических рекомендациях, разработанных в лаборатории биологии развития ФГБНУ ВНИИГРЖ [8]. Прокультивированные ооцит-кумулюсные комплексы денуди-ровали. Далее окрашивали флюоресцентным красителем Nile red в концентрации 1 Mm. Для этого краситель растворяли в среде для культивирования без высокодисперсного кремнезема, затем ооциты погружали в раствор и выдерживали при комнатной температуре в темноте 5 мин. Окрашенные гаметы отмывали в контрольной среде. Оценку морфологии и локализации липидных капель проводили с помощью микро-
Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на функционирование липидома в ооцитах Sus Scrofa domesticus
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Рис. 1. Классификация ооцитов по морфологии цитоплазматических липидных капель: а - «гранулы»; б - «смешанные». Шкала 50 ^т.
скопа Carl Zeiss Axio Imager.A2m (длины волн -Ex / Em = 552/636 nm). Статистический анализ -с использованием критерия Фишера. Результаты обрабатывали с помощью программного пакета Statistica. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при 3 уровнях значимости: p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001, для 3-5 независимых экспериментов.
Результаты
Внутриклеточные липиды - динамичные ор-ганеллы, необходимые для обеспечения энергией процессов роста и созревания ооцитов. Они меняют свою форму, объем и локализацию в ооплазме, а также взаимодействуют с другими органеллами в процессе созревания [9]. Состояние липидных капель является одним из важных маркеров завершенности ядерно-цитоплазмати-ческого созревания ооцитов. Популяцию гамет
разделяли по морфологии интрацеллюлярных липидных капель: 1) «гранулы» - ооциты, содержащие мелкие липидные капли, или гранулы, по размеру не превышающие 10% от диаметра оо-цита; 2) «смешанные» - ооциты с мелкими (гранулами) и крупными (кластерами) липидными каплями (рис. 1). Отмечено, что ооциты с положительными качественными морфологическими характеристиками содержат липидные капли в виде гранул [10]. Кроме того, присутствие преимущественно гранулированных форм липид-ных капель в ооцитах на стадии завершения созревания является признаком потенций ооцита к успешному оплодотворению в дальнейшем [11].
Эту же популяцию клеток оценивали по локализации липидных капель в ооплазме: «хаотичная», «диффузная» и «периферийно-пери-нуклеарная» в соответствии с градацией, предложенной Агш и др. (рис. 2) [11].
Рис. 2. Оценка локализации цитоплазматических липидных капель: а - периферическо-перинуклеарная; б - диффузная, в - хаотичная. Шкала 50 ^т.
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
Рис. 3. Влияние нВДК на интрацитоплазматическую локализацию липидных капель разной морфологии в ооцитах свиней, визуализированных Nile red (время культивирования - 44 ч, n ооцитов - 234). Контроль: Sage Media Cleavage + Serum Protein Substitute + хорионический гонадотропин человека; опыт: контроль + 0,001% ВДК. Достоверные различия по критерию Фишера:a:b'c:d'e:f'g:h р < 0,05.
Ранее выявлены высокие потенции к мейо-тическому созреванию ооцитов, содержащих липидные капли с гранулированной формой и периферийно-перинуклеарной или диффузной интрацитоплазматической локализацией [12, 13]. В результате мониторинга показателей функциональной активности липидома отмечено различие в характере соотношения показателей «гранулы: смешанные» как в опытной- 68% (40/59) против 50% (29/58), соответственно (р < 0,05), так и в контрольной- 73% (52/71) против 57% (26/46), соответственно (р < 0,05), группах ооцитов с «диффузной» локализацией липидных капель (рис. 3). Между долями гамет «гранулы: смешанные» с хаотичной локализацией также отмечено достоверное различие (р < 0,05) в контрольной группе - 16% (11/71) против 32% (15/46) с достоверностью р < 0,05; а также в опытной группе - 24% (14/59) против 38% (22/58), соответственно. Показательно,
что после культивирования с нВДК сохраняется тенденция к достоверному превышению доли ооцитов с гранулярными липидными каплями над долей гамет со смешанными ли-пидными каплями «диффузной» локализации.
Заключение
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что при введении в среду культивирования 0,001% наночастиц ВДК в ооцитах не происходит негативных изменений, приводящих к нарушениям в функционировании липидома донорских ооцитов свиней, что подразумевает возможность использования нВДК при моделировании систем дозревания женских гамет.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО РФ (номер госрегистрации -АААА-А18-118021590132-9).
Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на функционирование липидома в ооцитах Sus Scrofa domesticus
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА
1. Кузьмина Т.И., Новичкова Д.А., Епишко О.А., Чистякова И.В. Воздействие наночастиц высокодисперсного кремнезема на статус хроматина соматических клеток фолликулов свиней. Ветеринария. 2017; 2: 43-5.
2. Абаева Л.Ф., Шумский В.И., Петрицкая Е.Н., Рогат-кин Д.А., Любченко П.Н. Наночастицы и нанотехно-логии в медицине сегодня и завтра. Альманах клинической медицины. 2010; 22: 10-6.
3. Dunning K.R., Russell D.L., Robker R.L. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty acids and P-oxidation. Reproduction. 2014;148(1):15-27.
4. Новичкова Д.А., Кузьмина Т.И., Усенбеков Е.С., Шахтамиров И.Я., Мутиева Х.М. Липидный анализ ооцитов Sus Scrofa Domesticus в зависимости от их функционального состояния. Вестник науки Казахского агротехнического университета имени С. Сей-фуллина. Астана.: 2017; 93(2): 69-75.
5. Новичкова Д.А., Кузьмина Т.И., Щербак О.В., Гала-ган Н.П., Епишко О.А. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на морфологию и интраци-топлазматическую локализацию липидных капель в ооцитах свиней. Розведення i генетика тварин. 2017; 53: 284-92.
6. Зюзюн А.Б., Щербак О.В., Осипчук О.С., Ков-тун С.1., Дзiцюк В.В. Застосування наноматерiалу в ембрюгенетичнш системi in vitro отримання ембрюшв свиней. Фактори експериментально'1 еволюцИ органiзмiв. 2015; 17: 164-8.
7. Новичкова Д.А., Кузьмина Т.И., Ковтун С.И., Галаган Н.П. Использование наноматериалов в биотехнологии экстракорпорального созревания донорских ооцитов свиней. Сборник тезисов «III Международная выставка-конференция «БИОИНДУСТРИЯ 2013». СПб; 2013.
8. Кузьмина Т.И., Альм Х., Торнер Х. Методы получения эмбрионов свиней in vitro. СПб., Пушкин, 2008. 36.
9. Prates E.G., Nunes J.T., Pereira R.M. A Role of Lipid Metabolism during Cumulus-Oocyte Complex Maturation: Impact of Lipid Modulators to Improve Embryo Production. Mediators of Inflammation. 2014; 2014: 692067.
10. Dadarwal D., Adams G.P., Hyttel P., Brogliatti G.M., Caldwell S., Singh J. Organelle reorganization in bovineoocytesduring dominant follicle growth and regression. Reprod. Biol. Endocrinol. 2015; 13: 124.
11. Niu Y., Wang Ch., Xiong Q., Yang X., Chi D., Li, P. Liu H., Li J., Huang R. Distribution and content of lipid droplets and mitochondria in pig parthenogenetically activated embryos after delipation. Theriogenology. 2015; 83:131-8.
12. Ariu F., Strina A., Murrone O., Falchi L., Bebbere D., Ledda S., Zedda M.T., Pau S., Bogliolo L. Lipid droplet distribution of immature canine oocytes in relation to their size and the reproductive stage. Animal Science Journal. 2016; 87:147-50.
13. Gao Q. The lipid droplet-a well-connected organelle / Q. Gao, J.M. Goodman . Front CellDev Biol. 2015; 3: 49.
REFERENCES
1. Kuzmina T.I., Novichkova D.A., Epishko O.A., Chistya-kova I.V. The impact of highly dispersed silica nanopar-ticles on the chromatin status of somatic cells of porcine follicles. Veterinariya, 2017; 2: 43-5. (in Russian)
2. Abaeva L.F., Shumsky V.I., Petritskaya E.N., Rogatkin D.A., Lyubchenko P.N. Nanoparticles and nanotechnol-ogy in medicine today and tomorrow. Almanakh Klin-icheskoyMediciny, 2010; 22: 10-16. (in Russian)
3. Dunning K.R., Russell D.L., Robker R.L. Lipids and oo-cyte developmental competence: the role of fatty acids and P-oxidation. Reproduction, 2014; 148(1): 15-27.
4. Novichkova D.A., Kuzmina T.I., Usenbekov E.S., Shakhtamirov I.Ya., Mutieva Kh.M. Lipid analysis of Sus Scrofa Domesticus oocytes depending on their functional state. Science Bulletin of the Kazakh Agrotechni-cal University named after S. Seifullin. Astana, 2017; 2 (93): 69-75 (in Russian)
5. Novichkova D.A., Kuzmina T.I., Shcherbak O.V., Galagan N.P., Epishko O. A. Effect of highly dispersed silica nanoparticles on morphology and intracytoplasmic localization of lipid droplets in pig oocytes. Rosary and genetics tvarin, 2017; 53: 284-292.
6. Zyuzun AB, Shcherbak A.V., Osipchuk A.S., Kovtun S.I., Dzytsyuk V.V. The use of nanomaterial in the em-bryogenetic system of in vitro production of pig embryos. Factors of experimental evolution of organisms, 2015; 17: 164-168.
7. Novichkova D.A., Kuzmina T.I., Kovtun S.I., Galagan N.P. The use of nanomaterials in the biotechnology of extracorporal maturation of donor oocytes of pigs. Proceedings of the III International Exhibition and Conference «BIOINDUSTRY 2013». St. Petersburg, 2013. (in Russian)
8. Kuzmina T. I., Alm H., Turner H. Methods for obtaining embryos of pigs in vitro. St. Petersburg, Pushkin, 2008. 36. (in Russian)
9. Prates E.G., Nunes J.T., Pereira R.M. A Role of Lip-id Metabolism during Cumulus-Oocyte Complex Maturation: Impact of Lipid Modulators to Improve Embryo Production. Mediators of Inflammation, 2014; 2014:692067.
10. Dadarwal D., Adams G. P., Hyttel P., Brogliatti G. M., Caldwell S., Singh J. Organelle reorganization in bovi-neoocytesduring dominant follicle growth and regression. Reprod Biol Endocrinol, 2015; 13: 124.
11. Niu Y., Wang Ch., Xiong Q., Yang X., Chi D., Li P., Liu H., Li J., Huang R. Distribution and content of lipid droplets and mitochondria in pig parthenogenetically activated embryos after delipation. Theriogenology, 2015; 83: 131-138.
12. Ariu F., Strina A., Murrone O., Falchi L., Bebbere D., Ledda S., Zedda M.T., Pau S., Bogliolo L. Lipid droplet distribution of immature canine oocytes in relation to their size and the reproductive stage. Animal Science Journal, 2016; 87: 147-150.
13. Gao Q., Goodman J.M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol., 2015; 3: 49.
Поступила 05.02.2019 Принята в печать21.02.2019
