CC BY
209
ТОМ 1
НОМЕР 4
ОКТЯБРЬ - ДЕКАБРЬ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О Н КОгематология
ДИАГНОСТИКА
ГЕМОБЛАСТОЗОВ
Оценка интенсивности флюоресценции методом проточной цитометрии: методические аспекты внедрения в диагностику онкогематологических заболеваний
А. В. Куртоеа [1,2], Е. Б. Русанова [1], Е. Е. Зуева [1]
РЕФЕРАТ
Оценка интенсивности флюоресценции маркера представляет собой важный компонент анализа трансформированных клеток при диагностике онкогематологических заболеваний методом проточной цитометрии. Достоверность полученных результатов во многом зависит от соблюдения определенных правил при сборе и анализе данных. Представленная работа посвящена методическим аспектам учета интенсивности флюоресценции в рамках диагностики онкогематологических заболеваний методом проточной цитометрии в лечебнопрофилактических учреждениях и ориентирована на опытных врачей клинической лабораторной диагностики.
Ключевые слова
интенсивность флюоресценции, проточная цитометрия, диагностика онкогематологических заболеваний.
Fluorescence intensity assessment in flow cytometry: practical guidelines for diagnostics in oncohema-tology
A. V. Kurtova [1,2], Ye. B. Rusanova [1], Ye. E. Zueva [1] SUMMARY
Assessment of marker’s fluorescence intensity is an important step in analysis of transformed cells as a part of flow cytometry diagnostics in oncohematology. Reliability of the results obtained is strongly dependent upon the process of data collection and analysis. This work is focused on the methodological points important for the assessment of fluorescence intensity in routine flow cytometry diagnostics of oncohematological disorders and can be mostly interesting for experienced flow cytometry specialists.
Keywords:
fluorescence intensity, flow cytometry, diagnostics in oncohematology.
[1] Center for Laboratory Diagnostics, Pavlov State Medical University,
St.-Petersburg
[2] Leukemia Department, M.D.Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA
Контакты: immunology.spbgmu@gmail.com ринято в печать: 3 октября 2008 г.
Оценка иммунофенотипического профиля трансформированных клеток является одним из базовых компонентов диагностики онкогематологических заболеваний. Антигенный профиль, позволяющий дифференцировать нормальные и трансформированные клетки, может быть успешно идентифицирован при помощи окрашивания с использованием меченых моноклональных антител. Классическая многоцветная проточная цитометрия в подавляющем большинстве случаев проводит границу между позитивными и негативными клетками, реже применяя более дифференцированную оценку позитивности в зависимости от яркости флюоресценции с выделением популяций dim и bright. Активное развитие метода проточной цитометрии позволило значительно расширить возможности более детальной оценки показателей флюоресценции.
В последнее время анализу интенсивности флюоресценции маркеров уделяют особое внимание именно в онкогематологии по двум причинам. Во-первых, интенсивность флюоресценции (ИФ) напрямую отражает степень 1 2
экспрессии определенных молекул, имеющих диагностическую ценность. Поэтому учет ИФ позволяет расширить характеристику трансформированных клеток и выйти за пределы дихотомического анализа позитивности/ негативности. Во-вторых, достаточно острой проблемой в диагностике онкогематологических заболеваний является определение границы позитивности окрашивания. Относительное содержание (процентное выражение количества) позитивных клеток среди всех анализируемых событий, безусловно, оправдано в случае дискретного разделения целевой популяции (например, учет CD34+ гемопоэтических стволовых клеток в трансплантате среди всех С045-позитивных клеток). Тем не менее определение процента позитивных клеток бывает затруднено и невоспроизводимо во многих клинически значимых ситуациях, например:
• при градиентной экспрессии маркера, в частности маркеров ми-елоидного направления диффе-ренцировки при восстановлении костного мозга после химиотерапии или при трансформации мие-
310
[1] Центр лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург
[2] Leukemia Department М. D. Anderson Cancer Center, Хвюстон.шт. Техас, США
Методические аспекты иммунодиагностики гемобластозов
4
Рис. 1. Градиентная экспрессия маркера. При исследовании клеточного состава костного мозга больного с миелодиспластическим синдромом в стадии трансформации на гистограмме CD45/SSC основную массу событий составляют клетки с промежуточным уровнем экспрессии CD45, не формирующие отчетливого кластера по уровню гранулярности и представляющие собой трансформированные миелоидные клетки. Уровень экспрессии CD15 внутри данной популяции может быть расценен как градиентный, что подтверждается на одномерной гистограмме уровня экспрессии CD15, где синим обозначен уровень негативного контроля для данной популяции, а красным — уровень экспрессии CD15
800
000
400-
200
I ' ' ' I ' ' ' I ' ' ' I
200 400 600 800
FSC-H: Forward Scatter
10z
FL1-H: CD5 FITC
10^ 10J FL1-H: CD5 FITC
Рис. 2. Одновременная экспрессия маркера на сохранных и трансформированных клетках. Фрагмент анализа мононуклеарной фракции периферической крови пациента с верифицированным В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ). На гистограмме параметров светорассеяния (FSC/SSC) представлена превалирующая лимфоидная популяция. На гистограмме CD5/CD19 можно четко выделить две популяции: минорная популяция сохранных Т-лимфоцитов, негативных по CD19, и преобладающая популяция позитивных по CD19 трансформированных В-лимфоцитов. Несмотря на различный уровень экспрессии CD5, обе популяции могут быть расценены как С05-положительные. На одномерной гистограмме уровня экспрессии CD5 синим цветом обозначен уровень экспрессии маркера на трансформированных CD5+CD19+ В-лимфоцитах, а красным — уровень экспрессии маркера на Т-лимфоцитах CD5+CD19- (МП — mean fluorescence intensity, средняя ИФ)
лодиспластического синдрома в острый миелобласт-ный лейкоз (рис. 1);
• при совместном анализе сохранных и трансформированных клеток, экспрессирующих один и тот же маркер, например аберрантная экспрессия CD5 при В-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях (рис. 2) или CD4 — при острых моно-бластных лейкозах.
В таких ситуациях оценка ИФ становится оптимальным решением для получения достоверных и воспроизводимых результатов.1
Теоретической основой данного подхода является определение ИФ как доли общего излучения, испускаемого при возбуждении флюорохрома лазером проточного цитометра.2 ИФ является объективным свойством меченных флюорохромом частиц и пропорциональна количеству испускаемых за единицу времени фотонов. Определение ИФ в абсолютных единицах, тем не менее, достаточно затруднительно в рутинной практике, поскольку полностью зависит от учета и обработки сигнала флюоресценции, на которые оказывает влияние множество внешних факторов. В связи с этим для диагностических целей более обоснована относительная оценка ИФ.
Возможность относительной оценки ИФ, как правило, является базовой опцией программного обеспечения практически всех проточных цитометров. ИФ может быть отра-
жена в виде одномерных гистограмм флюоресценции, поделенных на фиксированное число каналов (64, 128, 256, 512 или 1024). События, попадающие в самый низкий канал, обладают самым слабым сигналом, а события в самых высоких каналах — самым выраженным сигналом. Для адекватной оценки всех исследуемых популяций установки проточного цитометра (особенно на фотоумножителях) подбирают таким образом, чтобы все события (в т. ч. и целевая популяция) располагались между самым низким и самым высоким каналами.
Корректно подобранное пространство анализа в значительной степени влияет на правильность интерпретации полученных данных. Теоретически пространство гистограммы (рис. 3) при анализе должно быть разделено на четыре основных части:
• background (фон) (содержит клетки, негативные по учитываемому маркеру, и дебрис — фрагменты эритроцитов, возникающие в процессе пробоподготовки, а также остатки разрушенных клеток);
• dim (содержит клетки с низким уровнем экспрессии целевого маркера);
• moderate (содержит клетки с промежуточным уровнем экспрессии целевого маркера);
• bright (содержит клетки с ярким уровнем экспрессии учитываемого маркера).
www .medprint.ru
311
А. В. Куртова и др.
BACKGROUND DIM MODERATE BRIGHT
а й
10° 101 1Q2 103 1Q4
log
Рис. 3. Пространство анализа для оценки интенсивности флюоресценции. Выделение четырех областей анализа во многом является условным и служит, прежде всего, для контроля правильности подобранных для анализа установок: так, в случае чрезвычайно яркой экспрессии целевого маркера (например, CD138 при множественной миеломе) популяция клеток может лишь частично отображаться в bright-части гистограммы и, следовательно, требует корректировки напряжения на фотоумножителе в сторону снижения
Важным аспектом при анализе ИФ является оценка аутофлюоресценции. Степень аутофлюоресценции оказывает значительное влияние на интерпретацию результатов, в частности при низкой интенсивности экспрессии целевого маркера. Особое внимание данному вопросу необходимо уделять при работе с высоко активированными лимфоцитами, гранулоцитами (в частности, эозинофилами при иммунофенотипи-ровании гиперэозинофильного синдрома), при диагностике острых миелобластных лейкозов (особенно, промиелоцитар-ного) и хронических лимфопролиферативных заболеваний с присутствием ворсинчатых лимфоцитов (рис. 4).
Правильность наложения компенсаций также чрезвычайно важна для корректного учета ИФ. Отсутствие или неверное наложенные компенсации могут приводить к искажению показателей ИФ.
С внедрением в диагностическую практику проточных цитометров, позволяющих использовать окрашивание с 4—6 флюорохромами, отдельной проблемой стал подбор оптимальной комбинации флюорохромов для учета ИФ.3 Максимальная чувствительность необходима для учета таких антигенов, уровень экспрессии которых является ожидаемо низким (например, CD5 при В-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях) либо количество экспрессирующих его клеток ожидаемо мало (например, учет CD56 при оценке минимальной остаточной болезни в случае множественной миеломы). Такие маркеры следует анализи-
ровать с использованием антител, конъюгированных с фико-эритрином (РЕ), фикоэритриновыми тандемами либо с алло-фикоцианином. Важно помнить, что яркие маркеры в таком случае не следует учитывать с использованием флюорохромов, имеющих спектральное перекрытие с флюорохромом, выбранным для обеспечения высокой чувствительности. В случае фикоэритрина критичным является учет ярко экспрессируемых маркеров с использованием в качестве флюорохромов флюоресцеинизотиоцианата (FITC) или фикоэри-триновых тандемов.
Фикоэритрин — предпочтительный флюорохром для оценки ИФ, поскольку в его конъюгатах соотношение флюорохром/белок составляет 1:1, что позволяет напрямую соотносить ИФ с плотностью экспрессии маркера. В случае использования диагностических моноклональных антител, конъюгированных с флюорохромами в другом соотношении, расчет ИФ должен быть проведен с соответствующей поправкой для корректного отображения связи между ИФ и количеством связанных антител.4,5
Внедрение в практику препаратов целевого действия на основе моноклональных антител (анти-СИ20, анти-СИ52, анти-СИЗЗ и др.) делает чрезвычайно востребованным исследование ИФ данных молекул на поверхности трансформированных клеток при диагностическом иммунофенотипи-ровании для прогнозирования возможной эффективности терапии.6,7 В связи с тем, что экспрессия указанных молекул не ограничена трансформированными клетками, а может присутствовать и на нормальных клетках, особое внимание уделяется стратегии гейтирования целевой популяции. Якорные антитела, используемые для гейтирования, не должны влиять на ИФ целевого маркера. Как было указано выше, необходимо тщательно подбирать комбинации флюорохромов для обеспечения максимальной чувствительности анализа. Альтернативным решением может быть применение подхода к гейтированию методом исключения (в частности, использование CD3 при В-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях). Ограничения по использованию флюорохромов при оценке rf/m-экспрессии могут быть значительно сглажены в случае анализа экспрессии маркеров на различных клеточных популяциях. Так, CD3 экспрессируется на Т-лимфоцитах, a CD20 — на превалирующей популяции В-лимфоцитов, поэтому в данной ситуации возможно использование подобной (CD3-FITC/CD20-РЕ) комбинации даже на каналах с перекрытием спектров.
FL1: CD45 FL1 'Э131 FL1 І0С31
Рис. 4. Определение уровня аутофлюоресценции при остром промиелоцитарном лейкозе. Фрагмент анализа клеточного состава костного мозга больного с верифицированным острым промиелоцитарным лейкозом, подтвержденным наличием сбалансированной транслокации t(15;17). На первой гистограмме (CD45/SSC) отчетливо выявляется кластер клеток с низким уровнем гранулярности и высоким уровнем CD45, т. е. соответствующих лимфоцитам. Основную массу событий (84,2%) составляют клетки с высоким уровнем гранулярности и сниженным по сравнению с лимфоцитами уровнем экспрессии CD45. Для каждой из описанных популяций определен уровень аутофлюоресценции: на второй гистограмме показан уровень аутофлюоресценции лимфоцитов, на третьей — высокогранулярных клеток, морфология которых соответствует промиелоцитам. Дальнейший анализ экспрессии маркеров миелоидного ряда и HLA-DR был проведен с учетом уровня аутофлюоресценции промиелоцитов и позволил подтвердить типичный для данного заболевания иммунофенотип
312
Клиническая онкогематология
Методические аспекты иммунодиагностики гемобластозов
Рис. 5. Бимодальное распределение. Фрагмент анализа клеточного состава фракции мононуклеаров периферической крови больного с верифицированным В-ХЛЛ. Несмотря на гомогенный уровень экспрессии В-ассоциированных маркеров CD19 и CXCR5, по уровню экспрессии CD62L трансформированные В-лимфоциты могут быть разделены на две популяции: негативные и позитивные по CD62L. На основании этого на третьей гистограмме представлены две кривые: унимодальная кривая изотипического контроля (синий цвет) и бимодальная кривая экспрессии CD62L (красный цвет). Сохранность экспрессии CD62L трансформированными лимфоцитами при В-ХЛЛ сейчас рассматривается как позитивный прогностический критерий
При клинических исследованиях оценки эффективности препарата часто возникает необходимость сопоставления ИФ определенного маркера между различными образцами. Для корректного сравнения необходимо соблюдать несколько условий.
Во-первых, форма распределения ИФ должна быть сопоставима. Бимодальное (рис. 5), мультимодальное, асимметричное распределение искажают данные ИФ, что требует изменения стратегии гейтирования для выделения популяций с гомогенной эк экспрессией маркера.
Подобные трудности могут возникать в случае анализа биклональных лейкозов, миеломонобластных лейкозов, когда популяция бластов представлена несколькими клонами.
Вторым условием является неизменность настроек прибора при учете средней ИФ в различных образцах, анализ которых разнесен во времени. Помимо сохранения установок анализа можно также использовать подход по анализу экспрессии якорных маркеров на остаточных сохранных лимфоцитах в качестве внутрилабораторного биологического контроля.8
Сбор сопоставимого количества событий внутри гейта, ограничивающего целевую популяцию, является третьим важным аспектом для проведения сопоставлений. Особенно это важно при анализе образцов, где содержание бластов невелико (миелодиспластические синдромы в фазе трансформации), а также при выраженной цитопении на момент диагностики.
Определение относительной ИФ обладает значительной информативностью именно при диагностике онкогематоло-гических заболеваний. В ряде случаев идентификация трансформированных клеток возможна за счет того, что яркость экспрессии целевого маркера на них отлична от нормальных клеток (рис. 6).
Более того, оценка ИФ определенных маркеров позволяет субклассифицировать некоторые заболевания в условиях использования ограниченной панели реагентов: в частности, CD20dlm/moderate позволяет идентифицировать В-ХЛЛ, аномальный CD20brlght — В-клеточные неходжкинские лимфомы, отличные от ХЛЛ.6 Анализ ИФ CD 19 также может быть использован для дифференциальной диагностики В-клеточных лимфом маргинальной зоны с атипичной морфологией и CD 10-негативной фолликулярной лимфомы: для лимфом маргинальной зоны характерен значительно более яркий уровень экспрессии CD 19 при сопоставимом уровне экспрессии CD20.9
Лимфома мантийной зоны во многих случаях также представляет собой сложную диагностическую задачу, по-
скольку отсутствие экспрессии CD23 не всегда сопутствует данному заболеванию, что приводит к постановке ошибочного диагноза В-ХЛЛ. Вата и соавт. показали, что ИФ CD23 более 44,5 единиц флюоресценции строго ассоциирована с диагнозом В-ХЛЛ, тогда как при более низком уровне экспрессии CD23 должно быть дополнительно назначено исследование наличия транслокации t(l 1; 14) для исключения лимфомы мантийной зоны.10
Оценка ИФ CD45 может быть использована для подтверждения диагноза при первичном иммунофенотипирова-нии В-клеточных хронических лимфопролиферативных за-
4КЯ ■
бЛЙСПГЫ
йгям -
S їбрис Т5 в
ига ■
со. 'рамные пиft фоциглы
ю“ 101 1#! ID3 10*
FU С0*5
Рис. 6. Оценка интенсивности флюоресценции CD45 для идентификации трансформированных клеток при диагностике острого лейкоза. Сниженный уровень экспрессии CD45 позволяет надежно разделять популяции трансформированных клеток и сохранных лимфоцитов при диагностике острых лейкозов. Средняя ИФ (СИФ) по CD45 дебриса и негативных событий, входящих в данной ситуации в одну популяцию, соответствует 5,9. СИФ сохранных лимфоцитов больше 1000. Промежуточное положение занимают трансформированные клетки, бласты, СИФ которых незначительнобольше 100. На основании СИФ CD45 среди клеток низкого уровня гранулярности четко выявлены сохранные лимфоциты, негативный по CD45 дебрис и трансформированные клетки, бласты
www.medprint.ru
313
А. В. Куртова и др.
ГООО
ЮС
10
01:2_24“. осовел a
■ ^
03:10.3$“ / J3V$d.54v-
- v і Г&* ■ •
’ J
tooo-
2 Щ *
У
п
Е
100£ 01
Ql:5l OSH їШ
J . ОСЭ1ЛЭИ • Фот - Щ . Лчґ‘\-
Рис. 7. 7. Анализ интенсивности флюоресценции CD3 при хроническом лимфопролиферативном заболевании. При первичном скрининге образца костного мозга были выявлены относительный Т-клеточный лимфоцитоз (а) и разделение популяции CD3+ Т-лимфоцитов по уровню экспрессии CD3 (в), что позволило предположить наличие лимфомы из Т-лимфоцитов с гамма-дельта формой Т-клеточного рецептора, подтвержденной позднее при анализе Т-клеточных рецепторов (6)
01
1 10 100 1000 FU pipiw-ода
О -1—^p^j' 1Ч1»11.||'1
Г <Hm 1 mod 1
HI СРЗ
болеваний: так, наиболее низкий уровень экспрессии CD45 характерен для В-ХЛЛ, относительно низкий — для лимфомы мантийной зоны, промежуточный — для лимфомы маргинальной зоны, пролимфоцитарного лейкоза и фолликулярной лимфомы. Наиболее яркий уровень экспрессии CD45 характерен для волосатоклеточного лейкоза, а также для лимфомы мантийной зоны с экспрессией CD23 и В-ХЛЛ с атипичной морфологией.11
Определенные цитогенетические нарушения при В-ХЛЛ также связаны с различным уровнем экспрессии маркеров, используемых в рутинной диагностике. Трисомия по хромосоме 12 ассоциирована с более ярким уровнем экспрессии CD 19, CD20 и CD79b по сравнению с образцами В-ХЛЛ без цитогенетических нарушений; del( 13q) — с более ярким уровнем экспрессии CD20, FMC7 и CD5; del(l lq) — с ярким уровнем экспрессии CD38, FMC7 и CD25.12
При Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях ряд редких патологий может быть идентифицирован по анализу ИФ поверхностного CD3 (в частности, высокий уровень экспрессии CD3 при лимфоме из гамма-дельта Т-лимфоцитов)(рис. 7).
Среди других возможных приложений анализа ИФ следует упомянуть выделение прогностических групп при диагностике острых миелобластных лейкозов на основании уровня экспрессии CD34, CD 117, CXCR4 (CD184),13-14 а также потенциальную ценность при дифференциальной диагностике зрелых миелопролиферативных заболеваний.15
Таким образом, оценка ИФ — достаточно важный компонент анализа, необходима при диагностике онкогемато-логических заболеваний и может быть внедрена в рутинную практику без дополнительных финансовых вложений, но при соблюдении следующих условий:
• тщательный подбор комбинации используемых антител;
• стабильная чувствительность и обязательная калибровка проточного цитометра;
• включение в анализ только репрезентативных популяций клеток с правильно наложенными логическими ограничениями;
• корректные компенсации;
• правильная статистическая обработка данных и сбор достаточного количества событий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wells D. A., Loheri М. R. Flow cytometric mean fluorescence intensity: the biophysics behind the number. Leuk. Res. 2008; 32: 845-6.
2. Henderson L. O., Marti G. E., Gaigalas A. et al. Terminology and nomenclature for standardization in quantitative fluorescence cytometry. Cytometry 1998; 33: 97-105.
3. Maecker H. T., Frey T., Nomura L. E., Trotter J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A 2004; 62A: 169-73.
4. Schwartz A., Marti G. E., Poon R. et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescent standards used for flow cytometry. Cytometry 1998; 33: 106-14.
5. Gratama J., d’Hautcourt J. E., Mandy E. et al. Flow cytometry quantitation of immunofluorescence intensity: problems and perspectives. Cytometry 1998; 33: 166-78.
6. Delgado J., Matutes E., Morilla A. et al. Diagnostic significance of CD20 and FMC7 expression in В-cell disorders. Am. J. Clin. Pathol. 2003; 120: 754-9.
7. KJabusay M., Suhova V., CoupekP. et al. Different levels of CD52 antigen expression evaluated by quantitative fluorescence cytometry are detected on B-lymphocytes, CD34+ cells and tumor cells of patients with chronic В-cell lymphoproliferative diseases. Cytometry Part В 2007; 72B: 363-70.
8. Ratei R., Kyrawajew E., Eacombe E. et al. Normal lymphocytes from leukemic samples as an internal quality control for fluorescence intensity in im-munophenotyping of acute leukemias. Cytometry Part В 2006; 70: 1-9.
9. Host С. B., Holden J. T, Mann К P. Marginal zone В-cell lymphoma: A retrospective immunophe-notypic analysis. Cytometry Part В 2008: In Press.
10. Barna G., ReinigerL., TatraiP. etal. The cut-off levels of CD23 expression in the differential diagnosis of MCL and CLL. Hematol. Oncol. 2008: In Press.
11. Carulli G., Cannizzo E., Zucca A. et al. CD45 expression in low-grade В-cell non-Hodgkin»s lymphomas. Leuk. Res. 2008; 32: 263-7.
12. Quijano S., Eopez A., Rasillo A. et al. Impact of trisomy12, del(13q), del(17p) and del(11q) on the immunophenotype, DNA ploidy status, and proliferative rate of leukemic В-cells in chronic lymphocytic leukemia. Cytometry Part В 2008; 74B: 139-49.
13. Advani A. S., Rodriguez C., Jin T. et al. Increased C-kit intensity is a poor prognostic factor for progression-free and overall survival in patients with newly diagnosed AML. Leuk. Res. 2008: In Press.
14. Spoo A., Eubbert W., Wierda U"., Burger J. CXCR4 is a prognostic marker in acute myelogenous leukemia. Blood 2007; 109: 786-91.
15. Wood B. L. Myeloid malignancies: myelodis-plastic syndromes, myeloproliferative disorders, and acute myeloid leukemia. Clin. Lab. Med. 2007; 27: 533Щ9.
314
Клиническая онкогематология
