CC BY
356
УДК 616.7+616/618:611.41/.42
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХРОНИЧЕСКИХ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
А.В. Новицкий, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.В. Тыренко, А.М. Иванов Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
FLOW CYTOMETRY IN DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF CHRONIC B-CELL LYMPHOPROLIFERATIVE DISODERS
A.V. Novitskiy, V.Yu. Nikitin, I.A. Suchina, V.V. Tyrenko, A.M. Ivanov,
Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2011
Проточная цитометрия является современным методом определения поверхностных и внутриклеточных маркеров. В соответствии с данными современной иммунофенотипической классификации зрелых В-клеточных лейкозов выделяют 4 основных группы этих заболеваний: наиболее часто встречающейся формой является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) и более редкие - В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) и волосатоклеточный лейкоз вариант (ВКЛв). Проведение иммунофенотипирования с помощью мультипараметрической проточной цитометрии позволяет четко отдифференцировать эти четыре основных типа зрелых В-клеточных лейкозов. При некоторых формах В-НХЛ в процесс часто оказываются вовлеченными клетки крови и костного мозга. В тех случаях, когда число лейкемических НХЛ-клеток резко возрастает, дифференциация между хроническим В-клеточным лейкозом и В-НХЛ довольно сложна. В этих случаях необходимо проведение иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Иммунофенотипирование является также важным для проведения дифференциальной диагностики между классическими вариантами В-ХЛЛ и диссеминированными формами В-НХЛ, такими как: лимфома маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами (ЛСВЛ), лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) и фолликулярная лимфома (ФЛ). Иммунофенотипирование хронических лимфолейкозов проводится в 2 этапа с помощью тройных комбинаций прямых моноклональных антител, меченных FITC, РЕ, PerCp или РС5. На первом этапе осуществляется первичный скрининг и определение линейной принадлежности клеток. На втором этапе типирования (классификации) уточняется вариант хронического лимфопролиферативного заболевания.
Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, хронический
лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), неходжкинская лимфома (НХЛ), иммуноглобулин (Ig).
Flow cytometry is a modern technique for detection ofsurface membrane-bound markers and intracellular antigens. Current immunophenotypic classification of mature B-cell leukemias distinguishes four groups, namely, the most frequently occurring B-CLL, and rare B-PLL, HCL and HCLv. Multiparameter flow cytometry immunophenotyping of chronic B-cell malignancies can reliably discriminate between four these main types of mature B-cell leukemias. In some types of B-cell NHL, involvement of blood and bone marrow is frequently seen. Especially if the number of leukemic cells is high discrimination between a chronic B-cell leukemia and a leukemic B-NHL may be difficult. In such cases immunophenotyping with help flow cytometry may be helpful. In these cases immunophenotyping is also of clinical importance for distinguishing between classical B-CLL and leukaemic presentation of disseminated B-NHL such as MCL, FL or SLVL. Immunophenotyping of chronic malignancies is carried out in 2 stages with help the triple combinations of direct monoclonal antibodies labeling of three fluorochromes: FITC, PE, PerCP or PC5. Phase 1: screening and lineage definition. Phase 2: classification.
Key words: immunophenotyping, flow cytometry, chronic lymphocytic leukemia (CLL), non-Hodgkin’s lymphoma (NHL), immunoglobulin (Ig).
Последнее десятилетие принципиально изменило подход к изучению лимфоидных опухолей. Многими авторами была признана малая информативность морфологических методов исследования при ряде хронических лейкозов
и склонных к лейкемизации лимфом [1, 2, 3, 4]. Это связано с однотипной картиной абсолютного лимфоцитоза периферической крови и высокой сходности мелких или среднего размеров лимфоцитов. Так, в одном из проведенных
о<хххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххх>оо<ххххххххххххххххх>
исследований частота установления точного диагноза согласно ИЕЛЬ-классификации, по данным клинических проявлений и морфологических методов, составила 33% [5]. Учитывая эти обстоятельства, ведутся поиски новых высокоинформативных методов исследования для повседневного использования в клинической практике.
Определение варианта лимфопролиферативного заболевания методом проточной цитометрии основывается на установлении иммунофенотипа опухолевых клеток, находящихся в периферической крови или костном мозге. Это возможно благодаря сохранению малигнизиро-ванными лимфоцитами основных дифференци-ровочных антигенов клетки-предшественницы, хотя встречается их абберантная экспрессия [1]. Подходы к выбору панели моноклональных антител (МКА), алгоритмам иммунофеноти-пирования и оценке полученных результатов были предложены и обобщены сравнительно недавно [6, 7, 8]. В связи с этим информативность диагностики данной группы заболеваний методом проточной цитометрии продолжает уточняться. В данной статье анализируются данные литературы, посвященные изучению возможностей иммунофенотипического анализа с помощью метода проточной цитометрии для дифференциальной диагностики хронических В-лимфопролиферативных заболеваний.
Хронические В-клеточные лейкозы. Большинство случаев хронических лимфоцитарных лейкозов составляют В-клеточные лейкозы (95%) [9, 10]. На долю Т-клеточных хронических лейкозов приходится около 5 % от всех наблюдений хронических форм лимфолейкозов.
Они редко встречаются в Европе и США, а регистрируются в основном в Японии и странах Карибского бассейна. Доказана роль человеческого Т-клеточного вируса I типа (НТІУ-І) в развитии Т-клеточного варианта ХЛЛ.
В большинстве случаев при хроническом В-клеточном лейкозе наблюдается экспрессия поверхностного мембранного иммуноглобулина (^) [6, 11]. Так как В-клеточная малигни-зация представляет собой клональную экспансию единственной В-клетки, при хронических В-лейкозах экспрессируется только один тип легких цепей иммуноглобулинов (к или Я), поэтому для популяции злокачественных В-клеток характерно наличие выраженного дисбаланса в соотношении ^к/^Я в отличие от реактивных поликлональных В-клеток (в норме отношение ^к/^Я = 1,4, диапазон колебаний от 0,8 до 2,4). В связи с этим при проведении иммунофено-типирования В-клеточных злокачественных новообразований весьма полезным является определение соотношения легких цепей иммуноглобулинов (рис. 1). Наиболее подходящим методом для этих целей служит метод проточной цитометрии [12, 13, 14, 15].
Кроме этого, стадия дифференцировки лей-козных клеток может быть определена путем анализа различных дифференцировочных маркеров и изотипа экспрессирующейся тяжелой цепи иммуноглобулинов. В таблице суммированы иммунофенотипические характеристики хронических В-клеточных лейкозов, на которые необходимо опираться при проведении фено-типирования лимфоцитов цельной крови или костного мозга с помощью проточной цитометрии.
Рис. 1. Проточно-цитометрический анализ мононуклеарных клеток периферической крови пациента с В-ХЛЛ.
На рисунке показан анализ экспрессии на поверхности СD19+ клеток легких цепей иммуноглобулинов 8ш^к/8ш^Я. На первом точечном графике выделена популяция злокачественных клеток в зависимости от сигналов бокового (88С) и переднего светорассеяния (Р8С); а на трех остальных графиках видно, что практически все CD19+ клетки В-ХЛЛ позитивны по CD5 антигену и экспрессируют на своей поверхности 8ш^Я [6]
Иммунофенотипическая характеристика хронических В-клеточных лейкозов и В-клеточных неходжкинских лимфом в фазе лейкемизации [6, 16]
Маркеры Хронические В-клеточные лейкозы В-НХЛ в фазе лейкемизации
В-ХЛЛ В-ПЛЛ ВКЛ ВКЛв ЛСВЛ ЛКМЗ ФЛ ЛБ
Бш^ экспрессия ++* ++3 ++ ++ ++ ++3 ++3 ++
Су^-экспрессия ± ± - - ± - - -
Бш^Н изотип ц,ц5,5 (у,а) ц,ц5 (у,а) ц,ц5,у,а У ц,ц5,у ц,ц5 ц,ц5,у ц,ц5
CD19 ++ ++ ++ ++ ++ ++w ++ ++
CD20 ++* ++ ++3 ++ ++ ++3 ++ ++
CD20 (FMC7)С ± ++3 ++ ++ ++ + ++ НС
CD22 +w ++3 ++3 ++ ++3 + ++ ++
CD23 ++ - - ± ± - ± -
CD24 ++ ++ - - ++ ++ ++ ++
CD5/CD6 ++ ± - - ± ++ ± -
CD10 - ± ± - ± - +w ++3
CD11c + - ++ + + - - -
CD25 +w - ++ - ± - - -
CD103 - - ++ + ± - - -
HC2 - - ++ - - - - -
Примечание: «-» - <10% лейкозов позитивны; «±» - 10-25% лейкозов позитивны; «+» - 25-75% лейкозов позитивны; «++» - >75% лейкозов позитивны; <^» - слабая экспрессия антигена; «3» - сильная экспрессия антигена; «с» - моноклональное антитело БМС7 связывается со специфической конформацией CD20 антигена (вероятно, это мультимерный CD20 комплекс); НС - нет сообщений; В-ХЛЛ - хронический лимфолейкоз; В-ПЛЛ - пролимфоцитарный лейкоз; ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз; ВКЛв - ВКЛ вариант; ЛСВЛ -лимфома маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами; ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны; ФЛ - фолликулярная лимфома; ЛБ - лимфома Беркитта.
Хронические В-клеточные лейкозы внутри могут быть классифицированы на 4 группы. Наиболее часто встречающейся формой является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ), составляющий 85-90% хронических В-клеточных лейкозов. Далее следуют редкий В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (В-ПЛЛ) (< 5%), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) (5-10%) и редкая форма этого заболевания - волосатоклеточный лейкоз, вариант (ВКЛв).
При некоторых формах В-НХЛ в процесс часто оказываются вовлеченными клетки крови и костного мозга. В тех случаях, когда число лей-кемических НХЛ-клеток резко возрастает, дифференциация между хроническим В-клеточным лейкозом и В-НХЛ довольно сложна. В этих случаях необходимо проведение иммунофено-типирования с помощью проточной цитометрии. Мультипараметрическое иммунофено-типическое исследование позволяет провести
надежную дискриминацию между различными типами и подтипами этих зрелых В-клеточных малигнизаций. Наиболее часто встречающимися видами В-НХЛ, с которыми приходится проводить дифференциальную диагностику хронических лейкозов, являются: лимфома маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами (ЛСВЛ), лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ), фолликулярная лимфома (ФЛ) и лимфома Беркитта (ЛБ) [9, 10].
Хронический В-клеточный лимфолейкоз. Классическая классификация В-ХЛЛ. Злокачественные клетки при В-ХЛЛ относительно небольшие, но обычно они несколько больше по размерам, чем нормальные лимфоциты [17].
В-клеточный хронический лимфолейкоз характеризуется слабой экспрессией поверхностного мембранного ^ [18, 19]. В некоторых случаях В-ХЛЛ экспрессия не может быть обнаружена при помощи флюоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Наиболее
распространенным типом экспрессируемой тяжелой цепи Ig является изотип Ig^, реже экспрессируются изотипы Ig^5 или Ig5 (табл.) [18, 19]. Дополнительной характерной особенностью В^ЛЛ является обнаружение позитивной экспрессии на лимфоцитах CD5 и CD6 антигенов [1В, 19]. Необходимо отметить, что экспрессия CD5 не является специфичной для В^ЛЛ, так как этот антиген экспрессируется при целом ряде других В-клеточных малигни-заций (табл. 1) [9, 10]. В то же время при некоторых вариантах В^ЛЛ может отсутствовать позитивная экспрессия CD5 антигена. Фенотип CD5- В^ЛЛ чаще всего встречается у пожилых пациентов, для которых характерным является менее выраженный лимфоцитоз, но в то же время более быстрое течение болезни и короткая продолжительность жизни по сравнению с теми больными, у которых В^ЛЛ имеет фенотип CD5+[18, 19, 20]. Большинство случаев В^ЛЛ являются позитивными по CD23 антигену, экспрессия которого не обнаруживается при ряде других В-клеточных малигнизаций [10, 1В]. Отсутствие CD23 антигена или слабая экспрессия этого антигена на поверхности лимфоцитов вместе с обнаружением позитивной экспрессии по FMC7 (антиген зрелых В-лимфоцитов) ассоциируется с плохим прогнозом [1В]. При
этих иммунофенотипически атипичных вариантах В-ХЛЛ часто наблюдается высокая экспрессия поверхностного ^М. В заключение необходимо отметить, что в настоящее время предложена бальная система оценки различных иммунофенотипических признаков для постановки диагноза В-ХЛЛ [21, 22, 23, 24]. Диагноз В-ХЛЛ ставится на основании обнаружения, по крайней мере, четырех признаков из следующих пяти основных черт, характерных для данного заболевания: слабая плотность экспрессии Бш^, позитивность по антигенам CD5 и CD23, слабая экспрессия CD79b/CD22 и негативность по FMC7. Если сумма баллов составляет от 4 до 5 баллов, то в таком случае диагностируется В-ХЛЛ. В свою очередь, другие варианты хронических В-лейкозов и В-НХЛ обычно характеризуются наличием не более двух вышеперечисленных иммунофенотипических признаков, и сумма баллов при этих заболеваниях от 0 до
2. Упрощенная иммунофенотипическая идентификация случаев с типичными для В-ХЛЛ характеристиками (SшIgdim+/CD5+/CD23+) ассоциирована со значительно лучшим прогнозом, по сравнению с другими зрелыми В-клеточными лейкозами, при которых наблюдается различная экспрессия одного из этих трех маркеров [25]. На рис. 2 приведен пример случая В-ХЛЛ.
Рис. 2. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельной крови пациента с В-ХЛЛ. В данном случае лимфоциты имеют характерный для В-ХЛЛ иммунофенотип: SmIgкdiш+/CD19+/ CD5+/CD23+/CD20diш+/CD24+/CD38+/FMC7-
Последние достижения в классификации В-ХЛЛ. За последние 10 лет при проведении молекулярных исследований генов Ig накоплено достаточно фактов, указывающих на гетерогенность происхождения В-ХЛЛ. В результате этого была идентифицирована субпопуляция клеток при В-ХЛЛ без соматических гипермутаций генов Ig, соответствующая уровню наивных или «девственных» (прегерминальных) В-лимфоцитов. Показано, что именно на этом уровне развития В-лимфоцитов также происходит опухолевая трансформация с последующим блоком их дальнейшей дифференцировки и пролиферация (размножение) клона опухолевых клеток. Эта опухолевая трансформация ассоциирована с более агрессивной биологией опухоли и худшим прогнозом. Недостаток соматических мутаций в этой пре-фолликулярной популяции В-ХЛЛ коррелирует с определяемой с помощью проточной цитометрии позитивностью по ZAP-70 и, в меньшей степени, позитивностью по CD38 [26]. Экспрессия суррогатного маркера мутационного статуса вариабельных участков генов Ig - белка ZAP-70 (70-kD zeta -associated protein) интенсивно исследуется в последние годы. Показано, что экспрессия этого белка при данном варианте ХЛЛ ассоциируется с плохим прогнозом. Экспрессия CD38 на более чем 20% CD19+CD5+-клеток также ассоциирована с плохим прогнозом. Полученные данные свидетельствуют о том, что пациенты с иммунофенотипически незрелым CD38+ В-ХЛЛ плохо отвечают на длительную мультирежимную химиотерапию и поэтому имеют короткую продолжительность жизни [26].
Не менее часто встречается В-ХЛЛ с опухолевой трансформацией постгерминальных (клетки-памяти) В-лимфоцитов, о чем свидетельствуют обнаруживаемые соматические гипермутации генов вариабельного региона иммуноглобулинов [27, 28, 29]. Большинство случаев этих лейкозов позитивны по CD27 (В-клетки-памяти). Таким образом, в соответствии с мутационным статусом вариабельного региона Ig могут быть выделены два варианта В-ХЛЛ: с мутациями (IgVmut+) и без мутаций вариабельного региона Ig (IgVmut-). Группа больных IgVmut- характеризуется неблагоприятным прогнозом по сравнению с пациентами группы IgVmut+. Мутационный статус вариабельного региона Ig может служить ориентировочным прогностическим маркером.
Редкие формы В-ХЛЛ. В пределах клона злокачественных клеток при В-ХЛЛ могут встре-
чаться клетки большего размера, такие как пролимфоциты или клетки похожие на иммуно-бласты. Кроме того, у части пациентов с В-ХЛЛ найдены клетки с чертами лимфоплазмоцито-идной дифференцировки (т.е. су^ экспрессия).
У некоторых пациентов с В-ХЛЛ в период прогрессирования болезни возрастает число пролимфоцитов. Когда этот процент составляет от 10 до 55%, предполагают наличие диагноза пролимфоцитарной трансформации В-ХЛЛ [29]. Тем не менее, клетки в этих случаях обычно имеют типичный для В-ХЛЛ иммунофенотип.
В-пролимфоцитарный лейкоз. В-ПЛЛ -редкий тип хронического В-клеточного лейкоза с содержанием в костном мозге более 55% пролимфоцитов и наличием гиперлейкоцитоза в периферической крови (>100х109/л). Пролимфоциты представляют собой круглые лимфоидные клетки средних размеров с одной крупной нуклеолой, локализованной в центре, на которых обнаруживается высокая плотность Бш^ и примерно в равных пропорциях экспрессируются изотипы тяжелых цепей иммуноглобулинов и [9, 10]. Чаще всего лимфоциты при В-ПЛЛ негативны по CD5, CD6 и CD23 антигенам, в то же время на их поверхности отмечается сильная экспрессия CD22 и FMC7 (конформа-ционный эпитоп молекулы CD20) (табл.). Иногда возникает проблема дифференциации между В-ПЛЛ и В-ХЛЛ с высоким содержанием пролимфоцитов, так как 32% В-ПЛЛ являются CD5+ и 18% СD23+. В этих случаях важным маркером является CD79b, который экспрессируется практически у всех пациентов В-ПЛЛ и лишь у 16% больных В-ХЛЛ [8]. На рис. 3 приведен пример случая В-ПЛЛ. В данном случае пациенту после проведения проточно-цитометрического исследования лизированных клеток цельной крови был поставлен диагноз В-пролимфоцитарного лейкоза на основании обнаружения в костном мозге моноклональной В-клеточной популяции (гейт 112), с высокой плотностью поверхностной легкой к-цепи ^, сильной экспрессией антигенов CD20, СD22 и CD24, а также позитивной по антигенам CD19, FMC7, CD11c, CD5 и CD38.
Волосатоклеточный лейкоз и ВКЛ-вариант. Злокачественные клетки при ВКЛ среднего размера с округлым, овальным, почковидным ядром и обильной цитоплазмой. Для них характерно наличие цитоплазмы с отростками, напоминающими волоски, которые дают типичную «морфологическую картину светорассеяния» при проточно-цитометрическом анализе (рис. 4
о<хххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххх>оо<ххххххххххххххххх>
и рис. 5) [30]. Клетки при ВКЛ имеют высокие сигналы SSC (такие же, как и моноциты), поэтому их можно пропустить в том случае, если при анализе взять в гейт (выделить) клетки, дающие сигналы светорассеяния, характерные для лимфоцитов. Иммунофенотипический анализ маркеров при ВКЛ свидетельствует о том, что фенотип ВКЛ-клеток уникален (табл.) [9, 10, 30, 31]. Для них характерна высокая экспрессия Бш^, иногда или ^ц5, но чаще экспрессируются изотипы ^у или ^а, вместе с другими цепями ^. В большей степени это относится к подклассу ^у3 [32]. Для антигенов CD20 и CD22 характерна высокая плотность экспрессии, практиче-
ски все клетки при ВКЛ позитивны по СБ11е, СБ25, НС2 и СБ103 антигенам (табл.) [9, 10, 30,
31, 33]. Последний антиген распознается с помощью МКА В-1у-7. Как оказалось, он является наиболее специфичным маркером для диагностики ВКЛ, так как только небольшая фракция В-лимфоцитов селезенки и ассоциированных со слизистыми Т-лимфоцитов являются позитивными по антигену СБ103 [33, 34]. НС2 антиген, также является высокоспецифичным маркером для диагностики ВКЛ [8]. Интересным является тот факт, что большинство форм ВКЛ являются негативными по В-клеточному маркеру СБ24 [16].
Рис. 3. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельной крови пациента В-ПЛЛ
Рис. 4. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельного костного мозга пациента с ВКЛ.
На 1-м точечном графике зависимости сигналов переднего и бокового светорассеяния можно выделить две отдельных популяции клеток (гейты Я2 и Я3), иммунофенотип которых соответствует фенотипу ВКЛ-клеток: СD19+CD20+CD25+FMC7+CD11c+Smк+CD103+
Рис. 5. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельного костного мозга пациентки с В^.
На 1-м точечном графике выделены нормальные лимфоциты (lymphocytes) и В^-лимфоциты (lymphocytes-HCL); на 2-м точечном графике (CD3/CD19) - нормальные Т- и В-лимфоциты; на всех остальных графиках представлены ВKЛ-клетки, позитивные по следующим антигенам: CD19, CD20 (ярко), CD22, CD25, FMC7, CD11c, Sm^ CD103
ВКЛв имеет высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, круглое ядро и часто содержит выступающее ядрышко [35]. Число лейкемических клеток в периферической крови обычно выше при ВКЛв, чем при классической форме ВКЛ. Основным иммунофено-типическим отличием ВКЛв от ВКЛ является практически полное отсутствие экспрессии антигенов СD25 (а-цепь рецептора ИЛ-2) и HC2 на поверхности клеток (табл.) [8, 31, 35]. Интересно, что р-цепь рецептора ИЛ-2 (антиген СD122) экспрессируется на клетках как при ВКЛ, так и при ВКЛв [31]. На рис. 4 приведен пример случая ВКЛ. Это довольно интересный вариант ВКЛ, так как здесь при исследовании обнаружено 2 популяции клеток с иммунофенотипом ВКЛ-лимфоцитов (гейты 112 и 113). В гейте Ш расположены нормальные лимфоциты. На 2-м графике видно, что обе эти популяции расположены выше лимфоцитов, так как имеют высокие сигналы бокового светорассеяния.
На рис. 5 приведен еще один пример случая ВКЛ. В этом случае на точечном графике зависимости сигналов переднего и бокового
(ББ^ светорассеяния можно выделить две отдельных популяции клеток, одна из которых
располагается в лимфоцитарном окне, а другая располагается несколько выше зоны нормальных лимфоцитов. При анализе степени экспрессии различных антигенов на этих клетках обнаружена яркая экспрессия антигенов CD20 и CD22. Клетки также позитивны по антигенам CD19, CD11c, CD25, CD103, Бшк, FMC7 и негативны по CD10, CD24, CD79a, CD5 и CD23. Этот иммунофенотип клеток является классическим для ВКЛ.
В-клеточные неходжкинские лимфомы в фазе лейкемизации. При целом ряде В-НХЛ наблюдается относительно высокая тенденция к диссеминации злокачественных клеток в кровь или костный мозг, например, при лимфо-ме из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ), фолликулярной лимфоме (ФЛ), лимфоме селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами (ЛСВЛ).
Лимфома маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами. Клетки при ЛСВЛ небольшого размера с округлым ядром и умеренно базофильной цитоплазмой, на которой имеются тонкие короткие выросты, локализованные на одной стороне клетки. При ЛСВЛ обычно наблюдается быстрая диссеминация злокачественных клеток в костный мозг и пери-
ферическую кровь. Поэтому при цитоморфоло-гическом анализе опухолевых клеток при ЛСВЛ очень часто можно неправильно поставить диагноз В-ХЛЛ, В-ПЛЛ или ВКЛ [9, 10, 16]. Отличить ЛСВЛ от В-ХЛЛ можно при проведении иммунофенотипирования с МКА к СD5, CD22, CD23, FMC7 и 8^ (^ц, к- и Я- легкие цепи). Обычно при ЛСВЛ клетки негативны по антигенам СD5 и CD23, но в отличие от В-ХЛЛ они характеризуются наличием нормальной или сильной мембранной экспрессии одной из легких цепей ^ (иногда cyIg экспрессией в части клеток), поверхностных антигенов CD22 и FMC7 [8]. В то же время необходимо отметить, что примерно в 20% случаев при данной лим-фоме злокачественные клетки экспрессируют CD5 [8]. Еще одним дополнительным отличием ЛСВЛ от В-ХЛЛ является то, что клетки при этой лимфоме чаще экспрессируют мембранную форму антигена CD79b, а при В-ХЛЛ обнаруживается, как правило, цитоплазматический антиген CD79a [8].
При проведении дифференциальной диагностики между ВКЛ и ЛСВЛ необходимо, прежде всего, обращать внимание на тот факт, что в большинстве случаев ЛСВЛ являются негативными по антигенам CD25 и CD103 (табл.) [9, 10, 16, 36]. Для дифференциации между ВКЛ и ЛСВЛ можно использовать комбинацию из четырех МКА к СD11c, CD25, CD103 и HC2, которые дают позитивное окрашивание при ВКЛ [8]. Из этих антигенов только CD11c постоянно позитивен при ЛСВЛ. Позитивные результаты с тремя другими МКА при ЛСВЛ наблюдались с HC2 в 9%, с CD103 в 15% и с CD25 в 25% случаев [8]. На рис. 6 приведен пример случая ЛСВЛ. При иммунофенотипическом исследовании клеток лизированной цельной крови в лимфоцитарном гейте (И1) обнаружены клетки позитивные по CD22 (сильная экспрессия), по СD19, CD20, СD24, с умеренной экспрессией антигенов СD11c и FMC-7, с экспрессией только легкой поверхностной к-цепи ^.
Рис. 6. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельной крови пациентки с ЛСВЛ. Опухолевые клетки в данном случае позитивны по следующим антигенам:
CD19, 8шк (слабо), CD20, CD22, CD24, РМС7(слабо), CD11c (елабо)
Лимфома из клеток мантийной зоны. Клетки при данном типе лимфом малого и среднего размеров со скудной цитоплазмой, с ядрами неправильной и/или расщепленной формы. ЛКМЗ часто диссеминирует как в костный мозг, так и в периферическую кровь с высоким содержанием злокачественных клеток.
Лимфоциты в лейкемической фазе при лим-фоме из клеток мантийной зоны CD5+ и имеют умеренную по интенсивности экспрессию поверхностного Бт^цб [9, 10, 16, 37]. В отличие от В-ХЛЛ при ЛКМЗ отмечается сильная экспрессия антигена CD20, позитивность по РМС7, слабая экспрессия CD19 антигена и отсутствие позитивности по CD23 [37]. В плане дифференциальной диагностики между В-ХЛЛ и ЛКМЗ весьма удачным является использование тройного окрашивания МКА к антигенам CD5/CD23/ CD19. В этом случае при В-ХЛЛ клетки имеют поверхностный фенотип CD5+CD23++CD19+, а при ЛКМЗ - CD5+CD23-CD19+. Антиген CD79a также используется для дифференциации между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. При В-ХЛЛ антиген CD79а
негативен и слабо позитивен, а при ЛКМЗ сильно позитивен. При проведении дифференциальной иммунофенотипической диагностики можно также опираться на данные об экспрессии антигена CD79b на мембране лейкемических клеток при различных зрелых В-клеточных опухолях [8]. Так, позитивная экспрессия этого антигена наблюдается при ЛКМЗ в 92,3% и при ЛСВЛ в 83,3% случаев. При В-ХЛЛ и ВКЛ он экспрессируется очень редко в 5% и 25% случаев соответственно. Важным свойством клеток при ЛКЗМ является обнаружение позитивного окрашивания с Циклином Д1 [21, 38]. Гиперэкспрессия Циклина Д1 вызвана переносом генов BCL1 и тяжелой цепи ^ (В^1-^Н), который происходит вследствие транслокации t (11; 14). На рис. 7 приведен пример случая ЛКМЗ. В этом случае обнаружены СD5+ В-клетки, в связи, с чем необходимо проводить дифференциальный диагноз с В-ХЛЛ. В отличие от В-ХЛЛ, клетки в данном случае имеют яркую экспрессию антигенов СD20 и БтА,, позитивны по FMC7 и негативны по CD23.
СОЮ ЯТС ЯНСТРГС
Рис. 7. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельного костного мозга пациента с ЛКМЗ. На графике показано выделение гейта по пан-В-клеточному маркеру CD19. Опухолевые клетки в данном случае позитивны по следующим антигенам: CD19, 8шА, (ярко), CD20 (ярко), РМС7, CD5, CD22
Фолликулярная лимфома. При фолликулярной лимфоме наблюдается быстрая прогрессия в лейкемическую фазу. Иммунофенотип клеток при ФЛ характеризуется достаточно высокой плотностью экспрессии Бт^ (наиболее часто ^М). Как и большинство хронических лейкозов, лимфоциты при ФЛ позитивны по антигенам CD19, CD20, CD22 и CD79a. Довольно часто при ФЛ регистрируется слабая степень экспрессии антигена CD10, иногда CD43 [9, 14, 28]. В
некоторых случаях клетки позитивны по антигенам CD5 и CD23 [21]. Очень важно отметить, что практически при всех фолликулярных лим-фомах обнаружена гиперэкспрессия В^2 протеина. С помощью проточно-цитометрического определения внутриклеточного содержания В^2 можно провести четкую дифференциацию между слабой экспрессией его в нормальных реактивных клетках и гиперэкспрессией BCL2 в клетках ФЛ. Повышенный синтез BCL2
протеина возникает вследствие транслокации ^14;18), в результате которой происходит перемещение гена ВСЬ2 для контроля над геном ^Н. Опухолевые клетки экспрессируют также ядерный белок ВСЬ6. На рисунках 8 и 9 приведен пример случая ФЛ.
На рис. 8 с помощью комбинации МКА Бшк/ SшA,/CD19 обнаружена большая клональная
В-клеточная популяция с очень яркой экспрессией легкой Я-цепи
Кроме этого, использование пан-В-клеточ-ного антигена СD19 как общего реагента для гейтинга позволяет идентифицировать опухолевые клетки (рис. 33). Лимфомные клетки не экспрессируют CD5, позитивны по РМС7 и слабо позитивны по CD10.
СШЭСусЬголч Кап» ТИС
Рис. 8. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельной крови пациентки с ФЛ. На 1-м графике показано выделение гейта по пан-В-клеточному маркеру СШ9.
На 2-м графике видны опухолевые клетки позитивные по SшA,
C06RTC СОЮ те FWC7RTC
Рис. 9. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельной крови пациентки с ФЛ.
B данном случае опухолевые клетки позитивны по следующим антигенам: CD19, SmX, CD20 (ярко), CD10 (слабо),
PMC7 и негативны по CDS
Лимфома Беркитта. Лимфомные клетки при ЛБ среднего или крупного размера, с округлым ядром, с резкой базофилией и вакуолизацией цитоплазмы (морфология соответствует варианту Ь3 ОЛЛ по ФАБ классификации). Основываясь первоначально на лимфобластной цитоморфологии, В-ОЛЛ (В-1У)/ЛБ относили к опухолям из незрелых В-клеток-предшественников. Однако это оказалось неправильным, так было четко показано, что гены ^ содержат соматические мутации, которые не являются стабильными. В настоящее время предполагают, что эти опухоли происходят В-клеток фолликулярных центров [39, 40]. Это указывает на то, что В-ОЛЛ (В1У) значительно отличается от других типов
В-линейных ОЛЛ, относящихся к лейкозам из В-клеток предшественников. Учитывая известные сходства в биологии, онкогенезе и ответе на терапию между В-ОЛЛ (В-1У) и ЛБ, а также иммуногенотипические данные, было предложено заменить вводящий в заблуждение термин В-ОЛЛ (В1У) термином лейкоз/лимфома Беркитта [40].
Иммунофенотип Л Б уникален и характеризуется наличием поверхностной экспрессии Бш^М, довольно сильной степенью экспрессии антигена СD10 и отсутствием позитивного окрашивания на ТёТ [11]. Кроме этого, практически во всех случаях при ЛБ обнаруживается транслокация ^8;14) или редко встречающиеся
варианты транслокаций 1(2;8) или ^8;22), при которой происходит перенос гена с-шус из 8 хромосомы в один из генов иммуноглобулинов [41]. Таким образом, для установления точного диагноза диссеминированной ЛБ необходимо получение моноклональных антител, позволяющих определять повышенную внутриклеточно экспрессию с-шус. Пролиферирующая фракция Ю-67+-клеток при ЛБ высокая и составляет от 80 до 100%. На рис. 10 приведен пример случая Л Б. При анализе точечных графиков распределения клеток, полученных в результате проточно-цитометрического исследования
лизированных клеток цельного костного мозга, обнаружено, что опухолевые клетки составляют основную массу клеток (примерно 80%). Они довольно высокопозитивны по CD45 антигену (гейт 112) и располагаются практически рядом с небольшой зоной нормальных зрелых лимфоцитов. Эти клетки позитивны по CD10, СD19, CD20, cyCD79a, на них обнаружена экспрессия только поверхностных легких к-цепей ^ и позитивная экспрессия мембранного и цитоплазматического ^М. Лимфомные клетки негативны по ТёТ. Морфология клеток соответствовала варианту Ь3 ОЛЛ по ФАБ классификации.
Рис. 10. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельного костного мозга пациентки с лимфомой Беркитта. Опухолевые клетки в данном случае позитивны по следующим антигенам: СШ9, СШ0, С020, Smк, су^М, SшIgM, су79а, НЬЛ-ЭЯ и негативны по ТсіТ
Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВКЛ). Диффузная В-крупноклеточная лимфома включает группу опухолей с гетерогенными морфологическими, иммунофенотипиче-скими, цитогенетическими, молекулярными и клиническими особенностями [42]. Неопухолевый аналог - В-клетки зародышевого центра (центробласты) и постгерминативной зоны (им-мунобласты). Лейкемизация ДВКЛ происходит не так быстро, как при ФЛ или ЛКМЗ. Характерно поражение лимфоидной ткани, но в 49% случаев встречается экстранодальная локализа-
ция (ЦНС, кожа, желудочно-кишечный тракт, кости, яички, мягкие ткани и др.). При лейкеми-зации ДВКЛ в костном мозге и периферической крови наблюдается инфильтрация бластными клетками. Эта лимфома не имеет специфического иммунофенотипа. По сравнению с нормальными лимфоцитами, большие неопластические В-клетки ДВКЛ имеют поразительно высокие сигналы переднего светорассеяния (РБ^ [44]. Опухолевые клетки характеризуются вариабельной экспрессией пан-В-клеточных маркеров CD19, CD20, CD22 и СD79a. Несмотря
о<хххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххххх>оо<ххххххххххххххххх>
на В-клеточное происхождение, на лимфом-ных клетках не обнаруживается SmIg или cylg экспрессия [48]. В ряде случаев отмечается экспрессия антигенов CD5 или CD10. В 20-30% случаев наблюдается повышение синтеза BCL2 протеина вследствие транслокации t(14;18). В 25-40% случаев обнаруживаются транслокации или соматические мутации гена BCL6 и в 5-15% случаев транслокации гена с-Мус из 8 хромосомы в один из генов иммуноглобулинов [45, 46]. Возможна экспрессия CD30 и ЭМА (эпителиальный мембранный антиген) при отсутствии ALK-протеина (anaplastic lymphoma kinase) [16]. Пролиферативная активность клеток (Ki-67) высокая и составляет 40-90%.
Множественная миелома (ММ). ММ, локализованная первично в костном мозге, состоит
из моноклональных су^+ плазматических клеток (без определяемой экспрессии 8ш^). Моноклональные су^+ плазматические клетки при ММ позитивны по антигенам CD38 и CD138, но в то же время, в основном, негативны по всем другим В-клеточным маркерам, включая CD79 (рис. 11 и рис. 12). Малигнизированные плазматические клетки часто экспрессируют CD56 и/или СD117, тогда как экспрессия антигена CD45 часто довольно низкая (рис. 11) [47, 48]. При проведении иммунофенотипической диагностики ММ важно также знать иммунофенотип нормальных плазматических клеток. В норме плазматические клетки имеют следующий иммунофенотип: CD45+CD19+CD38+++CD138+, слабопозитивны или негативны по 8ш^, су^+ (су^к/су^А соотношение равно 0,9-2,4).
Рис. 11. Иммунофенотипическая диагностика множественной миеломы в КМ с использованием 4-цветных комбинаций МКА:
80^/80^X^019^038, CD19/CD138/CD45/CD38, CD19/CD56/CD45/CD38 и СD19/CD117/CD45/CD38. На 3 верхних графиках видны нормальные поликлональные В-лимфоциты (клетки фиолетового цвета) с фенотипом: CD19+8mк+8mА+CD38+. На всех графиках видны моноклональные клетки ММ (клетки красного цвета) с фенотипом:
CD19-CD45dlш+/-CD38+CD138+CD56+CD117+8mIgкdlш+
Рис. 12. Иммунофенотипическая диагностика множественной миеломы в КМ с использованием 4- цветных комбинаций МКА: cyІYк/cyIgА/CD45/CD38 и cyIgA/cyIgG/CD45/CD38. На всех графиках видны моноклональные клетки ММ (клетки красного цвета) с фенотипом:
cyIgк+cyIgG+cyIgA-cyIgА-
Лимфоплазмоцитарная лимфома. Опухолевая масса при этом виде лимфомы состоит из малых лимфоцитов с чертами созревания в «плазмоцитоидные» лимфоциты (иммуно-циты) и плазматических клеток [44]. Костный мозг при ЛПЛ может быть массивно поражен опухолевыми клетками, в то время как число их в периферической крови очень мало. В сыворотке крови часто обнаруживается высокая концентрация парапротеина ^М (макроглобулинемия Вальденстрема). При иммунофенотипическом анализе обнаруживается сильная, монотипич-ная, поверхностная экспрессия ^ (^ц+5) часто с одновременной экспрессией cyIg, а также экспрессия антигенов CD19 и CD20. В то же время клетки негативны по CD5, CD10 и CD23. В большом проценте случаев при ЛПЛ клетки также позитивны по CD25 [49].
Экстранодальная мукозоассоциированная В-клеточная лимфома (MALT-лимфома) и но-дальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны. «Мукозоассоциированные с лимфоидной тканью» лимфомы являются в действительности экстранодальной презентацией лимфом маргинальной зоны. При этих формах в процесс также вовлекаются лимфатические узлы и селезенка. Цитоморфологические свойства лим-фомных клеток гетерогенны [44]. Распространение злокачественных клеток в периферическую кровь и костный мозг происходит нет так часто, как при других формах лимфом. Когда происходит процесс лейкемизации количество неопластических клеток обычно низкое.
Специфических иммунофенотипических признаков для этих форм лимфом нет. Клетки обычно CD20+, CD79a+, CD5- (в отличие от ЛКМЗ и В-ХЛЛ), CD10- (в отличие от ФЛ), CD23-, CD11c (слабая экспрессия) и негативны по экспрессии Циклина Д1 (в отличие от ЛКМЗ) [44]. Часть лимфомных клеток может быть су^+.
Острый плазмобластный (плазмоклеточный) лейкоз. Острый плазмобластный лейкоз может быть этапом эволюции ММ, примерно около 2% случаев ММ в терминальной стадии трансформируются в острый плазмобластный лейкоз [1, 17]. Его частота составляет 2% среди всех плазмо-цитом. Характеризуется диффузным поражением костного мозга опухолевыми плазмобластами, которые обнаруживаются и в периферической крови, обусловливая гиперлейкоцитоз.
Всегда резко выражены признаки миелоде-прессии (анемия, тромбоцитопения, нейтро-пения). В периферической крови выявляются различные по степени зрелости плазматические клетки - плазмобласты. Экстрамедуллярные инфильтраты встречаются у 50% больных, преимущественно в печени, селезенке, лимфатических узлах, коже. По мере прогрессирования процесса инфильтраты появляются и в других органах и тканях. На рис. 13 приведен пример острого плазмобластного лейкоза. При анализе точечных графиков распределения клеток, полученных в результате проточно-цитометрического исследования, можно выделить две основных группы клеток. Небольшую область высоко-
позитивных по CD45 лимфоцитов (гейт И1), экспрессирующих Т- и В-лимфоидные антигены, а также антигены натуральных киллеров. Основную массу составляют клетки, имеющие менее выраженную экспрессию антигена СD45 и располагающиеся в гейте И2. Эти клетки нега-
тивны по основным Т- и В-лимфоидным антигенам, миелоидным антигенам, антигенам СD34 и еуТсіТ. Клетки в данном гейте имеют следующий иммунофенотип: СD38+, CD16.56+, ЫЬЛ-DR+, характерный для клеток с плазмоцитарной дифференцировкой (плазмобластов).
Рис. 13. Проточно-цитометрический анализ лизированных клеток цельного костного мозга пациента с острым плазмобластным лейкозом. Опухолевые клетки в данном случае позитивны по следующим антигенам:
CD38, CD16.56, HLA-DR
Алгоритмы иммунофенотипирования хронических лимфопролиферативных заболеваний.
Иммунофенотипирование хронических форм лимфопролиферативных заболеваний с помощью проточной цитометрии рекомендуется проводить в 2 этапа. На первом этапе осуществляется первичный скрининг и определение линейной принадлежности клеток. Наиболее удобной является панель, состоящая из 5-6 комбинаций различных маркеров. В каждую из которых обычно входит по 3 прямых МКА к различным дифференцировочным СD-антигенам. Как правило, применяются антитела, меченные тремя флюорохромами (ИТС, РЕ и Ре^р). В предварительных исследованиях всегда отрабатывается рабочее разведение МКА. Концентрация клеток в образце при проведении типи-рования должна составлять 4-7х106/мл. Пробы цельной крови или костного мозга, взятые для исследования, обычно обрабатываются лизиру-ющей смесью. Применение лизирующей смеси приводит к лизису эритроцитов и образованию
пор в мембране клеток, что делает возможным одновременное определение как поверхностных, так и цитоплазматических антигенов. В последнем случае окрашивание МКА проводится после лизиса. Для определения экспрессии целого ряда внутриклеточных антигенов рекомендуется сначала фиксировать клетки, а затем обработать пермеабилизирующим раствором и только после этого переходить к процедуре окрашивания клеток МКА. Использование на этом этапе тройных реагентов позволяет довольно быстро и просто определить линейную принадлежность исследуемых клеток. В зависимости от результатов применения первой панели на 2-м этапе типирования (классификация) уточняется вариант хронического лимфопролиферативного заболевания. При его проведении также предпочтительно использовать тройные реагенты. Мы предлагаем следующие панели МКА для проведения I и II этапов иммунофе-нотипирования хронических форм лимфопролиферативных заболеваний:
ТРЕХЦВЕТНЫЕ МКА ДЛЯ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ МАЛИГНИЗАЦИЙ (в пробах костного мозга и периферической крови)
ЗРЕЛЫЕ МАЛИГНИЗАЦИИ (В- и Т-НХЛ, В- и Т-ХЛЛ, множественная миелома)
Рис. 14. Панель МКА для проведения I и II этапа иммунофенотипирования хронических форм
лимфопролиферативных заболеваний:
1 - в случае если материал анализируется на следующий день (> 12 ч) СШ38 нужно заменить на С038; В-ХЛЛ - хронический лимфолейкоз; ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз; ЛБГЛ - лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов; ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны; ММ - множественная миелома; ПЛ - посттимические лейкозы; ПК - плазматические клетки; ТКЛ/ЛВ - Т-клеточная лимфома/лейкоз взрослых; Т-ОЛЛ - Т-острый лимфобластный лейкоз; ФЛ - фолликулярная лимфома; ^Ы - экспрессия тяжелых цепей ^; - моноклональная экспрессия легких цепей ^; еу - цитоплазматическая экспрессия;
8ш - мембранная экспрессия; TCR - Т-клеточный рецептор
Литература
1. Клиническая онкогематология / Под ред. М.А. Волковой. - М. : Медицина, 2007. -1120 с.
2. Новик, А.А. Классификация злокачественных лимфом / А.А. Новик. - СПб. : Элби, 2000. -126 с.
3. Chieng. Cytology and immunophenotyping of low- and intermediate-grade B-cell non-Hodgkin's lymphomas with a predominant smallcell component: A study of 56 cases / Chieng, J.M. Cohen., J.F. Cangiarella // Diagnostic Cytopathology. - 2000. - Vol. 24 - P. 90-97.
4. Hanson, C.A. Immunophenotypic analysis of peripheral blood and bone marrow in the staging of B-Cell malignant lymphoma / C.A. Hanson, PJ. KurtinJ.A. Katzmann [et al.] // Blood. - 1999. -Vol. 94. - P. 3889-3896.
5. Mourad, W.A. Primary diagnosis and REAL/ WHO classification of non-Hodgkin's lymphoma by fine-needle aspiration: cytomorphologic and immunophenotypic approach / W.A. Mourad,
A. Tulbah, M. Shoukri [et al.] // Diagnostic Cytopathology. - 2003. - Vol. 28. - P. 191-195.
6. Ван Донген, Ж. Проточная цитометрия в диагностике хронических лимфопролиферативных заболеваний / Ж. Ван Донген, В.Ю. Никитин // Диагностика и лечение лимфом : материалы
Российско-голландской конференции. - СПб.,
2002. - С. 7-34.
7. Braylan, R.C. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias: Results of an international consensus meeting / R.C. Braylan, A. Orfao, M.J. Borowitz [et al.] // Cytometry. - 2001. - Vol. 46. - P. 23-27.
8. Catovsky, D. Immunophenotypic analysis of chronic lymphoid leukemias / D. Catovsky // Rev. Clin. Exp. Hematol. - 1997. - Vol. 1. - P. 1-14.
9. Bain, B.J. Leukemia diagnosis: A guide to the FAB classification / B.J. Bain // Ed. Lippin cott J.B. - Philadelphia, 1990. - 360 р.
10. General Haematology Task Force of BCSH: Immunophenotyping in the diagnosis of chronic lymphoproliferative disorders // J. Clin. Pathol. -
1994. - Vol. 47. - P. 871-875.
11. Van Dongen, J.J.M. Immunobiology of leukemia / J.J.M. Van Dongen, T. Szczepanski, H.J. Adriaansen // Ed. Henderson E.S., Lister T.A., Greaves M.F. - Leukemia, Philadelphia: W.B. Saunders Company, 2002. - P. 85-129.
12. Fukushima, P.I. Flow cytometric analysis of kappa and lambda light chain expression in evaluation of specimens for B-cell neoplasia / P. I. Fukushima, P.K. Nguyen, P. O’Grady [et al.] // Cytometry. - 1996. - Vol. 26. -P. 243-249.
13. Letwin, B.W. An improved clonal excess assay using flow cytometry and B-cell gating /
B.W. Letwin, P.K. Wallace, K.A. Muirhead [et al.] // Blood. - 1990. - Vol. 75. - P. 1178-1185.
14. Smith, B.R. Circulating monoclonal B in non-Hodgkin’s lymphoma / B.R. Smith, D.S. Weinberg, N.J. Robert [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1984. -Vol. 311. - P.1476-1484.
15. Braylan, R.C. Impact of flow cytometry on the diagnosis and characterization of lymphomas, chronic lymphoproliferative disorders and plasma cell neoplasias / R.C. Braylan // Cytometry A. -2004. - Vol. 58. - P. 57-61.
16. Szczepanski, T. Classification systems for acute and chronic leukemias / T. Szczepanski, V.H.J. van der Velden, J.J.M. van Dongen // Best Practice and Research Clinical Haematology. -
2003. - Vol. 16. - P. 561-582.
17. Луговская, С.А. Лабораторная диагностика лейкозов / С.А. Луговская, В.Т. Морозова, М.Е. Почтарь. - Тверь. : Губернская медицина. -1999. - 80 c.
18. Geisler, C.H. Prognostic importance of flow cytometric immunophenotyping of 540 consecutive patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia /
C.H. Geisler, J.K. Larsen, N.E. Hansen [et al.] // Blood. - 1991. - Vol. 78. - P. 1795-1802.
19. Kurec, A.S. Immunophenotypic subclassification of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) /
A.S. Kurec, G.A. Threatte, A.J. Gottlieb [et al.] // Br. J. Haematol. - 1992. - Vol. 81. - P. 45-51.
20. Shapiro,J.L. CD5- B-cell lymphoproliferative disorders presenting in blood and bone marrow. A clinicopathologic study of 40 patients / J.L. Shapiro, M.L. Miller, B. Pohlman [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. - 1999. - Vol. 111. - P. 477-485.
21. Matutes, E. The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL / E. Matutes, K. Owusu-Ankomah, R. Morilla [et al.] // Leukemia. - 1994. -Vol. 8. - P. 1640-1645.
22. Moreau, E.J. Improvement of the Chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b) / E.J. Moreau,
E. Matutes, R.P. A’Hern [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. - 1997. - Vol. 108. - P. 378-382.
23. Matutes, E. New additions to antibody panels in the characterisation of chronic lymphoproliferative disorders / E. Matutes // J. Clin. Pathol. - 2002. - Vol. 55. - P. 180-183.
24. Никитин, В.Ю. Иммунофенотипический анализ в дифференциальной диагностике хронических лимфопролиферативных заболеваний / В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган, А.Н. Богданов //
Вестн. гематологии. - 2005. - Т.1, № 4. -С. 46-56.
25. Cro, L. Diagnostic role and prognostic significance of a simplified immunophenotypic classificaton of muture B cell chronic lymphoid leukemias / L. Cro, A. Guffanti, M. Colombi [et al.] // Leukemia. - 2003. - Vol. 17. - P. 125-137.
26. Damle, R.N. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia / R.N. Damle, T. Wasil, F. Fais [et al.] // Blood. - 1999. - Vol. 94. -P. 1840-1847.
27. Szczepanski, T. Flow-cytometric immunophenotyping of normal and malignant lymphocytes / T. Szczepanski, V.H.J. Van der Velden, J.J.M. Van Dongen //Clin. Chem. Lab. Med. - 2006. -Vol. 44. - P. 775-796.
28. Луговская, С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицын. - М. - Тверь : Триада, 2005. - 168 с.
29. Rozman, C. Chronic lymphocytic leukemia /
C. Rozman, E. Montserrat // N. Engl. J. Med. -
1995. - Vol. 333. - P. 1052-1057.
30. Robbins, B.A. Diagnostic application of two-color flow cytometry in 161 cases of hairy cell leukemia / B.A. Robbins, D.J. Ellison, J.C. Spinosa [et al.] // Blood. - 1993. - Vol. 82. -P. 1277-1287.
31. De Totero, D. Phenotypic analysis of hairy cell leukemia: «variant» cases express the interleukin-2 receptor beta chain, but not the alpha chain (CD25) /
D. De Totero, P.L. Tazzari, F. Lauria [et al.] // Blood. - 1993. - Vol. 82. - P. 528-535.
32. Kluin-Nelemans, H.C. Hairy cell leukemia preferentially expresses the IgG3-subclass / H.C. Kluin-Nelemans, M.M. Krouwels, J.H. Jansen [et al.] // Blood. - 1990. - Vol. 75. - P. 972-978.
33. Visser L., Shaw A., SlupskyJ. et al. Monoclonal antibodies reactive with hairy cell leukemia // Blood. - 1989. - Vol. 74. - P. 320-331.
34. Schlossman, S.F. Leukocyte Typing V. White cell differentiation antigens / S.F. Schlossman, L. Boumsel, W. Gilks [et al.] // Ed. Oxford University Press. - Oxford, 1994.
35. Sainati, L. A variant form of hairy cell leukemia resistant to alpha-interferon: clinical and phenotypic characteristics of 17 patients / L. Sainati, E. Matutes, S. Mulligan [et al.] // Blood. -1990. - Vol. 76. - P. 157-162.
36. Matutes, E. The immunophenotype of splenic lymphoma with villous lymphocytes and its relevance to the differential diagnosis with other B-cell disorders / E. Matutes, R. Morilla,
K. Owusu-Ankomah [et al.] // Blood. - 1994. -Vol. 83. - P. 1558-1562.
37. Molot, RJ. Antigen expression and polymerase chain reaction amplification of mantle cell lymphoma / R.J. Molot, T.C. Meeker,
C.T. Wittwer [et al.] // Blood. - 1994. - Vol. 83. -P. 1626-1635.
38. Argatoff, L.H. Mantle cell lymphoma: a clinicopathologic study of 80 cases / L.H. Argatoff, J.M. Connors, R.J. Klasa [et al.] // Blood. - 1997. -Vol. 89. - P. 2067-2078.
39. Klein, U. Burkitt’s lymphoma is a malignancy of mature B cells expressing somatically mutated V region genes / U. Klein, G. Klein, B. Ehlin-Henrikssen [et al.] // Mol. Med. - 1995. - Vol. 1. - P. 495-505.
40. Van der Burg, M. The presence of somatic mutations in immunoglobulins genes of B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL-L3) supports assignment as Burkitt’s leukemia-lymphoma rather than B-lineage ALL / M. Van der Burg,
B.H. Barendregt, E.R. van Wering [et al.] // Leukemia. - 2001. - Vol. 15. - P. 1141-1143.
41. Berger, R. Cytogenetic studies on Burkitt’s lymphoma-leukemia / R. Berger, A. Bernheim // Cancer Genetics and Cytogenetics. - 1982. -Vol. 7. - P. 231-244.
42. De Leval, L. Variability in immunophenotype in diffuse large B-cell lymphoma and its clinical relevance / L. De Leval, N.L. Harris // Histopathology. - 2003. - Vol. 43. - P. 509-528.
43. Stetler-Stevenson, M. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? /
M. Stetler-Stevenson // Best Pract. Res. Clin. Haematol. - 2003. - Vol. 16. - P. 583-597.
44. Jaffe E.S., Harris N.L., Stein H. et al. // Ed.World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, 2001. - 352 p.
45. Kramer, M.H. Clinical relevance of BCL2, BCL6, and MYC rearrangements in diffuse large B-cell lymphoma / M.H. Kramer, J. Hermans, E. Wijburg [ et al.] // Blood. - 1998. - Vol. 92. - P. 3152-3162.
46. Akasaka, T. Molecular and clinical features of non-Burkitt's, diffuse large-cell lymphoma of B-cell type associated with the c-MYC/immunoglobulin heavy-chain fusion gene / T. Akasaka, H. Akasaka,
C. Ueda [et al.] //J. Clin. Oncol. - 2000. -Vol. 18. -P. 510-518.
47. Almeida J. High-sensitive immunophenotyping and DNA ploidy studies for the investigation of minimal residual disease in multiple myeloma / J. Almeida, A. Orfao, M. Ocqueteau [et al.] // Br. J. Haematol. - 1999. - Vol. 107. - P. 121-131.
48. Rawstron, AC. Flow cytometric disease monitoring in multiple myeloma: the relationship between normal and neoplastic plasma cells predicts outcome after transplantation / A.C. Rawstron,
F.E. Davies, R. DasGupta [et al.] // Blood. - 2002. -Vol. 100. - P. 3095-3100.
49. San Miguel, J.F. Immunophenotypic analysis of Waldenstrom's macroglobulinemia / San Miguel J.F. San Miguel, M.B. Vidriales, E. Ocio [et al.] // Semin. Oncol. - 2003. - Vol. 30. P. 187-195
Контактная информация в редакции
