CC BY
8
Вячеслав Петрович Твердохлиб
доктор медицинских наук, профессор, Академик Российской академии медико-технических наук, профессор кафедры
«Производственный менеджмент» ГОУВПО «ОГИМ»
Юрий Владимирович Архипенко
доктор биологических наук, профессор, руководитель Научноисследовательской лаборатории адаптационной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова, г. Москва
Елена Николаевна Лебедева
кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Оренбургской государственной медицинской академии,
г. Оренбург, ГОУВПО «ОрГМА»
Елена Григорьевна Ревкова
Кандидат педагогических наук, заведующий кафедрой «Прикладной менеджмент»
ГОУВПО «ОГИМ»
ОЦЕНКА эффЕКТИВНОСТИ МЕТОДА профилактики и коррекции химических ПОРАЖЕНИЙ печени ЛИЦ, ЗАНЯТЫх в химической промышленности (экспериментальное ИССЛЕДОВАНИЕ)
Исследование выполнено в рамках ГК 02. 512. 12. 21 от 26. 06. 2008 г. (заказчик - Федеральное агенство по науке и инновациям)
В статье представлены результаты работы авторского коллектива в 2008-2009 гг., которые отражают оценку модифицированного метода адаптационной профилактики и коррекции ранних химических поражений ткани печени лиц, занятых в химической промышленности, выполненной на экспериментальных животных.
Ключевые слова: профилактика, химические поражения печени, эксперимент, макет установки, эффективность метода.
Токсически-индуцированная патология печени представляет одну из актуальных проблем современной медицины. Печень является высокочувствительным органом для большинства химических стрессорных раздражителей. Средовые, промышленные токсиканты, а также большинство лекарственных препаратов вызывают различные патологические изменения в печени. Часто эта патология протекает скрытно и вовремя не распознается. Если поражение печени вовремя не диагностировано и действие токсиканта продолжается, тяжесть поражения многократно возрастает [5, 7]. Существующие подходы к лечению и профилактике этих нарушений мало эффективны, что в значительной степени связано с недостаточной информированностью населения и медицинских работников о неблагоприятном воздействии ксенобиотиков на организм. При этом применяемые химические или природные гепатопротекторы либо малоэффективны, либо имеют краткую экспозицию действия и не предотвращают токсических эффектов для ткани печени ксенобиотиков и продуктов их биотрансформации (3, 8). Лабораторная диагностика поражений печени, чаще всего, - это констатация уже далеко зашедших патологических процессов. Печень длительное время «страдает молча», а профилактические и лечебные мероприятия отстают от стадий серьезных повреждений гепатоцита (см. Рисунок 1).
Существенной задачей являлся выбор для эксперимента адекватных гепатотроп-ных ядов. Известно, что бензол и соединения хрома - распространенные и гепа-тотропные токсиканты внешней среды. В настоящее время установлен прооксидант-ный механизм действия этих веществ на организм (7, 12, 13)
ранее экспериментально было изучено влияние бензола и бихромата калия на особенности прооксидантно-антиоксидантного баланса эритроцитов крыс при перораль-ном поступлении ядов (13). Автором было
Рисунок 1 — Последовательность развития патологических процессов в печени при интоксикации
показано, что при интоксикации бензолом происходит резкая активация процессов свободно-радикального окисления связанная с образованием активных форм кислорода (АФК) в пероксидазной реакции окисления гемоглобина до метгемоглобина с образованием фенолов, которые, как известно, в присутствие металлов образуют окислительновосстановительную пару типа фенол-хинон, способную восстанавливать кислород до его агрессивных интермедиатов. Роль хрома в активации СРО, вероятнее всего, реализуется посредством процессов восстановления шестивалентного хрома, сопровождающегося истощением запасов доноров электронов в клетке (глютатиона, аскорбиновой кислоты и др.), а также, за счет образования окислительно-
восстановительных пар ионов хрома с различными степенями окисления (7).
Если приведенные данные рассматривать с позиции современных представлений о неспецифическом свободнорадикальном действии токскантов на клетку, то можно отметить, что при длительном поступлении низких концентраций хрома (VI) основными повреждающими факторами являются реактивные активные формы кислорода (АФК). Одновременно при поступлении низких концентраций бензола происходит блокада метаболических путей, участвующих в восстановлении метгемоглобина.
Таким образом, оксидативное действие органических поллютантов, не являющихся собственно окислителями, проявляется в потенцировании действия прооксиданта с выраженными окислительными свойствами (6).
Эти изменения свидетельствуют об усилении повреждающего действия бензола и хрома (VI) при их совместном действии, что, возможно, также обусловлено гепато-токсичностью хрома (VI), способного вследствие своей генотоксичности угнетать синтез глютатиона и связанный с ним, второй этап детоксикации бензола (13, 15).
Поиск немедикаментозных технологий профилактики ранних токсических поражений печени пока остается нерешенной проблемой промышленной и восстановительной медицины (1, 3). Среди перспективных методов успешно развивается направление адаптационной терапии и профилактики с применением метода дозированных нормобарических гипоксических тренировок, который оказался достаточно эффективным для предупреждения стрессиндуциро-ванных, ишемических и иных нарушений обменных процессов в сердце, головном мозге, мышечной ткани [1, 4, 5, 11].
Вместе с тем, применение этого мощного и генетически детерминированного механизма защиты тканевых структур до настоящего времени почти не используется для стимуляции детоксикационных свойств органов, ответственных за обезвреживание промышленных и бытовых токсикантов (9,
10, 16). Кислородный запрос тканей, активность ферментов тканевого дыхания, состояние мембраносвязанных белково-липидных компонентов клетки, антирадикальная защита от продуктов индуцированной химическими экотоксикантами — эти и целый ряд других проблем все чаще объединяются в изучение механизмов резистентной и толерантной стратегии адаптации ткани печени к целому спектру неблагоприятных
внешних агентов (12, 14).
Теоретическую основу разработанного авторским коллективом метода составляет концепция о формировании долговременной и комбинированной адаптации организма к периодическому действию регламентированной гипоксии и реоксигенации (4, 17). В рамках требований государственного контракта проведена существенная модификация известных технологий гипок-сической тренировки, учтены клинические наблюдения за формированием и эффективностью адаптационных механизмов при неинфекционной патологии у человека, получавшего курсы гипоксической нормобарической и гипобарической тренировки.
2 3 4 5
1 — норма при стандартных условиях
2,3 — время формирования гипероксической смеси
4,5 — гипероксическое воздействие
6.7 — время формирования гипоксической смеси
7.8 — гипоксическое воздействие
Рисунок 2 — Схема бесступенчатого воздействия режимов «нормоксия-гипоксия» и «нормоксия-гипероксия»
В техническом задании на создание установки была предусмотрена разработка принципиально нового сочетания тренирующих режимов дыхания с разным содержанием кислорода во вдыхаемом воздухе.
В отличие от прототипов новый вариант технического решения позволяет создавать дыхательные смеси с разной концентрацией кислорода - от 12 (min) до 30 % (max)- и бесступенчатое чередование этих режимов дыхания (6, 7). За весь период адаптации животные получали 72 цикла смены режимов дыхания, что и составляет методическую основу предлагаемой технологии.
следующим и, безусловно, наиболее существенным этапом научно исследовательской работы в рамках контракта являлась
объективная оценка эффективности адаптационной защиты ткани печени животных от вредного воздействия ксенобиотиков. В качестве подопытных животных были использованы половозрелые белые крысы-самцы линии CD (Sprague-Dawley), полученные из НПП питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (г. Пущино), рекомендованные в соответствии с Международной системой генетической стандартизации СКЬ для экспериментальных исследований в области токсикологии и фармакологии. Выбор данных животных в качестве экспериментальных был обусловлен тем, что они достаточно устойчивы к интеркуррентным заболеваниям и равновесно стабильны с точки зрения репрезентативности исследуемых показателей. Перед выполнением экспериментов животные содержались в карантине (1 месяц) с обязательным клиническим обследованием и выбраковкой подозрительных на заболевания особей. Для исключения сезонных колебаний изучаемых показателей весь эксперимент проведен одномоментно в период (май — июнь 2009 г.). Все животные содержались в стандартных условиях вивария. В течение всего эксперимента интактные животные имели свободный доступ к корму и питьевой воде, которая в экспериментальных группах была заменена на смесь токсикантов.
Токсикологические и биохимические исследования проводились на 61 клинически здоровом экспериментальном животном массой 180-210 г. к началу эксперимента. Всего проведено три серии опытов, в каждой из которых было 2-3 группы по 7-8 животных. Контрольную группу составили 7 интактных животных. дозы токсикантов (бензола и соли хрома — бихромата калия) рассчитаны от-
носительно LD50 [13]. При замене питьевой воды на смесь токсикантов животные экспериментальных групп получали бензол в дозе
0,12 мл/кг массы тела и соль хрома в дозе 5,0 мг/кг массы тела в течение 7 и 14 дней эксперимента. В каждой серии экспериментов были оценены как эффекты интоксикации гепатотропными ядами, так и защитные эффекты адаптации животных при разных режимах колебания концентрации кислорода в дыхательных смесях: от нормоксии (21%) до умеренной гипоксии (12%) и умеренной гипе-роксии (30%), создаваемые макетом экспериментальной установки.
Из данных таблицы 1 видно, что в эксперименте было проведено 3 серии наблюдений: в первой и второй серии опытов по одной группе в каждой животные комбинированно получали бензол в дозе 0,12 мл/кг массы тела и соль хрома в дозе 5,0 мг/кг массы тела(6) в течение 7 и 14 дней, а две другие группы получали токсиканты в тех же дозах на фоне адаптации к режимам «гипоксия-гипероксия».
Две группы в каждой серии получали указанные токсиканты в тех же дозах на фоне адаптации к режимам «гипоксия-нормоксия».
В третьей серии — две группы животных получали те же токсиканты после 1 и 2-х недельных курсов предварительной адаптации к режимам «гипоксия-гипероксия».
В результате проведенных исследований было подтверждено, что указанные токсиканты вызывают ранние повреждения ткани печени, которые подтверждались выраженной гиперферментемией органоспецифических печеночных ферментов: достоверным увеличением активности фруктозо-1-монофосфат-альдолазы (МФА) и трансферазы гамма-глютаминовой кислоты (ТГГК) в сыворотке
Т аблица 1 — Распределение экспериментальных животных в эксперименте
Серия Группы экспериментальных животных Обозначения Количество животных в группе
1 2 3 4
Серия 1 1 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 1 недели 1/1 7
2 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 1 недели на фоне адаптации к чередовавшимся циклам «гипоксия-гипероксия» 1/2 7
3 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 1 недели на фоне адаптации к чередовавшимся циклам «нормоксия-гипоксия» 1/3 7
Продолжение таблицы 1
1 2 3 4
Серия 2 1 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 2 недель 2/1 8
2 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 2 недель на фоне адаптации к чередовавшимся циклам «гипоксия-гипероксия» 2/2 7
3 Группа животных, получавшая токсиканты в течение 2 недель на фоне адаптации к чередовавшимся циклам «нормоксия-гипоксия» 2/3 7
Серия 3 1 Группа животных, получавших токсиканты в течение 1 недели после 2-х недельного курса адаптации к циклам «гипоксия-гипероксия» 3/1 5
2 Группа животных, получавших токсиканты в течение 2 недель после 2-х недельного курса адаптации к циклам «гипоксия-гипероксия» 3/2 6
Контроль Интактные животные 7
крови, гиперферментемией аланиновой ами-нотрансферазы (АлТ), 1,5-2-х кратным снижением активности ферментов антиокислитель-ной защиты (супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (К) на фоне увеличения активности свободно-радикального окисления, регистрируемого методом хемолюминесценции уже на ранних стадиях интоксикации.
Результаты этой первой серии экспериментов продемонстрированы в данных таблицы 2 в группах крыс, получавших ге-патотропные экотоксиканты в течение 1 и 2 недель (группы 1/1 и 2/1)
Как видно из данных таблицы, химический стресс, вызванный введением в организм крыс гепатотропных экополютантов, уже через 1 неделю эксперитмента приводил к 2,5 кратному увеличению органоспецифической фер-ментемии фруктозо-монофосфатальдолазы, достоверному повышению выхода в кровь трансферазы глютаминовой кислоты, что свидетельствует о существенных повреждениях биологических мембран гепатоцитов.
Через 2 недели эксперимента сохранялась достоверная гиперферментемия ФМА и в 3 раза увеличилась ферментемия ТГГК. В обеих группах животных обнаружена тенденция к увеличению ферментемии АлТ — клинического критерия нарушения метаболизма в печеночных клетках.
Биохимические индикаторы повреждения биологических мембран гепатоцитов согласуются с полученными в ходе экспе-
римента косвенными показателями общего химического стресса, перенесенного животными. Так, уже к концу 1 недели интоксикации в гемолизатах эритроцитарных мембран, использованных как универсальный индикатор физического состояния биологических мембран, обнаружено резкое снижение активности ферментов антирадикальной защиты — супероксиддисмутазы и каталазы — в 1,6 и 2 раза соответственно. При оценке еще одного показателя интоксикации организма — хемолюминосценции сыворотки крови экспериментальных животных — были зарегистрированы увеличение спонтанной вспышки в 2,5 раза и суммарной светимости сыворотки крови в 1,3 раза, которые также подтверждают токсическое действие примененных гепатотропных ядов.
следующим этапом эксперимента стали наблюдения над адаптированными животными, которые получали многократные колебательные воздействия различным содержанием кислорода во вдыхаемых смесях. При этом в течение каждого цикла 2-х часового эксперимента животные бессту-пенчато 6 раз оказывались в режиме дыхания умеренной гипоксической смесью (12% кислорода) и гипероксической смесью (30% кислорода). В течение недельного курса адаптации животные получали 36 циклов дыхания в режиме «гипоксия-гипероксия», а в течение 2 недель адаптации — 72 таких циклов.
Таблица 2 — Активность ферментов в сыворотке крови экспериментальных животных
Серии и группы животных Активность МФА (усл. ед) Актив- ность ТГГК (Ед/л) Актив- ность АлТ (Ед/л) Активность АсТ(Ед/л)
Контроль 0,8±0,06 1,64 ± 64.44±5.2 380±21,0
1/1 2,0±0,07* 2,08±0,09* 73, 46±7.5 373,2±43,9
2/1 1,3±0,06* 4,87 ±0,05* 71, 1±8.77 359.8±27,8
1/2 1,0±0,04 1,48±0,06 51,14±4,5 385,8±32,7
2/2 0.5±0,02 2,45±0.08* 51,35±6,5 364,3±29,9
1/3 2,7±0.03 0,78±0,04 50,6±3,8 369,3±32,4
2/3 1.85±0,03 1,08±0,05 92.8±6,8* 426,6±33,2*
3/1 1,25±0,02 1,66±0,09 43,3±2,5 320,0±28,6
3/2 1,55±0,02 1,92±0,2 64,0±3,9 285,4±21,9
* Р < 0,05 — отличия достоверны по сравнению с группами контроля
Было установлено, что в группах животных, адаптированных в режиме многократного бесступенчатого перехода от умеренной гипоксии к умеренной гипероксии, существенно уменьшаются проявления действия токсикантов на ткань печени: отмечено уменьшение органоспецифической гиперферментемии (ФМА и ТГГК), снижение активности АлТ в сыворотке крови, сохранялась ферментативная мощность защитных мембранных антиокислительных ферментов СОД и К. Важно отметить при этом, что примененные в данном эксперименте режимы колебательных изменений уровня кислорода во вдыхаемом воздухе приводили к более раннему развитию защитных механизмов, обеспечивающих снижение процессов свободнорадикального окисления в ткани печени при ее подостром отравлении смесью гепатопротекторных ядов существенно, что антистрессорный защитный эффект режимов «гипоксия-гипероксия» был ранее получен для ткани печени в эксперименте с истощающей физической нагрузкой (2).
Развивая идею формирования защитных механизмов в ткани печени при по-досторой интоксикации, были выделены
две дополнительные серии наблюдений. Так, в первой из них (группы 1/3 и 3/2) химическую нагрузку на животных начинали одновременно с адаптацией к режимам дыхания «гипоксия-нормоксия» и «гипоксия-гипер-оксия».
Показано, что режим «гипо-ксия-гипероксия» в первую неделю эксперимента полностью защищал печеночные клетки от действия ядов — ни по одному индикатору повреждение не регистрировалось. Вместе с тем, к концу 2 недели эксперимента вновь регистрировалась умеренная гиперферментемия ТГГК, что может свидетельствовать о том, что продолжающаяся интоксикация вызывает снижение активности анити-оксидантных систем мембран гепатоцитов и приводит к изменению их проницаемости для мембраносвязанных ферментов клетки.
Было установлено, что предлагаемый режим «гипоксия-гипероксия» обладает более выраженным гепатопротекторным действием при подострой интоксикации животных. При этом, этот эффект развивается значительно быстрее. Уже через 2 недели при продолжающейся интоксикации у животных значительно снижаются показатели токсического повреждения ткани печени.
Таким образом, на макете экспериментальной установки была апробирована в эксперименте модель адаптационной защиты печени при подостром отравлении организма гепатотропными ядами с помощью увеличенной амплитуды колебаний содержания кислорода во вдыхаемых смесях: от умеренной гипоксии до умеренной гиперок-сии. Введение гипероксической компоненты в предлагаемый дыхательный режим животных приводит к значительному повышению резистентности ткани печени к действию смеси бензола и солей хрома.
Результаты исследования представляются весьма перспективными для их внедрения в промышленную и восстановительную медицины. Следующим этапом было создание промышленного образца установки, его клиническая апробация и организация серийного производства нового отечественного изделия современной медицинской техники.
Важное отличие от существующих в стране «гипоксия-гипероксия». Обнаружено, что
стационарных установок-прототипов — пред- введение гипероксической компоненты в клас-
лагаемая авторами установка может быть соз- сический режим интервальной гипоксической
дана в мобильном варианте и максимально тренировки приводит не только к повышению
приближена к пациентам, которым показана резистентности ткани печени к экополютан-
адаптационная защита печени при острой и там, но и более быстрому развитию комплекса
хронической химической нагрузке производ- защитных механизмов.
ства с вредными условиями труда. Не меньшее значение имеет тот факт.
Существенно, что в данной работе до- что предварительная адаптация в режиме
казана не только сама возможность дости- «гипоксия-гипероксия» может быть использо-
жения устойчивого защитного эффекта от вана для профилактики химических интокси-
действия химических гепатотропных ядов каций и ранних поражений печени у лиц, про-
на организм животных при применении живающих в непосредственной близости жилой
технологии сочетания многократных бес- зоны к источникам экологического неблагопо-
ступенчатых колебаний режимов дыхания лучия и повышенных антропогенных нагрузок.
список литературы:
1. Адаптационная медицина : от теоретической концепции к профилактике соматических заболеваний / В. П. Твердохлиб, Б. А. Фролов, В. М. Боев и др. Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия : от исследования молекулярных механизмов — до внедрения в клиническую практику и производство» - Оренбург, ФГУП ИПК «Южный Урал». - 2003. - С. 294 - 299.
2. Буеверов А. О. // А. О. Буеверов Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени // Рос. журн. , 2008. - №3. - С. 7 - 14.
3. Грек О. Р. // О. Р. Грек, А. В. Ефремов, В. И. Шарапов Гипобарическая гипоксия и метаболизм ксенобиотиков. - М. : ГЭОТАР-Медиа. - 2007. - 117 с.
4. Меерсон Ф. З.,Твердохлиб В. П., Боев В. М., Фролов Б. А. Адаптация к периодической гипоксии в терапии и профилактике. М. :Наука, 1989. -70 с.
5. Никоноров А. А., Твердохлиб В. П. Роль повышения структурно-функционального резерва биомембран в реализации антистрессорного эффекта предварительной адаптации к действию периодической гипобарической гипоксии / III Российский конгресс по патофизиологии «Дизрегуляция в патологии органов и систем». - М., 2004. - С.157
6. Икрянникова С. В. Влияние экологических факторов на антиоксидантный статус и спектральные характеристики гемоглобина жителей промышленного города / Автореф. дис. Канд. Биол. Наук. - Оренбург. - 2006. - 30 с.
7. Куценко А. С. Основы токсикологии. - С-Пб. 2002. - 213 с.
8. Пентюк А. А., Мороз Л. В., Паламарчук О. Н. Поражения печени ксенобиотиками / Проблемы токсикологии, 2001. - №2.
9. Сазонтова Т. Г. / Т. Г. Сазонтова, Н. А. Анчишкина, А. Т. Жукова, Ю. В. Архипенко. Роль активных форм кислорода и редокс-сигнализации в защитных эффектах адаптации к изменению уровня кислорода // Физиол. Журнал, 2008. - №3. - С. 7 - 14.
10. Свиридов О. А. // О. А. Свиридов, Е. Г. Ревкова, Е. Н. Лебедева, С. И. Красиков, В. П. Твердохлиб Оценка влияния неблагоприятных химических факторов на состояние печени и разработка метода для профилактики и снижения степени ее поражения у лиц, занятых в химическом производстве / Научн. вестн. ОГИМ : Сб. матер. конф. «Инновационная деятельность : наука-экономика-производство, 2008. - С. 346 - 351.
11. Стрелков Р. Б., Чижов А. Я. Прерывистая нормобарическая гипоксическая стимуляция неспецифической резистентности организма в профилактике и снижении инвалидности (методические рекомендации) М. : 1997. - 25 с.
12. Сетко Н. П., Боев В. М. Медицина труда и экология человека в газовой промышленности. - М. : Медицина, 2009. - 240 с.
13. Твердохлиб В. П., Твердохлиб Д. В., Митинский Г. М., Казаков Ю. И. и др. Общие механизмы адаптации и профилактики определяют здоровье здорового человека / Вестник ЮУрГУ, 2006. - №3 (58). - С. 99 - 101.
14. Утенин В. В., Стадников А. А., Боев В. М. Влияние хрома и бензола на гистоструктуру печени и почек животных в эксперименте // Вестник ОГУ. - 2002. - №5. - С. 10 - 16.
15. Целикман В. Э., Целикман О. Б. Стресс и неспецифический реактивный гепатит.-Челябинск : Изд-во ЮУрГУ, 2008. - С 48 - 60.
16. Шакиров Д. Ф. Влияние бензола и его производных на организм / Сб. матер. конф. «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины». — Самара : Содружество плюс, 2005. - С. 4б5 - 468.
17. Meerson F. Z. Essentials of Adaptive Medicine : Protective effects of Adaptation Hypoxia Medical LTD, 1993. - P. 443.
18.Sturgill M. G., Lambert G. H., Xenobiotic-induced hepatotoxicity: mechanisms of liver enjury and methods of monitoring hepatic function // Clin. Chem., 1997 (43) : 1512-1526.
