Научная статья на тему 'Эффект адаптации к изменению уровня кислорода, гипоксии и гипероксии на редокс сигнализациюи физическую выносливость в условиях действия токсикантов в малых дозах'

Эффект адаптации к изменению уровня кислорода, гипоксии и гипероксии на редокс сигнализациюи физическую выносливость в условиях действия токсикантов в малых дозах Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
356
87
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АДАПТАЦИЯ / ГИПОКСИЯ / ГИПЕРОКСИЯ / ФИЗИЧЕСКАЯ ВЫНОСЛИВОСТЬ / СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ / АНТИОКСИДАНТЫ / БЕНЗОЛ / БИХРОМАТ КАЛИЯ / REACTIVE OXYGEN SPECIES (ROS) / HEAT SHOCK PROTEINS (HSPS) / HSP / ADAPTATION / HYPOXIA / HYPEROXIA / PHYSICAL ENDURANCE / REDOX SIGNALING / ANTIOXIDANTS / BENZENE / BICHROMATE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Сазонтова Татьяна Геннадиевна, Стряпко Надежда Владимировна, Костин Александр Игоревич, Вдовина Ирина Борисовна, Бедарева Ирина В.

В эксперименте на крысах Wistar изучено влияние подострой хронической интоксикации смесью бензола и бихромата на физическую выносливость, интенсивность окислительных процессов и уровень неспецифических защитных молекул-ферментов антиоксидантной защиты и белков семейства HSP. Впервые применена коррекция выявленных нарушений с помощью нового метода адаптации к гипоксии и гипероксии. Ранее в работах лаборатории показано, что адаптация к гипоксии и умеренной 30% гипероксии обладает защитным эффектом от АФК-индуцированных повреждений как в системах in vitro, так и при окислительном стрессе в моделях in vivo. В данной работе обнаружено, что кратковременная адаптация к гипоксии и умеренной гипероксии обладает защитным эффектом в условиях интоксикации, что выражается в повышении физической выносливости и предупреждении потери веса животными, компенсации окислительных процессов в печени и предупреждении индукции конститутивных и индуцибельных белков семейства HSPв скелетной мышце. При этом уровень защитных белков семейства HSP в печени сохраняется на повышенном уровне, отражая начальный этап формирования адаптационного ответа. Результаты данного исследования могут быть использованы для изучения возможности реализации защитного эффекта адаптации к гипоксии и гипероксии на донозологическом этапе хронического действия малых доз этих токсикантов у людей, работающих на промышленных предприятиях, или живущих в зоне высокого уровня антропогенного загрязнения.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Сазонтова Татьяна Геннадиевна, Стряпко Надежда Владимировна, Костин Александр Игоревич, Вдовина Ирина Борисовна, Бедарева Ирина В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Effect of short-term adaptation to hypoxia and hyperoxia on redox signaling and physical endurance under low dose intoxication

In the model of low dose intoxication by benzene and bichromate as simulation of anthropogenic pollution the protective effects of adaptation to changing oxygen levels hypoxia-hyperoxia were investigated by estimating animal weight, physical endurance, level of free radical processes, activity of antioxidant enzymes and HSP content in Wistar rats. Here, we introduce a novel combination of normobaric hypoxia and hyperoxia as adaptation mode with the aim of demonstration its antitoxic effects. It was shown previously in laboratory conditions that above-mentioned model of adaptation is capable to prevent ROS-activated damage both in vitro and in vivo. The results of this study have shown that adaptation to hypoxia-hyperoxia prevents the effects of intoxication, too. Protective effect of adaptation is manifested in prevention of: a) animal weight reduction, b) decrease of physical endurance, c) increase of lipid peroxidation, d) activation of antioxidant enzymes, e) induction of HSPs. The results obtained demonstrates remarkable potentialities of a protective effect of adaptation to hypoxia-hyperoxia on prenosological stage of chronic intoxication to low doses of toxicants which are present in people working in industry, or those living in the high level of anthropogenic pollution.

Текст научной работы на тему «Эффект адаптации к изменению уровня кислорода, гипоксии и гипероксии на редокс сигнализациюи физическую выносливость в условиях действия токсикантов в малых дозах»

УДК 612.017.2:577.352.38:612.014.46

Т. Г. Сазонтова, Н. В. Стряпко, А. И. Костин, И. Б. Вдовина, И. В. Бедарева, Ю. В. Архипенко

Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2013. Вып. 2

ЭФФЕКТ АДАПТАЦИИ К ИЗМЕНЕНИЮ УРОВНЯ КИСЛОРОДА, ГИПОКСИИ И ГИПЕРОКСИИ НА РЕДОКС СИГНАЛИЗАЦИЮ И ФИЗИЧЕСКУЮ ВЫНОСЛИВОСТЬ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ В МАЛЫХ ДОЗАХ

Сложившаяся экологическая обстановка в промышленных городах и мегаполисах в настоящее время ставит проблему выявления и профилактики химически индуцированных повреждений печени [1]. В основе токсического действия многих органических и неорганических химических соединений лежат механизмы, опосредованные действием активных форм кислорода (АФК). Так, инициаторами АФК-зависимых процессов являются металлы с переменной валентностью, например & [2], биотрансформация химических соединений, например бензола [3]. Эти вещества выделяются в зоне промышленных производств или при горении автомобильного топлива, гигиеническая оценка окружающей среды выявляет значительное превышение фонового уровня содержания хрома и бензола в воде и других объектах среды в промышленных городах. В данной работе для оценки действия токсикантов была использована экспериментальная модель подострой интоксикации смесью: бихромата калия (К2&2О7) и бензола, разработанная [4] на основе санитарно-гигиенического исследования на до-нозологическом этапе эффектов малых доз этих токсикантов у людей, работающих на промышленных предприятиях или живущих в зоне высокого уровня антропогенного загрязнения. Учитывая, что одним из значимых путей поступления в организм данных токсикантов является питьевая вода, в модели был использован пероральный способ введения низких доз бензола и бихромата калия, растворенных в питьевой воде. Хроническое воздействие низких доз токсикантов проявляется на фоне физических нагрузок, выражаясь в снижении работоспособности [4]. Трудности в выявлении нозологии подобного снижения ограничивают возможность выбора эффективного лечения. Применение химических и природных гепатопротекторов малоэффективно и повреждение печени продуктами биотрансформации ксенобиотиков [1] не предупреждается. Поэтому поиск немедикаментозных технологий профилактики ранних токсических поражений и поддержания функциональной работоспособности организма на фоне интоксикации малыми дозами АФК-индуцирующих веществ остается актуальной нерешенной проблемой профилактической и восстановительной медицины.

Сазонтова Татьяна Геннадиевна — д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Стряпко Надежда Владимировна — ординатор, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Костин Александр Игоревич — директор по инвестициям и инновациям, ООО «Метакс»

Вдовина Ирина Борисовна — канд. биол. наук, научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Бедарева Ирина В. — научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Архипенко Юрий В. — д-р биол. наук, профессор, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

© Т. Г. Сазонтова, Н. В. Стряпко, А. И. Костин, И. Б. Вдовина, И. В. Бедарева, Ю. В. Архипенко, 2013

В настоящее время успешно развивается направление адаптационной терапии и профилактики, в том числе к гипоксическим воздействиям, многократно показана эффективность предупреждения с их помощью АФК-индуцированных нарушений. Однако возможность стимуляции с помощью адаптации к изменению уровня кислорода детоксикационных свойств организма на сегодняшний день практически не изучена. Актуальным также является поиск новых способов гипоксических тренировок, позволяющих достигать стадии долговременной адаптации, а следовательно, и стойкого защитного эффекта за меньший промежуток времени, что сокращает длительность лечения.

В данной работе проведена оценка возможности реализации эффекта нового метода адаптации к изменению уровня кислорода, к гипоксии и гипероксии [5, 6] на физическую выносливость в условиях интоксикации. Основные особенности исследования — впервые применена кратковременная адаптация к гипоксии-гипероксии, выбрано действие низких доз токсикантов и сделана попытка предупредить нарушения, вызванные такой интоксикацией.

Цель работы: оценка эффектов кратковременной адаптации к гипоксии-гиперок-сии на физическую выносливость в условиях интоксикации гепатотропными ядами, роли изменения интенсивности свободнорадикальных процессов, уровня ферментов антиоксидантной защиты и белков семейства ЖЕ

Материалы и методы. Работа проведена на 47 крысах самцах Ш1з1аг весом 180 г. Животные были разделены на 6 экспериментальных групп (табл. 1).

Таблица 1. Экспериментальные группы

Описание групп экспериментальных животных Обозначения п, в группах

1 Контрольные (интактные) животные К 7

2 Группа с однократной острой истощающей физической нагрузкой (ОФН) 1ОФН 8

3 Группа с трехкратной ОФН в 3 последующих дня 3ОФН 8

4 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей однократной ОФН 9Б+1ОФН 8

5 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей трехкратной ОФН 9Б+3ОФН 8

6 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней на фоне адаптации к циклам «гипоксия-гипероксия», с последующей трехкратной ОФН 9Б+Г/Г+3ОФН 8

Эксперимент проводили 10 дней, часть животных оставалась интактной (контроль), часть получала тестирующую однократную (1ОФН) или трехкратную (3ОФН) физическую нагрузку. Животные 4-ой (9Б+1ОФН) и 5-ой групп (9Б+3ОФН) в течение 9 дней от начала эксперимента получали перорально с питьевой водой смесь токсикантов и подвергались тестирующей 1ОФН (на 10-й день) или 3ОФН (на 8, 9 и 10 день). ОФН включала стрессорную компоненту, осуществлялась с помощью принудительного плавания до отказа с 5% груза от массы тела и при температуре воды 21°С. Животные 6-й группы в течение 9 дней также получали токсиканты, но со второго дня эксперимента — и сеансы адаптации к циклам гипоксии-гипероксии по 1 ч в день, 8 дней,

с последующей трехкратной ОФН. В качестве токсикантов применялась смесь водорастворимых ядов — шестивалентного хрома в бихромате калия и бензола, растворенных в питьевой воде. Дозы рассчитывались на основании данных литературы [7, 8] и были в несколько раз ниже LD50 для каждого вещества. У животных опытных групп не наблюдали видимых проявлений токсического действия, не выявляли макроскопических изменений внутренних органов, в том числе и печени.

Адаптацию к нормобарической гипоксии проводили в новом режиме с добавлением гипероксической компоненты (Патент № 2289432; 20.12.2006 г. [6], прибор на основе мембранного деления газов разработан совместно лабораторией адаптационной медицины ФФМ МГУ и фирмой «Метакс»). Адаптация в режиме гипоксии-гипероксии (Г/Г) предполагала чередование 5 мин интервалов вдыхания воздушной смеси, содержащей 10% О2, с 3 мин интервалами вдыхания гипероксической смеси, содержащей 30% О2, в течение 60 мин ежедневно, 6 дней в неделю, 8 дней. В образцах левой доли печени оценивали интенсивность свободнорадикальных процессов по динамике накопления продуктов окисления при его индукции in vitro [9, 10], активность ферментов антиоксидантной защиты — каталазы [11], супероксиддисмутазы [12], глутатион-редуктазы [13]. Western-blot анализ индуцибельных и конститутивных форм белков срочного ответа семейства HSP как показателей стрессорной и гипоксической составляющей [14-16] проводили в печени и скелетной мышце, используя моноклональные антитела и хемилюминесцентную детекцию. Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 согласно рекомендациям по проведению биомедицинской статистики [17]. Независимые выборки сравнивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Результаты представлены в виде медианы.

Результаты и обсуждение. При оценке интенсивности окисления в печени в группе 1ОФН оказалось, что скорость накопления ТБК-активных продуктов значительно превышала контрольный уровень, что сопровождалось активацией ферментов анти-оксидантной защиты (табл. 2). В группе 3ОФН активность ферментов была значительно выше контроля и 1ОФН, что сопровождалось нормализацией интенсивности окисления и возвращением ее к контролю. При этом повышалась выносливость животных, что выражалось в увеличении длительности плавания в группе 3ОФН на 27% относительно 1ОФН.

В ответ на АФК-сигнал при окислительном стрессе происходит активация факторов транскрипции, что ведет к массированному синтезу защитных молекул, в частности белков теплового шока HSPs, сохраняющих структуру белков при их синтезе, транспортировке и функционировании. Среди них выделяют конститутивные формы, синтезирующиеся в организме постоянно, к которым относится 73кДа HSC73, и ин-дуцибельные формы, образующиеся в ответ на действие АФК различной природы — HSP72 и НОх-1 (HSP32). В настоящее время показано значительное повышение уровня этих защитных белков в печени, скелетной мышце, сердце при стрессорных воздействиях [14-16]. При оценке уровня стресс-белков семейства HSP в печени оказалось, что при 1ОФН их уровень повышен от контроля, а при 3ОФН их количество снижено. В скелетной мышце аналогичная закономерность показана для индуцибельной гемок-сигеназы НОх-1 и конститутивной формы HSC73.

В целом, данные свидетельствуют об уменьшении как гипоксической, так и стрес-сорной компоненты при 3ОФН. Поэтому для выявления защитных эффектов кратковременной адаптации при интоксикации, которая сама по себе сопровождается индук-

цией АФК-процессов, выбрана тест-система с трехкратной ОФН, так как она обладает меньшим повреждающим эффектом и вызывает меньший окислительный стресс, чем 1ОФН.

В тестирующей системе действие токсической смеси проявилось в снижении процента увеличения массы от исходной, как в группе однократной, так и трехкратной ОФН. Однако интоксикация практически не влияла на показатель выносливости, и при 3ОФН выносливость была выше, чем при 1ОФН, как на фоне приема смеси бензола и бихромата, так и без нее. При оценке активности ферментов антиоксидантной защиты (табл. 2) оказалось, что она значительно возрастала на фоне интоксикации при 3ОФН. Однако интенсивность окислительных процессов при 9Б+3ОФН не была скомпенсирована и происходило повышение скорости накопления ТБК-активных продуктов выше контрольного уровня (рисунок).

Табпица 2. Активность ферментов антиоксидантной защиты — глутатионредуктазы (GR), каталазы (Cat), супероксиддисмутазы (SOD) в % от контроля

1ОФН 9Б+1ОФН 3ОФН 9Б+3ОФН 9Б+Г/Г+3ОФН

Cat 3,5 34* 19* 20* 8

SOD 5 23* 10 21* 6,5

GR 4,5 22,5* 38* 50* 12

Примечание: * — достоверность отличий (р < 0,05) от контроля (Mann—Whitney U Test), — достоверность отличий (р < 0,05) от группы 9Б+3 ОФН (Mann—Whitney U Test).

На фоне кратковременной (8 дней) адаптации к периодической гипоксии-гипе-роксии происходила нормализация интенсивности окислительных процессов (рисунок), более того, ее снижение относительно контроля, что характеризует полную компенсацию АФК-сигнала. При оценке уровня ферментативных систем наблюдалось подтверждающее такую компенсацию возвращение их активности к контрольному уровню (табл. 2).

А 532

0:00 0:14 0:28 0:43

Время окисления, мин

Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободно-радикального окисления при его индукции in vitro в печени (индуктор — Fe2+ — аскор-бат) в контроле, при трехкратном ОФН на фоне интоксикации (9Б+3ОФН) и на фоне интоксикации и адаптации (9Б+Г/ Г+3ОФН).

А532 — оптическая плотность при 532 нм; * — достоверность отличий (р < 0,05) от контроля (Mann—Whitney U Test).

Важно, что при адаптации даже на фоне интоксикации достоверно повышалась физическая выносливость (длительность плавания) по сравнению с интоксикацией, но без адаптации.

Несмотря на нормализацию уровня ферментов антиоксидантной защиты, цена такой кратковременной адаптации на 8-й день была еще достаточно высока. Так, в печени уровень ЖР72, НО-1 и ЖС73 оставался повышенным, что свидетельствует о наличии гипоксической и стрессорной компонент. Важно, что в скелетной мышце уже на 8-й день адаптации снижался уровень индуцибельных и конститутивных форм стресс-белков (табл. 3). Такая более медленная реакция печени может объясняться тем, что на данном органе лежит основная нагрузка по элиминации токсических веществ.

Таблица 3. Белки семейства HSP

НО-1 ШС 73 HSP 72

9Б+3ОФН (печень) 15 8 9

9Б+Г/Г+3ОФН (печень) 20 8,7 9,5

9Б+3ОФН (скелетная мышца) 9,7 10,5

9Б+Г/Г+3ОФН (скелетная мышца) 4,5 8,3

Примечание: измерение в относительных денситометрических единицах.

Таким образом, кратковременная адаптация к гипоксии-гипероксии обладает защитным эффектом в условиях интоксикации, что выражается в повышении выносливости и компенсации окислительных процессов, при этом цена такой компенсации проявляется в высоком уровне защитных белков семейства HSP в печени, но не в скелетной мышце.

Литература

1. Буеверов А. О. Лекарственные поражения печени // Рос. мед. журн. 2001. № 9. С. 13-14.

2. WangX., XingM. L., Shen Y. et al. Oral administration of Cr(VI) induced oxidative stress, DNA damage and apoptotic cell death in mice // Toxicology. 2006. Vol. 228, N 1. P. 16-23.

3. Barreto G., Madureira D., Capani F. et al. The role of catechols and free radicals in benzene toxicity: An oxidative DNA damage pathway // Environmental and Molecular Mutagenesis. 2009. Vol. 50. P. 771-780.

4. Боев В. М., Верещагин Н. Н., Скачкова М. А. и соавт. Экология человека на урбанизированных и сельских территориях / под ред. Н. Н. Верещагина, В. М. Боева. Оренбург, 2003. C. 392.

5. Сазонтова Т. Г., Архипенко Ю. В. Роль свободнорадикальных процессов и редокс-сигнализа-ции в адаптации организма к изменению уровня кислорода // Рос. физиол. ж. им. И. М. Сеченова. 2005. Т. 91, № 6. С. 636-655.

6. Архипенко Ю. В., Сазонтова Т. Г., Глазачев О. С., Платоненко В. И. Способ повышения неспецифических адаптационных возможностей человека на основе гипоксически-нипероксических газовых смесей // Патент на изобретение № 2289432 от 20.12.2006 г.

7. Утенин В. В. Гигиеническая характеристика хрома и бензола и морфофункциональные аспекты их воздействия на организм в условиях эксперимента: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2002. 24 с.

8. Тимошинова С. В., Шарапова Н. В., Михайлова И. В. и др. Влияние хронической интоксикации хромом и бензолом на антиоксидантный статус крыс // Вестн. Оренбургск. гос. ун-та. 2004. № 10. С. 132-133.

9. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Analyt. Biochem. 1979. Vol. 95. P. 351-358.

10. Kikugawa K., Kojima T., Yamaki S., Kosugi H. Interpretation of the thiobarbituric acid reactivity of rat liver and brain homogenates in the presence of ferric ion and ethylenediaminetetraacetic acid // Analyt. Biochem.1992.Vol. 202. P. 249-255.

11. Luch H. Dependence of catalase activity on hydrogen peroxide concentration // Experientia. 1953. Sep. Vol. 9(9). Р. 340-342.

12. Fridovich I. Superoxide dismutases: Anti-versus pro-oxidants? // Anticancer Agents Med. Chem. 2011. Vol. 11 (2). P. 175-177.

13. Dickinson D. A., Forman H. J. Cellular glutathione and thiols metabolism // Biochem. Pharmacol. 2002. Р. 1019-1026.

14. Андреева Л. И., Бойкова А. А., Маргулис Б. А. Белки теплового шока семейства 70 кДа в оценки состояния организма человека в норме, при стрессе и патологии // Естествознание и гуманизм. 2006. Т. 3, № 4. С. 12-15.

15. Suematsu M., Ishimura Y. The hemeoxygenase-carbon monoxide system: A regulator of hepatobiliary function // Hepatology. 2000. Vol. 31. P. 3-6.

16. Zhukova A. G., Sazontova T. G. Hemeoxygenase: function, regulation, biological role // Hypoxia Med. J. 2004. № 3. P. 30-43.

17. Платонов А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Изд-во РАМН, 2000. C. 51.

Статья поступила в редакцию 19 февраля 2013 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.