CC BY
83
УДК 612.017.2:577.352.38:612.014.46
Т. Г. Сазонтова, Н. В. Стряпко, А. И. Костин, И. Б. Вдовина, И. В. Бедарева, Ю. В. Архипенко
Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2013. Вып. 2
ЭФФЕКТ АДАПТАЦИИ К ИЗМЕНЕНИЮ УРОВНЯ КИСЛОРОДА, ГИПОКСИИ И ГИПЕРОКСИИ НА РЕДОКС СИГНАЛИЗАЦИЮ И ФИЗИЧЕСКУЮ ВЫНОСЛИВОСТЬ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ В МАЛЫХ ДОЗАХ
Сложившаяся экологическая обстановка в промышленных городах и мегаполисах в настоящее время ставит проблему выявления и профилактики химически индуцированных повреждений печени [1]. В основе токсического действия многих органических и неорганических химических соединений лежат механизмы, опосредованные действием активных форм кислорода (АФК). Так, инициаторами АФК-зависимых процессов являются металлы с переменной валентностью, например & [2], биотрансформация химических соединений, например бензола [3]. Эти вещества выделяются в зоне промышленных производств или при горении автомобильного топлива, гигиеническая оценка окружающей среды выявляет значительное превышение фонового уровня содержания хрома и бензола в воде и других объектах среды в промышленных городах. В данной работе для оценки действия токсикантов была использована экспериментальная модель подострой интоксикации смесью: бихромата калия (К2&2О7) и бензола, разработанная [4] на основе санитарно-гигиенического исследования на до-нозологическом этапе эффектов малых доз этих токсикантов у людей, работающих на промышленных предприятиях или живущих в зоне высокого уровня антропогенного загрязнения. Учитывая, что одним из значимых путей поступления в организм данных токсикантов является питьевая вода, в модели был использован пероральный способ введения низких доз бензола и бихромата калия, растворенных в питьевой воде. Хроническое воздействие низких доз токсикантов проявляется на фоне физических нагрузок, выражаясь в снижении работоспособности [4]. Трудности в выявлении нозологии подобного снижения ограничивают возможность выбора эффективного лечения. Применение химических и природных гепатопротекторов малоэффективно и повреждение печени продуктами биотрансформации ксенобиотиков [1] не предупреждается. Поэтому поиск немедикаментозных технологий профилактики ранних токсических поражений и поддержания функциональной работоспособности организма на фоне интоксикации малыми дозами АФК-индуцирующих веществ остается актуальной нерешенной проблемой профилактической и восстановительной медицины.
Сазонтова Татьяна Геннадиевна — д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Стряпко Надежда Владимировна — ординатор, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Костин Александр Игоревич — директор по инвестициям и инновациям, ООО «Метакс»
Вдовина Ирина Борисовна — канд. биол. наук, научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Бедарева Ирина В. — научный сотрудник, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Архипенко Юрий В. — д-р биол. наук, профессор, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
© Т. Г. Сазонтова, Н. В. Стряпко, А. И. Костин, И. Б. Вдовина, И. В. Бедарева, Ю. В. Архипенко, 2013
В настоящее время успешно развивается направление адаптационной терапии и профилактики, в том числе к гипоксическим воздействиям, многократно показана эффективность предупреждения с их помощью АФК-индуцированных нарушений. Однако возможность стимуляции с помощью адаптации к изменению уровня кислорода детоксикационных свойств организма на сегодняшний день практически не изучена. Актуальным также является поиск новых способов гипоксических тренировок, позволяющих достигать стадии долговременной адаптации, а следовательно, и стойкого защитного эффекта за меньший промежуток времени, что сокращает длительность лечения.
В данной работе проведена оценка возможности реализации эффекта нового метода адаптации к изменению уровня кислорода, к гипоксии и гипероксии [5, 6] на физическую выносливость в условиях интоксикации. Основные особенности исследования — впервые применена кратковременная адаптация к гипоксии-гипероксии, выбрано действие низких доз токсикантов и сделана попытка предупредить нарушения, вызванные такой интоксикацией.
Цель работы: оценка эффектов кратковременной адаптации к гипоксии-гиперок-сии на физическую выносливость в условиях интоксикации гепатотропными ядами, роли изменения интенсивности свободнорадикальных процессов, уровня ферментов антиоксидантной защиты и белков семейства ЖЕ
Материалы и методы. Работа проведена на 47 крысах самцах Ш1з1аг весом 180 г. Животные были разделены на 6 экспериментальных групп (табл. 1).
Таблица 1. Экспериментальные группы
Описание групп экспериментальных животных Обозначения п, в группах
1 Контрольные (интактные) животные К 7
2 Группа с однократной острой истощающей физической нагрузкой (ОФН) 1ОФН 8
3 Группа с трехкратной ОФН в 3 последующих дня 3ОФН 8
4 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей однократной ОФН 9Б+1ОФН 8
5 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей трехкратной ОФН 9Б+3ОФН 8
6 Группа с введением токсикантов в течение 9 дней на фоне адаптации к циклам «гипоксия-гипероксия», с последующей трехкратной ОФН 9Б+Г/Г+3ОФН 8
Эксперимент проводили 10 дней, часть животных оставалась интактной (контроль), часть получала тестирующую однократную (1ОФН) или трехкратную (3ОФН) физическую нагрузку. Животные 4-ой (9Б+1ОФН) и 5-ой групп (9Б+3ОФН) в течение 9 дней от начала эксперимента получали перорально с питьевой водой смесь токсикантов и подвергались тестирующей 1ОФН (на 10-й день) или 3ОФН (на 8, 9 и 10 день). ОФН включала стрессорную компоненту, осуществлялась с помощью принудительного плавания до отказа с 5% груза от массы тела и при температуре воды 21°С. Животные 6-й группы в течение 9 дней также получали токсиканты, но со второго дня эксперимента — и сеансы адаптации к циклам гипоксии-гипероксии по 1 ч в день, 8 дней,
с последующей трехкратной ОФН. В качестве токсикантов применялась смесь водорастворимых ядов — шестивалентного хрома в бихромате калия и бензола, растворенных в питьевой воде. Дозы рассчитывались на основании данных литературы [7, 8] и были в несколько раз ниже LD50 для каждого вещества. У животных опытных групп не наблюдали видимых проявлений токсического действия, не выявляли макроскопических изменений внутренних органов, в том числе и печени.
Адаптацию к нормобарической гипоксии проводили в новом режиме с добавлением гипероксической компоненты (Патент № 2289432; 20.12.2006 г. [6], прибор на основе мембранного деления газов разработан совместно лабораторией адаптационной медицины ФФМ МГУ и фирмой «Метакс»). Адаптация в режиме гипоксии-гипероксии (Г/Г) предполагала чередование 5 мин интервалов вдыхания воздушной смеси, содержащей 10% О2, с 3 мин интервалами вдыхания гипероксической смеси, содержащей 30% О2, в течение 60 мин ежедневно, 6 дней в неделю, 8 дней. В образцах левой доли печени оценивали интенсивность свободнорадикальных процессов по динамике накопления продуктов окисления при его индукции in vitro [9, 10], активность ферментов антиоксидантной защиты — каталазы [11], супероксиддисмутазы [12], глутатион-редуктазы [13]. Western-blot анализ индуцибельных и конститутивных форм белков срочного ответа семейства HSP как показателей стрессорной и гипоксической составляющей [14-16] проводили в печени и скелетной мышце, используя моноклональные антитела и хемилюминесцентную детекцию. Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 согласно рекомендациям по проведению биомедицинской статистики [17]. Независимые выборки сравнивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Результаты представлены в виде медианы.
Результаты и обсуждение. При оценке интенсивности окисления в печени в группе 1ОФН оказалось, что скорость накопления ТБК-активных продуктов значительно превышала контрольный уровень, что сопровождалось активацией ферментов анти-оксидантной защиты (табл. 2). В группе 3ОФН активность ферментов была значительно выше контроля и 1ОФН, что сопровождалось нормализацией интенсивности окисления и возвращением ее к контролю. При этом повышалась выносливость животных, что выражалось в увеличении длительности плавания в группе 3ОФН на 27% относительно 1ОФН.
В ответ на АФК-сигнал при окислительном стрессе происходит активация факторов транскрипции, что ведет к массированному синтезу защитных молекул, в частности белков теплового шока HSPs, сохраняющих структуру белков при их синтезе, транспортировке и функционировании. Среди них выделяют конститутивные формы, синтезирующиеся в организме постоянно, к которым относится 73кДа HSC73, и ин-дуцибельные формы, образующиеся в ответ на действие АФК различной природы — HSP72 и НОх-1 (HSP32). В настоящее время показано значительное повышение уровня этих защитных белков в печени, скелетной мышце, сердце при стрессорных воздействиях [14-16]. При оценке уровня стресс-белков семейства HSP в печени оказалось, что при 1ОФН их уровень повышен от контроля, а при 3ОФН их количество снижено. В скелетной мышце аналогичная закономерность показана для индуцибельной гемок-сигеназы НОх-1 и конститутивной формы HSC73.
В целом, данные свидетельствуют об уменьшении как гипоксической, так и стрес-сорной компоненты при 3ОФН. Поэтому для выявления защитных эффектов кратковременной адаптации при интоксикации, которая сама по себе сопровождается индук-
цией АФК-процессов, выбрана тест-система с трехкратной ОФН, так как она обладает меньшим повреждающим эффектом и вызывает меньший окислительный стресс, чем 1ОФН.
В тестирующей системе действие токсической смеси проявилось в снижении процента увеличения массы от исходной, как в группе однократной, так и трехкратной ОФН. Однако интоксикация практически не влияла на показатель выносливости, и при 3ОФН выносливость была выше, чем при 1ОФН, как на фоне приема смеси бензола и бихромата, так и без нее. При оценке активности ферментов антиоксидантной защиты (табл. 2) оказалось, что она значительно возрастала на фоне интоксикации при 3ОФН. Однако интенсивность окислительных процессов при 9Б+3ОФН не была скомпенсирована и происходило повышение скорости накопления ТБК-активных продуктов выше контрольного уровня (рисунок).
Табпица 2. Активность ферментов антиоксидантной защиты — глутатионредуктазы (GR), каталазы (Cat), супероксиддисмутазы (SOD) в % от контроля
1ОФН 9Б+1ОФН 3ОФН 9Б+3ОФН 9Б+Г/Г+3ОФН
Cat 3,5 34* 19* 20* 8
SOD 5 23* 10 21* 6,5
GR 4,5 22,5* 38* 50* 12
Примечание: * — достоверность отличий (р < 0,05) от контроля (Mann—Whitney U Test), — достоверность отличий (р < 0,05) от группы 9Б+3 ОФН (Mann—Whitney U Test).
На фоне кратковременной (8 дней) адаптации к периодической гипоксии-гипе-роксии происходила нормализация интенсивности окислительных процессов (рисунок), более того, ее снижение относительно контроля, что характеризует полную компенсацию АФК-сигнала. При оценке уровня ферментативных систем наблюдалось подтверждающее такую компенсацию возвращение их активности к контрольному уровню (табл. 2).
А 532
0:00 0:14 0:28 0:43
Время окисления, мин
Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободно-радикального окисления при его индукции in vitro в печени (индуктор — Fe2+ — аскор-бат) в контроле, при трехкратном ОФН на фоне интоксикации (9Б+3ОФН) и на фоне интоксикации и адаптации (9Б+Г/ Г+3ОФН).
А532 — оптическая плотность при 532 нм; * — достоверность отличий (р < 0,05) от контроля (Mann—Whitney U Test).
Важно, что при адаптации даже на фоне интоксикации достоверно повышалась физическая выносливость (длительность плавания) по сравнению с интоксикацией, но без адаптации.
Несмотря на нормализацию уровня ферментов антиоксидантной защиты, цена такой кратковременной адаптации на 8-й день была еще достаточно высока. Так, в печени уровень ЖР72, НО-1 и ЖС73 оставался повышенным, что свидетельствует о наличии гипоксической и стрессорной компонент. Важно, что в скелетной мышце уже на 8-й день адаптации снижался уровень индуцибельных и конститутивных форм стресс-белков (табл. 3). Такая более медленная реакция печени может объясняться тем, что на данном органе лежит основная нагрузка по элиминации токсических веществ.
Таблица 3. Белки семейства HSP
НО-1 ШС 73 HSP 72
9Б+3ОФН (печень) 15 8 9
9Б+Г/Г+3ОФН (печень) 20 8,7 9,5
9Б+3ОФН (скелетная мышца) 9,7 10,5
9Б+Г/Г+3ОФН (скелетная мышца) 4,5 8,3
Примечание: измерение в относительных денситометрических единицах.
Таким образом, кратковременная адаптация к гипоксии-гипероксии обладает защитным эффектом в условиях интоксикации, что выражается в повышении выносливости и компенсации окислительных процессов, при этом цена такой компенсации проявляется в высоком уровне защитных белков семейства HSP в печени, но не в скелетной мышце.
Литература
1. Буеверов А. О. Лекарственные поражения печени // Рос. мед. журн. 2001. № 9. С. 13-14.
2. WangX., XingM. L., Shen Y. et al. Oral administration of Cr(VI) induced oxidative stress, DNA damage and apoptotic cell death in mice // Toxicology. 2006. Vol. 228, N 1. P. 16-23.
3. Barreto G., Madureira D., Capani F. et al. The role of catechols and free radicals in benzene toxicity: An oxidative DNA damage pathway // Environmental and Molecular Mutagenesis. 2009. Vol. 50. P. 771-780.
4. Боев В. М., Верещагин Н. Н., Скачкова М. А. и соавт. Экология человека на урбанизированных и сельских территориях / под ред. Н. Н. Верещагина, В. М. Боева. Оренбург, 2003. C. 392.
5. Сазонтова Т. Г., Архипенко Ю. В. Роль свободнорадикальных процессов и редокс-сигнализа-ции в адаптации организма к изменению уровня кислорода // Рос. физиол. ж. им. И. М. Сеченова. 2005. Т. 91, № 6. С. 636-655.
6. Архипенко Ю. В., Сазонтова Т. Г., Глазачев О. С., Платоненко В. И. Способ повышения неспецифических адаптационных возможностей человека на основе гипоксически-нипероксических газовых смесей // Патент на изобретение № 2289432 от 20.12.2006 г.
7. Утенин В. В. Гигиеническая характеристика хрома и бензола и морфофункциональные аспекты их воздействия на организм в условиях эксперимента: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2002. 24 с.
8. Тимошинова С. В., Шарапова Н. В., Михайлова И. В. и др. Влияние хронической интоксикации хромом и бензолом на антиоксидантный статус крыс // Вестн. Оренбургск. гос. ун-та. 2004. № 10. С. 132-133.
9. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Analyt. Biochem. 1979. Vol. 95. P. 351-358.
10. Kikugawa K., Kojima T., Yamaki S., Kosugi H. Interpretation of the thiobarbituric acid reactivity of rat liver and brain homogenates in the presence of ferric ion and ethylenediaminetetraacetic acid // Analyt. Biochem.1992.Vol. 202. P. 249-255.
11. Luch H. Dependence of catalase activity on hydrogen peroxide concentration // Experientia. 1953. Sep. Vol. 9(9). Р. 340-342.
12. Fridovich I. Superoxide dismutases: Anti-versus pro-oxidants? // Anticancer Agents Med. Chem. 2011. Vol. 11 (2). P. 175-177.
13. Dickinson D. A., Forman H. J. Cellular glutathione and thiols metabolism // Biochem. Pharmacol. 2002. Р. 1019-1026.
14. Андреева Л. И., Бойкова А. А., Маргулис Б. А. Белки теплового шока семейства 70 кДа в оценки состояния организма человека в норме, при стрессе и патологии // Естествознание и гуманизм. 2006. Т. 3, № 4. С. 12-15.
15. Suematsu M., Ishimura Y. The hemeoxygenase-carbon monoxide system: A regulator of hepatobiliary function // Hepatology. 2000. Vol. 31. P. 3-6.
16. Zhukova A. G., Sazontova T. G. Hemeoxygenase: function, regulation, biological role // Hypoxia Med. J. 2004. № 3. P. 30-43.
17. Платонов А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Изд-во РАМН, 2000. C. 51.
Статья поступила в редакцию 19 февраля 2013 г.
