CC BY
80
2012
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 1
ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 577; 57.05
Л. И. Андреева1, А. А. Войкова1, А. А. Быкова2, Р. И. Коваленко2
ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА ПЛОДОВ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО НА ОРГАНИЗМЕННОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
1 ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова», Санкт-Петербург;
2 ФБГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», биолого-почвенный факультет
Плоды лимонника китайского с древних времен используются народами Дальнего Востока в качестве тонизирующего и повышающего работоспособность средства, в том числе при физическом напряжении и усталости. Спиртовой экстракт плодов Schizandra chinensis включен в справочник по лекарственным средствам М. Д. Машковского в качестве препарата, тонизирующего центральную нервную систему. При этом отмечается, что физиологические и нейрохимические механизмы действия лимонника на организм изучены недостаточно. Остается открытым вопрос об адаптогенном потенциале лимонника. В этой связи необходимо вспомнить о том, что лимонник наряду с женьшенем и элеутерококком впервые стали изучать благодаря новаторскому начинанию выдающегося отечественного фармаколога Н. В. Лазарева. Научные исследования показали, что применение растений адаптогенов, так же как и синтетического лекарственного средства дибазола, приводит к повышению неспецифической устойчивости организма к неблагоприятным воздействиям, которое Н. В. Лазарев назвал «состоянием неспецифически повышенной сопротивляемости» [1]. Возникла потребность создания отдельного класса фармакологических препаратов, которые Н. В. Лазарев предложил объединить в самостоятельный фармакологический класс «адаптогены».
Хотя растения с адаптогенными свойствами с давних времен применяются в народной медицине, тем не менее, использовать их бессистемно, очевидно, нельзя, так как, несмотря на отсутствие токсических и побочных эффектов в широком диапазоне доз, вполне вероятны эффекты их передозировки, как в отношении любых фармакологических препаратов. Вторая проблема применения препаратов растительных адаптогенов, на наш взгляд, связана с необходимостью сертификации каждой партии экстрактов с определением в них активных компонентов, чтобы стандартизировать готовую к применению форму. Важно определиться с тем, в каких случаях и в каких дозировках принимать препараты растений адаптогенов, чтобы получить адаптогенный эффект или состояние неспецифически повышенной сопротивляемости.
© Л. И. Андреева, А. А. Бойкова, А. А. Быкова, Р. И. Коваленко, 2012
Целью настоящего исследования было выявление минимальной эффективной дозы и дозоэффектов густого, не содержащего спирта, стандартизированного по содержанию активного компонента схизандрина, экстракта плодов и семян Schizandra chinensis, у грызунов.
Изучались различные формы поведенческой активности, проводилось тестирование на выносливость при помощи принудительного плавания с грузом, а также выявлялось содержание в тканях печени, почек и гиппокампа крыс двух белков стресса семейства 70: конститутивного белка Hsc70 (heat shock cognate) и индуцированного стрессом Hsp70 (heat shock protein). Внутриклеточное содержание индуцибельного белка рассматривают в качестве меры воздействия стрессорных факторов на организм и как фактор повышения устойчивости клеток организма, т. е. срочной адаптации, к действию раздражающих, повреждающих факторов. Возрастание содержания конститутивного белка Hsc70, по нашему мнению, свидетельствует о развертывании в клетках организма адаптационных изменений, связанных с увеличением мощности энергопродуцирующих систем и инициации пластических процессов [2, 3].
Материалы и методы. В эксперименте использовали 80 самцов белых аутбредных мышей с массой тела 20-25 г и 26 самцов крыс Вистар массой 190-290 г из питомника «Рапполово». Животных содержали в условиях вивария при естественном освещении, а также свободном доступе к воде и пище. Изначально животные были разделены на четыре группы: 1-й группе вводили физраствор, группе 2 — раствор с суммарной дозой экстракта 4 мг/кг, группе 3 — раствор с суммарной дозой экстракта 8 мг/кг, группе 4 — раствор с суммарной дозой экстракта 16 мг/кг. Каждая группа находилась в отдельной клетке не менее 7 дней до начала опыта. Работу с животными осуществляли согласно правилам лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 2003 г.). Использовали густой экстракт (spissum), полученный из плодов Schizandra chinensis, содержащий 1,52% суммарных схизандринов, любезно предоставленный Шведским институтом трав (Vallberga, Sweden). Водный раствор вводили животным в пищевод с помощью зонда.
Поведенческие реакции у мышей оценивали в течение 5 мин в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) в сочетании с элементами открытого поля — поперечной исчерченностью через каждые 5 см. Метод основан на естественной боязни высоты и открытых пространств у грызунов [4]. Поведенческие реакции крыс оценивались в течение 3 мин в тесте «открытое поле» (ОП) [5, 6] и в течение 5 мин в тесте ПКЛ [7]. Подсчет отдельных паттернов поведения производили с помощью анализа кинозаписей опытов. В результате тестирования определяли двигательную и исследовательскую активность, степень тревожности и эмоциональности животных.
Через час после проведения поведенческих тестов крыс усыпляли внутрибрю-шинным введением тиопентала натрия (40 мг/кг). Затем производили взятие тканей печени, почек и головного мозга (гиппокамп). В образцах определяли содержание белка по методу Брэдфорд [10] и готовили пробы для электрофореза, которые хранили при температуре -20°С вплоть до определения белков стресса Hsp70 и Hsc70 методом электрофореза [8] и иммуноблотинга [9]. В работе использовали реактивы фирмы ICN (США). В качестве первичных антител использовали мышиные антитела клона 2Н9 для Hsp70 и клона N69 для Hsc70, полученные в Институте цитологии РАН. Вторичные овечьи антитела к иммуноглобулину G мыши, меченые пероксида-зой хрена (ab6789) получены из фирмы Abcam (Великобритания). Расчет количества
Нзр70 и Нзс70 в относительных единицах был сделан путем обсчета блотов с помощью программы анализа изображений, учитывающей размеры и интенсивность окраски каждого пятна.
Статистический анализ проводили с помощью программы $1а1М1са 6 с нахождением среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. Для обработки данных после исключения экстремумов использовали тест Манна—Уитни для независимых групп.
Результаты и обсуждение. Предварительные опыты с введением густого экстракта плодов Schizandra сЫпе^з, содержащего 1,52% суммарных схизандринов, показали, что минимальная действующая доза общего экстракта при внутрижелудочном введении в тесте принудительного плавания мышей с грузом составила 4 мг/кг. В дальнейших опытах были использовали дозы 4 мг/кг, 8 мг/кг и 16 мг/кг.
При курсовом внутрижелудочном введении водной суспензии густого экстракта Schizandra chinensis один раз в сутки в течение 5 и 11 дней максимальный эффект на увеличение времени плавания мышей оказала разовая доза 4 мг/кг в течение 5 дней (табл. 1). Разовая доза 16 мг/кг оказалась самой неэффективной и не уменьшала утомляемость мышей при нагрузочном плавании по сравнению с группой контроля (физиологический раствор).
Табпица 1. Максимальное время плавания мышей с грузом 6% от массы тела после курсового введения густого экстракта плодов Schizandra chinensis (с)
Группа 5-дневный курс 11-дневный курс
х ± SD median х ± SD median
1 Контроль, физ. раствор 155 ± 71 155 236±136 196
2 4 мг/кг Schizandra 394 ±122 р1>2 = 0,006 325 300 ±180 р1>2 = 0,273 253
3 8 мг/кг Schizandra 426 ± 320 Р1,з = 0,175 390 248±110 235
4 16 мг/кг Schizandra 144 ± 28 148 231 ± 72 248
В результате 5-дневного введения Shizandra chinensis мышам были отмечены тенденции изменения и достоверные различия в ряде показателей (табл. 2): увеличение числа пересеченных квадратов, количества переходов из одного закрытого рукава в другой, увеличение количества болюсов дефекации и числа уринаций, уменьшение времени груминга. Количество стоек и свешиваний не изменилось, так же как и время пребывания в закрытых/открытых рукавах. Полученные изменения, наиболее выраженные при дозе лимонника 16 мг/кг, свидетельствуют об увеличении двигательной активности без увеличения исследовательской активности мышей, тенденции к уменьшению
смещенной двигательной активности (груминга), увеличении эмоциональности (дефекации) и тенденции к увеличению тревожности и страха (уринации).
Таблица 2. Наиболее выраженные изменения поведенческой активности мышей в тесте ПКЛ после курсового 5-дневного введения Schizandra chinensis
Показатель Контроль БЛ. 4 мг/кг БЛ. 8 мг/кг БЛ. 16 мг/кг Достоверность, Р
К 1 2 3
Число пересеченных линий 53,0 ± 34,7* 40** 79,7 ± 43,1 70,5 64,4 ± 39,9 64,4 82,5 ± 27,0 82,5 К-1 0,096 К-2 0,369 К-3 0,045
Количество болюсов дефекации 0,8 ± 1,0* 1** 2,3 ± 2,6 1 2,7 ± 2,3 2,5 2,2 ± 1,5 2,5 К-1 0,369 К-2 0,047 К-3 0,046
% мышей с уринациями 10 0 20 40
Примечание: * — х ± SDJ ** — median.
После 11-дневного курса лимонника также наблюдали тенденцию к увеличению двигательной активности при дозах 4 мг/кг и 8 мг/кг, но не при дозе 16 мг/кг. При введении разовой дозы лимонника 16 мг/кг отмечали тенденцию к снижению количества переходов из одного закрытого рукава в другой. Эмоциональность животных при удлинении курса лимонника во всех использованных дозах не отличалась от таковой в группе контроля.
Наибольшие изменения поведения мышей обнаруживаются при коротком 5-дневном курсе введения лимонника в дозе 16 мг/кг, при удлинении курса до 11 дней наиболее активными оказываются меньшие дозы. В целом, при 11-дневном курсе введения лимонника сглаживается адаптационное действие лимонника в тесте принудительного плавания с грузом и изменение паттернов поведенческой активности мышей.
Сходные изменения поведения были отмечены у крыс. Введение лимонника привело к активации двигательной активности в тесте ОП, а также появлению признаков тревожности, судя по данным оценки поведения в тесте ПКЛ. В отличие от мышей у крыс отмечалась активация исследовательской активности после курса Schizandra chinensis.
Курсовое 7-дневное введение густого экстракта Schizandra chinensis в дозах 4, 8 и 16 мг/кг крысам привело к несколько отличному от мышей профилю изменения показателей поведенческой активности. Наряду с тем, что у крыс также произошло некоторое увеличение двигательной активности, в отличие от мышей отмечался рост исследовательской активности в тесте ОП (табл. 3). Для вертикальной исследовательской активности при дозе 16 мг/кг различия были статистически значимы. Эмоциональность животных не изменялась, но имела тенденцию к увеличению в тесте ПКЛ (табл. 4), где также отмечались изменения в сторону увеличения тревожности крыс (более быстрый уход в закрытые рукава и меньшее количество выглядываний из них).
Таблица 3. Поведенческие показатели у крыс в тесте ОП после 7-дневного курса Schizandra
chinensis у крыс
Показатель Контроль Sch. 4 мг/кг Sch. 8 мг/кг Sch. 16 мг/кг Достоверность, р
К 1 2 3
Число пересеченных квадратов 37,4±15,5 43,1±20,1 44,2±14,7 45,5±12,8 К-1 0,565 К-2 0,432 К-3 0,253
Количество стоек 5,3±2,4 6,7±5,0 9,8±6,2 10,5±4,5 К-1 0,898 К-2 0,199 К-3 0,038
Количество норок 3,4±2,3 6,6±3,4 4,7±2,2 7,5±3,8 К-1 0,085 К-2 0,432 К-3 0,063
Количество болюсов дефекаций 2,9±2,9 3,4±1,9 2,0±2,5 1,8±2,5 К-1 0,798 К-2 0,577 К-3 0,508
Таблица 4. Поведенческие показатели у крыс в тесте ПКЛ после 7-дневного курса Schizandra
chinensis
Показатель Контроль Sch. 4 мг/кг Sch. 8 мг/кг Sch. 16 мг/кг Достоверность, р
К 1 2 3
Время первого выбора закрытого рукава, с 49,1±11,2 30,9±9,9 31,3±9,8 24,7±7,4 К-1 0,225 К-2 0,199 К-3 0,087
Количество свеши-ваний 7,9±2,5 5,9±1,5 9,8±1,9 8,5±7,4 К-1 0,617 К-2 0,055 К-3 0,689
Количество выглядываний из закрытых рукавов 6,7±1,4 2,9±0,3 4,5±2,4 2,5±0,7 К-1 0,013 К-2 0,284 К-3 0,014
Количество болюсов дефекаций 0,6±0,3 1,1±0,6 1,3±0,7 1,8±1,0 К-1 0,381 К-2 0,372 К-3 0,432
В результате 7-дневного введения лимонника увеличилось содержание индуци-бельного белка №р70 в гиппокампе (рис. 1, а) и почке (рис. 1, б) крыс. В гиппокампе содержание №р70 увеличилось при дозе лимонника 4 мг/кг в 1,3 раза (р = 0,083), при дозе 8 мг/кг — в 1,7 раза (р = 0,021), при дозе 16 мг/кг — в 1,5 раза (р = 0,149). В почке содержание №р70 возросло при дозе лимонника 4 мг/кг — в 1,9 раз (р = 0,043), при дозе 8 мг/кг — в 2,2 раза (р = 0,043), при дозе 16 мг/кг — в 3,0 раза (р = 0,043). Содержание Изр70 в печени крыс гораздо меньше, чем в других органах, и в норме не выявляется
с помощью недостаточно чувствительной для малых количеств белка пероксидаз-ной реакции, хотя ранее при тепловом стрессе мы наблюдали массивную экспрессию №р70 в печени крыс (данные не представлены). Курсовое введение лимонника не привело к увеличению содержания №р70 в печени крыс.
а
160
Контроль ЭсИ.4мг/кг ЭсИ-вмг/кг ЭсМ бмг/кг
б
Контроль ЭсИДмг/кг Бс^в мг/кг ЭсМбмг/кг
Рис. 1. Содержание №р70 в тканях гиппокампа и почки крыс. Вверху иммуноблот, внизу — гистограмма содержания №р70 в относительных единицах после подсчета интенсивности и площади пятен. Каждый столбик — одно животное; а — гиппокамп, содержание общего белка в пробе 50 мкг; б — почка, содержание общего белка в пробе 100 мкг.
Содержание конститутивного белка Hsc70 в гиппокампе, так же как и №р70, увеличилось после курсового введения лимонника (рис. 2, а): при дозе 4 мг/кг — в 1,4 раза (р = 0,149), при дозе 8 мг/кг — в 1,7 раза (р = 0,021), при дозе 16 мг/кг — в 1,6 раза (р = 0,021). В почке мы не отметили достоверного увеличения содержания Hsc70, намечается незначительная тенденция к увеличению содержания Hsc70 после курса лимонника в дозах 8 и 16 мг/кг (рис. 2, б). Также было отмечено небольшое увеличение содержания Hsc70 в печени после курса лимонника в дозах 4 и 16 мг/кг (рис. 2, в): в 1,4 (р = 0,061) и в 1,5 раза (р = 0,043).
Недельный курс густого экстракта плодов Schizandra ^те^з с содержанием общих схизандринов 1,52% у крыс в дозах 4, 8 и 16 мг/кг приводит к увеличению содержания в тканях обоих белков стресса семейства 70. Можно полагать, что краткий курс лимонника в небольших дозах индуцирует механизмы срочной адаптации (Шр70) и адаптации, связанной с активацией энергетических и пластических процессов (Hsc70).
В литературе имеются сведения о защитной роли активного компонента суммарного препарата семян лимонника схизандрина В при его разовом введении крысам. Так, было показано, что разовое внутрижелудочное введение большой дозы схизандри-на В (1,2 миллимоля/кг или 480 мг/кг) увеличивало содержание №р70 и №р25 в сердце крыс, что авторы связывают с защитным эффектом схизандрина на изолированное сердце при его последующей ишемии/реперфузии [11]. Были получены также положительные результаты при применении разовой большой дозы схизандрина В (2 милли-моля или 804 мг/кг) за сутки до поражения печени мышей четыреххлористым углеродом, при этом авторы констатировали увеличение содержания №р70 и №р25 в печени мышей после введения схизандрина В [12]. Курсовое введение гораздо меньших доз схизандрина В (10 мг/кг в день в течение 15 дней) привело к улучшению антиоксидант-ного статуса митохондрий и увеличению содержания №р25 и №р70 в мозге, печени, сердце и скелетной мышце крыс [13].
Мы впервые показали, что гораздо меньшие дозы суммарного препарата лимонника, содержащего 0,006 мг/кг, 0,012 мг/кг и 0,018 мг/кг схизандрина, в отсутствие повреждающих воздействий способны заметно увеличивать содержание №р70 в тканях крысы после недельного курсового введения. Следует отметить, что в реализации действия лимонника на целый организм необходимо участие нейро-эндокринных факторов, прежде всего симпато-адреналовой системы [14]. Демонстративным показателем клеточной реакции на стресс служит увеличение содержания в клетках белков теплового шока, среди которых видное место занимает №р70. Интересно, что добавление суммарного экстракта плодов лимонника к временной культуре мононуклеарных клеток крови человека в отсутствие воздействия системных факторов (нейромедиаторов, гормонов) не увеличило содержание в них №р70, но увеличило содержание конститутивного белка Hsc70 [2], незаменимого при адаптивном синтезе ряда клеточных белков. Реализация действия лимонника осуществляется с вовлечением центральных механизмов ответа организма на стресс, что в первую очередь проявляется в увеличении содержания в тканях индуцибельного белка №р70, повышающего устойчивость клеток организма к повреждающим факторам стресса. Увеличение содержания в клетках №р70, с одной стороны, служит маркером клеточного стресса, а с другой стороны, представляет собой важный фактор повышения устойчивости клеток к дополнительным вызовам, предъявляемым организму. Симпатомиметическое действие Schizandra
Контроль
БсГ). 4 мг/кг
БсИ. 8 мг/кг
БсИ. 16 мг/кг
б
Контроль ЭсЬ 4 мг/кг ЭсИ б мг/кг ЭсИЛб мг/кг
Рис. 2. Содержание Нвс70 в тканях гиппокампа, почки и печени крыс.
Вверху иммуноблот, внизу — гистограмма содержания Шс70 в относительных единицах после подсчета интенсивности и площади пятен. Каждый столбик — одно животное; а — гиппокамп, содержание общего белка в пробе 5 мкг; б — почка, содержание общего белка в пробе 20 мкг; в — печень, содержание общего белка в пробе 5 мкг.
chinensis было показано еще 20 лет назад с помощью фармакологических исследований, в которых лимонник усиливал действие симпатомиметиков и ослаблял эффекты симпатолитиков, адренолитиков и анестезирующих препаратов [15, 16].
Усиление моторной и исследовательской активности животных, выявленное нами после краткого курсового введения небольших доз препарата плодов лимонника, проявление эмоциональности и тревожности являются отражением активации центральных медиаторных механизмов, сходных с таковыми при стрессе. Превышение минимальной дозы экстракта плодов лимонника 4 мг/кг, либо удлинение курса не увеличивают время принудительного плавания мышей с грузом и могут даже уменьшать его [17], напоминая истощающее действие психомоторных стимуляторов.
Таким образом, повышение физической работоспособности с минимальными проявлениями тревожности у грызунов может быть достигнуто после краткого в течение нескольких дней приема экстракта плодов Schizandra chinensis с содержанием общих схизандринов 1,52% в дозах 4 мг/кг и 8 мг/кг.
Найдены режимы и дозы густого экстракта плодов Schizandra chinensis, достаточные для достижения срочной адаптации (Hsp70) и активации пластических и энергетических процессов (Hsc70), что мы связываем с формированием клеточной основы «состояния неспецифически повышенной сопротивляемости» по Н. В. Лазареву.
Литература
1. Лазарев Н. В. Состояние неспецифически повышенной сопротивляемости / Н. В. Лазарев, Е. И. Люблина, М. А. Розин // Патол. физиол. экс. тер. 1959. № 4. С. 16-21.
2. Андреева Л. И., Бойкова А. А., Маргулис Б. А. Особенности внутриклеточного содержания и функциональная роль белков теплового шока семейства 70 кДа при стрессе и адаптации // Технологии живых систем. 2009. Т. 6, № 3. С. 11-17.
3. Бойкова А. А. Конститутивная изоформа белка теплового шока 70 кДа мононуклеа-ров крови человека как маркер адаптации при нормобарической гипоксической тренировке / А. А. Бойкова, Л. И. Андреева, Б. А. Маргулис // Российский физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2006. Т. 92, № 7. С. 835-842.
4. Lister R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse // Psychopharmacology (Berlin). 1987. Vol. 92. P. 180-185.
5. Пошивалов В. П. Этологический атлас для фармакологических исследований на лабораторных грызунах. М., 1978. 43 с. Деп. в ВИНИТИ, № 3164-78.
6. Шабанов П. Д. Дофамин и подкрепляющие системы мозга / П. Д. Шабанов, А. А. Лебедев, Ш. К. Мещеров. СПб.: Лань, 2002. 208 с.
7. Green S. Animal models of anxiety / S. Green, H. Hodges // Behavioural Models in Psychopharmacology / ed. by P. Willner. Cambridge: CUP, 1991. P. 21-49.
8. Laemmli U. K. Cleavage and structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
9. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Staeheln, J. Gordon // Proc. Nat. Acad. Sci. 1979. Vol. 7. P. 4350-4354.
10. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
11. Chiu P. Y., Ko K. M. Schisandrin B protects myocardial ischemia-reperfusion injury partly by inducing Hsp25 and Hsp70 expression in rats // Mol Cell Biochem. 2004. Vol. 266, № 1-2. Р. 139-144.
12. ^iu P. Y. Hepatoprotective mechanism of schisandrin B: role of mitochondrial glutathione antioxidant status and heat shock proteins / P. Y. Chiu, M. H. Tang, D. H. Mak et al. // Free Radic Biol Med. 2003. Vol. 35, № 4. Р. 368-380.
13. Chiu P. Y. Chronic schisandrin B treatment improves mitochondrial antioxidant status and tissue heat shock protein production in various tissues of young, adult and middle-aged rats / P. Y. Chiu, H. Y. Leung, M. K. Poon, K. M. Ko // Biogerontology. 2006. Vol. 7, № 4. Р. 199-210.
14. Panossian A. Stimulating effect of adaptogens: an overview with particular reference to their efficacy following signal dose administration / A. Panossian, H. Wagner // Phytother. Res. 2005. Vol. 19. P. 819-838.
15. Лупандин А. В. Роль катехоламинергических синапсов в механизмах формирования адаптации с участием полифенольных адаптогенов // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 1989. Т. 75, № 8. С. 1082-1088.
16. Лупандин А. В. Основной механизм адаптации организма под влиянием полифенольных адаптогенов // Успехи физиол. наук. 1991. Т. 22, № 1. С. 20-39.
17. Тимонина Н. А., Вискова С. А. Влияние экстракта семян лимонника на работоспособность мышей // 11-я Всерос. мед.-биол. конф. мол. исслед. «Человек и его здоровье». Фундаментальная и клиническая медицина. СПб., 2008. С. 361-362.
Статья поступила в редакцию 7 декабря 2011 г.
