CC BY
96
УДК 615.453.3;615.331
ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИЙ
А.В.КОРОЧННСНИЙ1 Э.Ф. СТЕПАНОВА1 Ю.И. ОСТРОУМОВ2
В настоящей статье экспериментально проведена и обоснована оценка биологической активности и сохранности лекарственных препаратов на основе бактерий, иммобилизованных альгинатом натрия.
1 Пятигорская государственная фармацевтическая академия
2 Институт инженерной иммунологии, г.Москва
Ключевые слова: иммобилизация, альгинат кальция, антагонистическая активность, биоагент, биоспорин, хито-зан.
e-mail: a.v.korochinskii@mail.ru
Введение. В последние годы получили распространение новые подходы к лечению, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных и биопрепаратов. В настоящее время усилиями новых промышленных и коммерческих структур традиционно существовавший дефицит этих препаратов в основном снят. Но их применение, как правило, основано на экстенсивной схеме дозирования, заключающейся в использовании значительного количества бактерий. Это связано с необходимостью обеспечения прохождения терапевтически значимых концентраций микроорганизмов через среду желудка, ведь именно там они подвергаются губительному воздействию ряда гидролитических ферментов и кислоты [1].
Одним из вариантов решения этой проблемы стало применение различных методов защиты вводимой клеточной массы пробиотика. Наиболее простым и часто применяемым технологическим приемом является использование капсул с ацидорези-стентной оболочкой. Другой, более сложный, прием заключается в использовании различных носителей, которые пространственно ограничивают клетки микроорганизмов. Данный метод был предложен Кирстеном и Бьюком и предусматривает промышленное применение [2].
Наше внимание привлекла иммобилизация клеток (адсорбционная и пространственная) с дальнейшей модификацией поверхности полученной лекарственной формы, что способствует повышению стрессоустойчивости клеток в неблагоприятных условиях.
В настоящее время увеличивается интерес к совершенствованию препаратов пробиотиков путем иммобилизации клеток микроорганизмов. Одним из наиболее перспективных и привлекательных способов иммобилизации является включение живых клеток в структуру гелей альгинатов [3, 4].
Полученная форма, состоящая из адсорбированных клеток, пространственно ограниченных гелями полимеров, имеет достаточно большие перспективы как самостоятельная форма выпуска и как промежуточный продукт, который после дополнительной относительно несложной модификации возможно использовать не только в составе твердых, но и жидких лекарственных форм, что расширит круг выпускаемых в настоящее время пробиотиков, а также значительно улучшит их потребительские свойства.
Поэтому целью настоящих исследований является использование методик оценки биологической и антагонистической активности для лекарственных препаратов на основе бактерий, иммобилизованных альгинатом натрия.
Материалы и методы. Возможно использование активированного угля в качестве адсорбента, а также природных биодеградируемых нетоксичных полисахари-
02233101310132015301313200305323004831014832005353
дов, таких как хитозан и альгинат натрия различных марок. Такая форма примечательна тем, что за счет сорбции на частицах угля удается создать микроколонии бактерий, находящиеся в особом физико-химическом окружении, что повышает их антагонистическую активность, а модификация раствором хитозана создает защиту от агрессивных факторов среды желудка.
В качестве носителя нами использовался чистый альгинат, альгинат с микрочастицами активированного угля, а также применялась обработка поверхности получаемых гранул раствором хитозана
В качестве тест-культур использовали Staphilococcus aureus штамм 209, Shigella sonnei штамм 5069, Proteus vulgaris штамм 177, Candida albicans штамм 885-653 из коллекции ГИСК им. Тарасевича.
Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенных исследований было показано, что обработка альгинатных капсул раствором хитозана обеспечивала улучшение качества и стабильности капсул. Это можно объяснить появлением оболочки полиэлектролитного комплекса на поверхности капсул и возможным дальнейшим распространением реакции между макромолекулами полиэлектролитов вглубь ядра гранул.
Оценку биологической активности (биологической концентрации — БК) и сохраняемости препаратов на основе бактерий, иммобилизованных альгинатом кальция, проводили путем определения биологической концентрации микроорганизмов методом высева на плотную питательную среду (среда Гаузе). Общую концентрацию микроорганизмов оценивали по счету в камере Горяева и по оптической концентрации, определенной по стандарту мутности.
Антагонистическую активность оценивали методом отсроченного антагонизма по величине зоны задержки роста тест-культур (в миллиметрах), которую считали:
- нулевой при зоне задержки роста до 5 мм;
- низкой — от 5 до 10 мм;
- средней — от 10 до 15 мм;
- высокой — от 15 до 20 мм;
- очень высокой — более 20 мм [5].
При иммобилизации клеток по указанной методике образуются сферические частицы (гранулы), имеющие одинаковый диаметр. В качестве носителя нами использовался чистый альгинат, альгинат с микрочастицами активированного угля (для дополнительной адсорбции клеток), а также применялась обработка поверхности гранул раствором хитозана.
Указанные показатели определяли для препаратов, приготовленных на основе коммерческого препарата БИОСПОРИН (образец 1) и на основе концентрированной суспензии B.subtilis шт. 3, приготовленной в лабораторных условиях на плотной питательной среде и ресуспендированной в гипертоническом растворе (ОК=7,6*1010 сп*г-1, БК=7,2*1010 сп*г-1, СО=9,2%) (образец 2). Кроме того, указанные показатели определяли для тех же препаратов на конечные сроки хранения, которые составили для образца 1 практически 4 месяца, а для образца 2 — более 1 месяца.
Таблица 1
Характеристики общей и биологической концентрации препаратов
№ п/ п Наименование препарата Концентрация микроорганизмов, *109 сп*г-1
Общая по стандарту мутности Общая по счету в камере Горяева БК
1 Образец 1 0,4 0,37 0,32± 0,06
2 Образец 1 (хр.) 0,5 0,42 0,36 ±0,07
3 Образец 2 55 52 56 ±11
4 Образец 2 (хр.) 6о 54 55 ±8
Полученные результаты свидетельствуют о высокой сохраняемости микроорганизмов, входящих в состав препаративной формы как на стадии приготовления, так и в процессе хранения. Некоторая девиация показателя общей концентрации объясняется значительной методической погрешностью их определения.
Практическое отсутствие инактивации биоагента в составе препарата в процессе кратковременного хранения позволяет предположить, что препарат будет характеризоваться высокой устойчивостью при хранении в течение одного года и более.
Результаты исследования антагонистической активности препаратов приведены в табл. 2.
Таблица2
Показатели антагонистической активности препаратов в отношении регламентированных тест-штаммов
№ п/п Наименов ание препарата Зона задержки тест-культур, мм
S.aureus 209 Sh.sonnei 5069 P.vulgaris 177 C.albicans 885- б53
1 Образец 1 32,9 ± 2,9 17,2± 1,8 20,2± 3,1 32,2± 2,3
2 Образец 1 (хр.) 31,2 ± 3,1 1б,4± 2,2 20,0± 2,2 32,3± 3,1
3 Образец 2 33,6 ± 3,4 18,0± 2,1 21,3± 3,4 33,1± 3,0
4 Образец 2 (хр.) 32,5 ± 3,5 17,3 ±2,3 21,1 ± 2,8 33,3 ±3,5
Данные табл. 2 свидетельствуют о сохранении микроорганизмами высокой антагонистической активности по отношению к тест-культурам патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, что позволяет сделать вывод об отсутствии в ходе приготовления препаративных форм технологических воздействий, способных существенно изменить свойства биоагента.
Выводы. Таким образом, впервые известные методики, используемые для определения биологической и антагонистической активности различных препаратов, были апробированы на моделях лекарственных препаратов, полученных на основе иммобилизованных бактерий, что позволит осуществлять контроль активности в отношении некоторых выпускаемых пробиотиков, лекарственные формы которых про- изведены на основе иммобилизованных бактерий
Литература
1. Демаков, В.А. Иммобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты / В.А. Демаков, Ю.Г. Максимова, А.Ю. Максимов / Биотехнология. — 2008. — № 2. — С. 30.
2. Ананьева, Н.В. Совершенствование технологии пробиотических культур прямого внесения для молочных продуктов : автореф. дис. ... канд. техн. наук / Н.В. Ананьева ; ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии», 2007.
3. Anil, K.A. Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery / A.K. Anil, H. Singh // Singh Trends in Food Science & Technology. — 2007. — №18. — Р. 240-251.
4. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / пер. с англ. ; под ред. Дж. Вудворда.-М.: Мир, 1988. -С.22.
5. ФС 42-3476-98. Биоспорин. Фармакопейная статья.
ASSESSMENT OF BIOLOGICAL AND ANTAGONISTIC ACTIVITY OF PREPARATIONS ON THE BASIS OF THE IMMOBILIZED BACTERIA
A.V.KOROCHINSKIY1 E.F. STEPANOVA1 U.I. OSTROUMOV2
1 Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy
2 Institute of engineering immunology, Moscow e-mail: a.v.korochinskii@mail.ru
In the present article the assessment of biological activity and safety of medicines on the basis of the bacteria, immobilized alginaty sodium is carried experimentally out and proved.
Key words: immobilization, alginat calcium, antagonistic ac- tivity, bioagent, biosporin, chitosan, bioactivity, biocompatibility, bioresistibility.
