CC BY
54
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
ИССЛЕДОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ И ФЕРМЕНТАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
1 2 3
Сулейменова К.С. , Назаренко Т.А. , Никитин Е.Б.
1Сулейменова Кымбат Сагиндыковна - докторант;
2Назаренко Татьяна Антоновна - кандидат технических наук, профессор;
3Никитин Евгений Борисович - доктор ветеринарных наук, профессор, кафедра сельского хозяйства и биоресурсов, Инновационный Евразийский университет, г. Павлодар, Республика Казахстан
Аннотация: на базе лабораторий Инновационного Евразийского университета и Санитарно-эпидемиологической станции г. Павлодара был проведен скрининг консорциума пробиотических культур, предназначенных для получения бактериального препарата, а также были исследованы симбиотические и производственно-ценные свойства культур. Для исследования были выбраны известные культуры-пробиотики: L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum. Для создания продуктов функционального питания был произведен подбор консорциума L. acidophilus + B. bifidum № 1 в соотношении (1:2) с симбиотическими свойствами, обладающими выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным тест-микробам E. Coli, Shigella sonnei, Staph. Aureus. Были были проведены исследования по изучению устойчивости к шести из наиболее известных антибиотиков: и обнаружено, что наибольшей природной устойчивостью к антибиотикам обладают бактерии консорциума L. acidophilus + B. bifidum № 1 в соотношении (1:2).
Далее были исследованы образцы молочно-растительной смеси на биохимическую активность и производственно-ценные свойства консорциума монокультур. Для исследования были взяты 5 образцов молочно-растительной смеси, в которую вносили бактериальный препарат, состоящий из B. bifidum № 1 и L. acidophilus. Показатели качества смеси определяли в соответствии с ГОСТ. По показателям качества 3 из полученных 5 образцов соответствуют стандартным требованиям, что является научным подтверждением возможности использования консорциума пробиотических культур, состоящего из бифидобактерий B. bifidum № 1 и молочнокислых бактерий L. acidophilus в соотношении (1:2) для ферментации пищевых продуктов.
Ключевые слова: пробиотические культуры, тест-микробов, антагонистическая активность, устойчивость к антибиотикам, бактериальный препарат, L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum, симбиотические свойства, функциональные продукты, иммобилизация.
УДК 637.146
Введение общее: В основе жизнедеятельности организма человека лежит питание. Поддержание здоровья человека напрямую связано с организацией его питания на всех этапах жизненного пути человека.
В процессе жизнедеятельности, на фоне снижения количества полезной микрофлоры, в организме человека происходит увеличение условно-патогенных микроорганизмов и продуктов их метаболизма, что приводит к возникновению различных заболеваний.
В последние годы большее внимание уделяется созданию продуктов функционального питания, способных оказывать определенное регулирующее действие на организм в целом или на его отдельные системы и органы.
В настоящее время в биотерапии и профилактике нарушений желудочно-кишечного тракта человека рекомендуется применение пробиотиков и продуктов функционального питания, регулирующих нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта [1].
Пробиотические продукты эффективны для восстановления баланса нормофлоры, служат инструментом повышения иммунитета и защиты организма при воздействии неблагоприятных экологических условий, нарушениях обмена веществ, после гормональной, лучевой и антибактериальной терапии, при острых и хронических заболеваниях и дисфункциях пищеварительной системы, вызванных стрессами, несбалансированным питанием [2].
Положительный эффект достигается как путем введения живых клеток лактобактерий непосредственно в организм человека (так называемые пробиотики) в виде биопрепаратов, так и путем использования этих микроорганизмов в составе заквасок при производстве продуктов питания, в том числе на основе молока. Создание биопродуктов функционального питания на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов рассматривается как стратегическое направление альтернативной медицины, способствующее поддержанию и восстановлению здоровья человека [3].
Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к отбору природных микроорганизмов при создании бактериальных препаратов.
К важнейшей категории функционального питания в настоящее время относят бактериальные препараты, содержащие живые штаммы нормальной микрофлоры человека.
Фундаментальные и прикладные исследования учёных Казахстана направлены на создание научно обоснованных рецептур и рационов для человека, обогащенных функциональными ингредиентами, важнейшими из которых являются такие, как пробиотики, витамины, микроэлементы, пищевые волокна, жирные кислоты и другие. Важно обеспечить то, чтобы вышеуказанные функциональные ингредиенты были составной частью питания человека.
Исследованиями ведущих учёных Казахстана и России установлено, что пробиотики, к которым относятся L. acidophilus, Pr. shermanii, бифидобактерии и другие культуры являются живыми микроорганизмами, которые транзитом поступают в ЖКТ и эффективно защищают организм от многих канцерогенов и токсинов, угнетают патогенную микрофлору, синтезируют некоторые витамины, улучшают утилизацию лактозы, абсорбцию кальция, адаптацию белков, а также выполняют ряд других функций в организме человека [4].
Исследование и описание
Для проведения аргументированного скрининга консорциума пробиотических культур, предназначенных для получения бактериального препарата, необходимо исследовать их свойства.
При оценке качества пробиотических культур имеют большое значение проявление ими таких свойств, как:
- антагонистическая активность;
- взаимодействие с веществами, например, растительными компонентами, добавленными в качестве пребиотиков;
- устойчивость к антибиотикам;
- производственно-ценные (кислотообразование, активность свертывания и др.).
Для исследования выбраны известные культуры-пробиотики: L. acidophilus,
Bifidobacterium bifidum № 1 и их консорциум в соотношении 1:2, соответственно [5].
Для создания синбиотических продуктов необходим подбор консорциумов с симбиотическими свойствами, обладающими выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным тест-микробам.
Исследования проведены в условиях лабораторий Санэпидемстанции г. Павлодара, располагающей коллекцией тест-микробов. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Антагонистическая активность монокультур и их консорциума
Вид культур Зона по ражения тест-микробов, мм
E. coli Shigella sonnei Staph. aureus
L. acidophilus 14,5 15,0 14,0
B. bifidum № 1 11,5 18,0 13,5
Консорциум L. acidophilus + + B. bifidum № 1 (1:2) 15,0 18,5 16,0
Таблица 2. Индексы ингибирования роста патогенных тест-микробов изучаемыми культурами
Вид культур Индексы ингибирования роста патогенных тест-микробов, %
E. coli Shigella sonnei Staph. aureus
L. acidophilus 46,8 48,5 38,0
B. bifidum № 1 10,8 75,8 35,0
Консорциум L. acidophilus + + B. bifidum № 1 (1:2) 49,5 80,5 42,0
Сравнительный анализ антагонистической активности монокультур, их консорциума и индекса ингибирования роста патогенных тест-микробов по экспериментальным данным, представленным в таблицах 1 и 2, свидетельствует о получении достоверных данных, подтверждающих литературные.
Немаловажное значение при подборе культур микроорганизмов для пробиотических и синбиотических продуктов придается такому свойству, как устойчивость к антибиотикам.
Известно, что совместное применение антибиотиков и антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника.
Устойчивость к антибиотикам природных штаммов микроорганизмов является свойством, которое передается по наследству, а значит, зависит от генотипа и его устойчивости [6, 7].
В то же время, для некоторых штаммов бактерий, антибиотики могут выступать в качестве неблагоприятного фактора, который приводит к изменению свойств бактерий, в частности, стимулирует выход умеренного фага из клеток бактерий [8].
В связи с этим, были проведены исследования по изучению устойчивости к антибиотикам культур бактерий и их консорциума.
Условия постановки эксперимента приведены в таблице 3.
Таблица 3. Наименование и изучаемые дозы воздействия антибиотиков на культуры исследуемых микроорганизмов
Антибиотик Единицы измерения активности антибиотика Изучаемые дозы антибиотика
бисептол ЕД/см3 4,8; 0,48; 0,048;0,0048; 0,0024
эритромицин Мкг/см3 2000; 200; 20; 2; 1
ампициллин Мкг/см3 500; 50; 25; 5; 2,5
стрептомицин Мкг/см3 10000; 1000; 100; 10; 1
оксациллин Мкг/см3 5; 0,5; 0,05; 0,025; 0,0025
гентамицин Мкг/см3 80; 8; 4; 0,8; 0,4
Полученные нами данные по исследованию природной устойчивости культур шести из наиболее известных и применяемых в терапии, как взрослых, так и детей, антибиотикам (таблица 3) свидетельствуют о том, что наибольшей природной устойчивостью обладают к:
- бисептолу (4,8 ЕД/см3) - L. acidophilus, B. bifidum № 1 и их консорциум;
- эритромицину (200 Мкг/ см3) - L. acidophilus и консорциум культур;
- ампицилину (5 Мкг/ см3) - L. acidophilus, B. bifidum № 1 и их консорциум;
- стрептомицину (1000 Мкг/см3 и более) - L. acidophilus и консорциум культур;
- оксациллину (0,05 Мкг/ см3) - L. acidophilus и консорциум культур;
- гентамицину (80 Мкг/см3) - L. acidophilus, B. bifidum № 1 и их консорциум. Приведенные выше данные позволяют считать комбинацию исследуемых
пробиотиков эффективной.
Так же были исследованы биохимическая активность и производственно--ценные свойства монокультур, их консорциума результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4. Биохимическая активность и производственно-ценные свойства культур
Вид культур Кислотообразован ие, °Т Активность свертывания, ч Логарифм количества клеток
L. acidophilus 75,0±2,0 4,5±0,5 9,2±0,5
B. bifidum № 1 60,0±1,0 9,5±1,0 8,5±0,2
Консорциум L. acidophilus + B. bifidum № 1 (1:2) 80,0±5,0 5,0±1,0 10,2±0,5
Далее проводили иммобилизацию клеток бактериального концентрата в гели желатина, пектина и агара.
Для приготовления раствора гелеобразователи предварительно замачивали в 0,9%-ном растворе хлористого натрия, выдерживали 40-60 мин, растворяли при температуре 95 °С и охлаждали до 40°С.
Для проведения иммобилизации суспензию клеток бактериального концентрата активированного на обезжиренном молоке смешивали с раствором гелеобразователя при температуре 40±2 °С и капали в охлажденный раствор хлористого натрия при постоянном помешивании, выдержали 20 мин для затвердевания и получения круглых капсул.
Таблица 5. Состав ингредиентов образца №1 для иммобилизации бактериальных клеток на
желатине
Для иммобилизации Количество
Суспензия клеток 2 мл
Желатин 5,8 г
Вода 20 мл
Таблица 6. Состав ингредиентов образца № 2 для иммобилизации клеток на пектине
Для иммобилизации Количество
Суспензия клеток 2 мл
Пектин 0,8 г
Вода 12 мл
Для иммобилизации Количество
Суспензия клеток 2 мл
Агар 1,8 г
Вода 54 мл
Таблица 8. Состав ингредиентов образца № 4 для иммобилизации на желатине - пектине
Для иммобилизации Количество
Суспензия клеток 2 мл
Желатин 7 г
Пектин 0,3 г
Вода 60 мл
В процессе иммобилизации бактериальных клеток в гели мы пришли к выводу, что не все гелеобразователи образуют четкую форму капсулы кроме образца № 1 и № 4. Образец № 2 и № 3 были выполнени способом наслаивания и размазыванием в форме плотного геля, затем выдерживали при температуре +2-6 °С и измельчали образец № 2 до рыхлого порошка, а образец № 3 до мелких плотных гранул, после этого иммобилизованный концентрат использовали для ферментации молочно - растительных смесей.
Для ферментации смеси вносили иммобилизованный бактериальный концентрат, состоящий из B. bifidum № 1 и L. Acidophilus в виде круглых капсул.
В экспериментальных исследованиях по изучению процесса ферментации молочно-растительной смеси с различным видовым составом, использовался лиофилизированный концентрат молочнокислых бактерий и бифидобактерий с бактериальной формулой ПаКДСтБФ в активизированном виде в соответствии с рабочей рекомендацией производителя - одна порция на 200 дм3 (количество жизнеспособных бифидобактерий в одной порции - 30 млрд. КОЕ, молочнокислых бактерий - 35 млрд. КОЕ).
Данные, приведённые в таблице 9, показывают, что исследуемый бактериальный концентрат имеет высокую активность по продолжительности свертывания смеси и значительное число жизнеспособных клеток.
Таблица 9. Характеристика ферментированной молочно-растительной смеси
Вариант Кислотность Время образования сгустка, ч Органолептические показатели, баллы
титруемая, оу активная, ед рН
1 2 3 4 5
Серия I
Контроль 85 5,20 8,0±0,5 12±1,0
1 2 3 4 5
Опыт 1 82 5,64 7,0±0,5 13±0,5
Опыт 2 80±0,5 5,65 7,5±0,5 15±0,5
Опыт 3 72±0,5 5,66 6,5±0,5 14±0,5
Опыт 4 70±0,5 5,68 5,0±0,5 12
Результаты эффективности влияния культур в иммобилизованной форме на процесс ферментации молочно-растительной смеси оценивался по биохимическим, микробиологическим и органолептическим показателям готовых ферментированных продуктов.
Результаты экспериментальных исследований процесса ферментации молочно-растительной смеси в зависимости от количества добавленной закваски - культур в иммобилизованной форме приведены на рисунках 1 и 2.
□ Контроль - 5 % о Опыт 1 - 5 % ж Опыт 2 - 7 % о Опыт 3 - 9 %
Рис. 1. Динамика процесса ферментации молочно-растительной смеси (рисовая мука) в зависимости от количества бактериального концентрата
Результаты исследования микробиологических показателей молочно-растительных смесей приведены на рисунке 2
го ш
I- со
о О
И
0 (О
^ ¡1 #§
^ а.
1 i
10^ 9 8 7 6 5
.XI
Общее Ацидофильной Бифидобактерий
количество палочки
□ Контроль □ Опыт 4 □ Опыт 5 □ Опыт 6
4
Рис. 2. Результаты исследования микробиологических показателей молочно-растительных
смесей
Сравнение степени влияния бактериального концентрата в иммобилизованной форме на объем жизнеспособной молочнокислой микрофлоры и бифидобактерий позволяет считать, что доза бактериального концентрата в иммобилизованной форме должна быть 7-9% от массы молочно-растительного смеси.
Полученные результаты исследования являются научным подтверждением возможности получения консорциума пробиотических культур, состоящего из
бифидобактерий B. bifidum № 1 и молочнокислых бактерий L. acidophilus для иммобилизации и ферментации пищевых продуктов.
Практическая значимость. В процессе исследований установлено, что консорциум пробиотических культур L. acidophilus + B. bifidum № 1 (1:2) обладает симбиотическими свойствами, проявляемыми в высоких биохимических и производственно-ценных, антагонистических свойствах и природной устойчивости к основным антибиотикам, что позволяет считать данную ассоциацию перспективной для проведения дальнейших исследований в составе бактериального препарата для иммобилизации и получения функциональных продуктов, в том числе кисломолочных.
Список литературы
1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III: Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 2001. 288 с.
2. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: монография. М.: МГУПБ, 2001. 169 с.
3. Рогов И.А., Титов Е.И., Ганина В.И. и др. Синбиотики в технологии продуктов питания. М.: МГУПБ, 2006. 218 с.
4. Шарманов Т.Ш. Казахстан в контексте глобальных проблем питания. Алматы: Баспа, 2000. 224 с.
5. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III: Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 2001. 288 с.
6. Гаврилова Н.Б. Научные и практические основы биотехнологии молочных и молокосодержащих продуктов с использованием иммобилизации клеток микроорганизмов: монография / Н.Б. Гаврилова, О.А. Гладилова, Н.Л. Чернопольская. Омск: Вариант-Омск, 2011. 184 с. 6.
7. Гаврилова Н.Б. Экспериментальное исследование иммобилизации клеток микроорганизмов в гель биополимеров / Н.Б. Гаврилова // Техника и технология пищевых производств. № 3 (26), 2012. С. 21-28.
8. Назаренко Т.А. Биотехнология продуктов для функционального питания: пробиотики, синбиотики, методы иммобилизации: Аналит. Обзор // Т.А. Назаренко, О.В. Пасько. Павлодар: Павлодарский ЦНТИ, 2006. 39 с.
