CC BY
178
665.117.4:637.146
МЕТОДИКА СОЗДАНИЯ АССОЦИАЦИИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИИ
Н.Р. ХАМИТОВА \ Т.И. ТИМОФЕЕНКО2, B.C. ЯКИМЕНКО2
1 ООО «Биотроф»,
192288, г. Санкт-Петербург, а/я 183; тел.: (981) 891-95-67, электронная почта: [email protected] 2 Кубанский государственный технологический университет,
350072, г. Краснодар, ул. Московская, 2; тел.: (861) 275-24-93, электронная почта: [email protected]
Представлена методика разработки комбинированного пробиотического препарата на основе штаммов молочнокислых микроорганизмов Lactobacilus acidophilus и Lactococcus lactis. Выявлены технологические и пробиотические свойства штаммов. Определены оптимальные режимы их совместного культивирования.
Ключевые слова: пробиотики, ассоциация микроорганизмов, пробиотические свойства, антибиотикоустойчивость.
Сегодня большое распространение имеют продукты, полученные с использованием молочнокислых бактерий, которые рассматриваются как составляющая функционального питания человека и способствуют профилактике ряда заболеваний. Пробиотики - это бактерийные препараты из живых микробных культур, предназначенные для коррекции микрофлоры организ-ма-хозяина и лечения ряда заболеваний [1].
При анализе механизмов воздействия микроорганизмов на физиологические функции кишечника в качестве наиболее значимых следует выделить следующие:
бактериостатическое действие, которое оказывают низкомолекулярные метаболиты сахаролитической микрофлоры, в первую очередь короткоцепочечные жирные кислоты (пропионовая, масляная, уксусная, муравьиная, молочная и др.), лактат и др.; они способны ингибировать рост сальмонелл, дизентерийных шигелл, многих грибов, предотвращают адгезию потенциально патогенных бактерий к эпителию, блокируя рецепторы эпителиоцитов своими адгезинами;
воздействие на моторную функцию кишечника, в основе которого лежат несколько механизмов: продукция бактериями микробных простагландинов; изменение метаболизма желчных кислот с преимущественным накоплением форм, схожих с рициноловой кислотой касторового масла;
продуцирование физиологически активных субстанций, различных гормоноподобных соединений, медиаторов, контролирующих пищеварительные и эк-докринные функции; к ним относятся ферменты, летучие жирные кислоты, витамины [2, 3].
Штаммы-пробиотики должны отвечать следующим основным требованиям:
обладать эффективной антагонистической активностью;
обладать способностью прикрепляться к эпителию кишечника;
не гидролизовать кишечную слизь, оказывающую протекторное действие;
не повреждать клетки кишечного эпителия;
не проявлять побочных эффектов даже при избыточных дозах;
обладать технологичностью, криорезистентностью, способностью выдерживать процедуры высушивания [4].
Доказанными считаются их конкурентное взаимодействие с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [5, 6], продукция антимикробных пептидов [7, 8], повышение продукции слизи [9].
Многочисленными исследованиями показана необходимость использования ассоциаций микроорганизмов разных видов в процессе создания бактериальных концентратов. Предпочтительным при создании пробиотиков является комбинирование различных родов антагонистически активных штаммов микроорганизмов [10,11], в этом случае они являются комменсалами (форма взаимоотношений между видами в природе, при которой один из участников живет за счет другого, не причиняя ему вреда [12]).
По сравнению с монокультурами микробные ассоциации способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализовать сложные органические соединения. Ассоциации микроорганизмов имеют повышенную способность к биотрансформации, повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества [13].
Анализ теоретических предпосылок создания пробиотической кормовой добавки показал, что наиболее перспективными для этой цели являются штаммы Lactobacilus acidophilus 43c и Lactococcus lactis 1704-5
[14].
Lactobacillus acidophilus 43c ВКПМ В-3235 - ацидофильная палочка, способная после культивирования вновь приживаться в кишечнике. Антагонистическое действие обусловлено продуцируемыми антибиотиками - ацидофилином и лактоцидином. Штамм выделен из молока. Антагонист бактерий кишечной группы. Lactobacillus в процессе жизнедеятельности вступают
в сложное взаимодействие с другими микроорганизмами, в результате чего подавляются гнилостные и гноеродные условно-патогенные микроорганизмы, в первую очередь род Proteus, а также возбудители острых кишечных инфекций. В процессе нормального метаболизма Lactobacillus способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин. Lactobacillus является вторым основным микробиологическим звеном формирования колонизационной резистентности открытых полостей организма-хозяина.
Lactococcus lactis 1704-5 ВКПМ В-3192 по культурально-морфологическим признакам - грамположи-тельные кокки, диплококки, цепочки. Колонии круглые, выпуклые, с ровным краем, блестящей поверхностью, белого цвета. Культуральные свойства: факультативный анаэроб, температура 32-35°С. Штамм выделен из молока, продуцент молочной кислоты, не является генетически модифицированным, относится к микроорганизмам, непатогенным для человека.
В качестве стандартной среды (СС) для глубинного культивирования бактерий-пробиотиков применяли жидкую среду, состоящую из цельного молока и воды при соотношении 1 : 1.
Питательные среды разливали во флаконы по 100, 200 см3, закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали в автоклаве вертикального типа при температуре (121 ± 1)°С в течение 15 мин. Стерильные среды засевали маточными монокультурами или ассоциацией молочнокислых бактерий, доза посевного материала составляла 1-2% от объема. Флаконы с инокулирован-ными средами помещали в термостат для культивирования при температуре 37-38°С на 36-48 ч. В качестве критерия эффективности глубинного культивирования на жидкой среде выбрали количество жизнеспособных клеток не менее 7,30 lg КОЕ/г.
К основным технологическим и пробиотическим свойствам штаммов относятся: продолжительность ферментации (время образования сгустка молока), активность кислотообразования (рН), титр жизнеспособных клеток в СС, антибиотикоустойчивость, а также устойчивость к действию соляной кислоты.
Антибиотикоустойчивость изучали на следующих представителях различных групп: пенициллина - ампициллин, аминогликозидов - гентамицин, макроли-дов - эритромицин, цефалоспоринов - цефазолин, а также к тетрациклину. Данный показатель оценивали в зависимости от зоны задержки роста в миллиметрах. Штаммы относили к резистентым при зоне задержки 0-5 мм, малочувствительным - 6-10 мм, чувствитель-
ным - 11-20 мм, высокочувствительным - более 20 мм
[15].
Резистентность штаммов МКМО к соляной кислоте желудочного сока в условиях in vitro определяли, применяя модельные растворы кислоты с концентрацией 0,4; 0,5; 0,6% [15].
Возможность совместного выращивания культур штаммов Lb. acidophilus 43c и L. lactis 1704-5 изучали, внося в питательную среду равное количество иноку-лята каждого из штаммов, определяя титры и изменение рН среды в течение процесса культивирования.
Антагонистическую активность ассоциации оценивали по задержке роста (в миллиметрах) тест-культур патогенных микроорганизмов Pseudomonas aero-genosa, Esherichia coli и Staphylococcus aureus [15].
Одним из важных свойств пробиотических штаммов является устойчивость в процессе производственного цикла при сохранении их жизнеспособности на всех его этапах, определяемая свойствами выбираемых штаммов и технологическими воздействиями.
Технологичность штаммов предполагает способность сохранять свои основные физиолого-биохими-ческие свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты должны обладать устойчивостью к заражению посторонней микрофлорой (это обеспечивается низкими значениями рН), иметь высокий выход продукта (количество жизнеспособных клеток). Технологические свойства исследованных штаммов (табл. 1) свидетельствуют, что они обладают достаточной технологичностью для промышленного производства пробиотика.
Таблица 1
Штамм Продолжительность ферментации, ч Активная кислотность, рН Количество жизнеспособных клеток в СС, lg КОЕ/см3
Lb. acidophilus 42 ± 5 4,0 7,55 ± 0,36
L. lactis 38 ± 4 3,8 7,82 ± 0,35
Результаты исследований пробиотических свойств штаммов, определяемые по антибиотикоустойчивости и резистентности к соляной кислоте, представлены в табл. 2.
Резистентность к соляной кислоте даже при ее максимальной концентрации (0,6%) свидетельствует, что Lb. Acidophilus и L. lactis устойчивы к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта, оказывающим неспецифическое бактерицидное действие на микроорганизмы-пробионты.
Установлено, что Lb. acidophilus проявил антибиотикоустойчивость ко всем видам, кроме эритромицина.
Таблица 2
Штамм Антибиотикоустойчивость Резистентность к соляной кислоте
Ампициллин Гентамицин Эритромицин Цефазолин Тетрациклин 0,4% 0,5% 0,6%
Lb. acidophilus + + 12 + + ++ ++ ++
L. lactis + 8 + + 6 ++ ++ ++
Примечание: + - штамм микроорганизма устойчив к воздействию антибиотика; 6, 8, 12 - зона задержки роста, мм; ++ - проявляет резистентность к соляной кислоте.
8 -| г 1
6 -I-----------------------------------------к 3
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
Время выращивания, ч
-♦-титр Lb. acidophilus -И-титрЬ. lactis -±-рН
L. lactis оказался малочувствительным к двум видам -гентамицину и тетрациклину. Таким образом, совместное использование штаммов Lb. acidophilus 43c и L. lactis 1704-5 обеспечит их эффективность при применении антибиотикотерапии.
Планируя создание ассоциированного пробиотика, исследовали динамику взаимоотношений между микроорганизмами, оценивая их штаммосовместимость. График зависимости концентрации клеток каждого из штаммов и рН среды от времени культивирования представлен на рисунке.
Полученные данные показывают, что изученные штаммы имеют различное время развития и достижения стационарной фазы роста, в которой клетки микроорганизмов наиболее устойчивы к факторам окружающей среды. Так, Lb. acidophilus достигает ее через 24 ч при получении титра 7,65 lg КОЕ/см3, а L. lactis - через 36 ч, титр 7,78 lg КОЕ/см3.
Скорость развития штаммов неодинакова, по-видимому, из-за различных требований культур к рН среды. Оптимум рН для L. lactis составляет 6,0-6,5, Lb. acidophilus - более кислотоустойчивый вид - интенсивно развивается при рН 5,0. Через 30 ч совместного культивирования он начинает преобладать, при одновременном замедлении развития (28-36 ч), а затем гибели после 36 ч. Через 48 ч совместного культивирования рН среды снижается ниже значения 4,0, ингибируя развитие штаммов, титр ниже 7,3 lg КОЕ/см3.
Таким образом, выполненные исследования позволили оценить технологический и пробиотический потенциал штаммов Lb. acidophilus и L. lactis, составить
их ассоциацию, определить оптимальные режимы ее получения: при совместном культивировании для достижения титра культур на уровне 7,4-7,6 lg КОЕ/см3 оптимальным является время культивирования 32-36 ч при рН среды 4,0-4,2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В. Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности. - М.: ДеЛи принт, 2008. - 336 с.
2. Урсова Н.И. Современные технологии в коррекции дисбактериозов у детей. - М., 2003. - С. 2-15.
3. Дисбактериоз кишечника: пути решения проблемы / Под ред. В.А. Алешкина. - М., 2004. - С. 1-9.
4. Сазыкин Ю.О., Орехов C.H., Чакалева И.И. Биотехнология / Под ред. А.В. Катлинского. - 3-е изд., стер. - М.: Издат. центр «Академия», 2008. - 256 с.
5. Hunter J.O. A review of the role of the gut microflora in irritable bowel syndrome and the effects of probiotics // Br. J. Nutr. -2002. - № 88. - Р. 67-72.
6. Lee Y.K. Quantitative approach in the study of adhesion of lactic acid bacteria to intestinal cells ant their competition with enterobacteria // Appl. Envir. Microbiol. - 2000. - № 66 (9). -Р. 3692-3697.
7. O’Sullivan D.J. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria // J. Ag. Food Chem. - 2001. - № 49. -Р. 1751-1760.
8. Greene J.D. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells // Appl. Envir. Microbiol. - 1994. - № 60. -Р. 4487-4494.
9. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora // Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - № 73. - Р. 410-414.
10. Сорокина Н.П. Бактериальные концентраты и их ротация // Переработка молока. - 2006. - № 2. - С. 19-21.
11. Перфильев Г.Д. Производство и применение бактериальных концентратов // Сыроделие и маслоделие. - 2006. - № 3. -С. 24-29.
12. Яркина Я.А. Бакконцентрат бифидобактерий и бактерий Lactobacilus casei // Молочная пром-сть. -2005. -№ 2. - С. 34-35.
13. Бондаренко В.М. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. клин. гастроэнтерол. - 2004. - № 3. -С. 83-87.
14. Хамитова Н.Р., Тимофеенко Т.И., Стукало А.С. Перспективные направления использования растительного сырья в производстве пробиотиков: Монография. - Краснодар: Издат. дом - Юг, 2010. - 116 с.
15. МУК 4.2.2602-10.4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационно-го доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. - М., 2010.
Поступила 27.04.12 г.
CREATION METHODS OF PRO-BIOTIC BACTERIA ASSOCIATION
N.R. KHAMITOVA T.I. TIMOFEENKO 2, V.S. YAKIMENKO2
1 “Biotroph" Ltd.,
a/b 183, Saint-Petersburg, 192288;ph.: (981) 891-95-67, e-mail: [email protected]
2 Kuban State Technological University,
2, Moskovskaya st., Krasnodar, 350072;ph.: (861) 275-24-93, e-mail: [email protected]
The methods of development of the combined pro-biotic preparation on the basis of strains of lactic microorganisms of Lactobacilus acidophilus and Lactococcus lactis is presented. Technological and pro-biotic properties of strains are revealed. Optimum modes of their joint cultivation are defined.
Key words: probiotics, association of microorganisms, pro-biotic properties, stability to antibiotics.
