CC BY
83
ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 616-092.4
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ БИОСПОРИНА, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА МИКРОКАПСУЛАХ
А.В. КОРОЧИНСКИЙ1 ИМ. ПРИВАЛОВ2 Рассматриваются фармакологические исследования
Э Ф СТЕПАНОВА А В СЕРГИЕНКО1 разработанного препарата: микрокапсул биоспорина с
и i л1пл1пгъ тъ » Vvnmimn ' аль-гинатом натрия и активированным углем,
И А. САВЕНКО Ю.А. 0ГуРЦ0В1 , модифицированных хитозаном. Исхледуется
Лятигорскшг. гофщрственноя фармацевтическая раздражающая активность, острая токсичность и академия 2 Пятигорский государственный гуманитарно- , Т/.
технологический уншерситетг e-mail: спец^меская активность препарата. Ключевые
a.v.korochinskii@mail.ru слова: ^^KancY]^ пр^тати^ биоспо-рин,
фармакологические исследования.
Введение. Вопросам микроэкологии кишечника в последние годы уделяется большое внимание врачей всех специальностей, так как 90% россиян страдают заболеваниями органов системы пищеварения, которые характеризуются хронизацией и рецидиви-рующим течением. Природные, техногенные, экстремальные факторы негативно воз-действуют на организм, его микрофлору и приводят к синдрому нарушений микроэко-логии пищеварительного тракта - дисбактериозам. Одним из наиболее перспективных средств дня лечения и профилактики дис-биотических состояний являются пробиотики [2, 3]. Они ингибируют рост патогенных микроорганизмов, обладают лакто- и бифидогенными свойствами, иммуномодули-рующей активностью, стимулируют ангиогенез, увеличивают регенераторную способ-ность тканей, нормализуют липидный и углеводный обмены в организме человека. Широкий спектр препаратов-пробиотиков, охватывающий основные формы мик-роэкологических нарушений, не позволяет решить проблему массовой коррекции дисбак-териозов. Основными причинами этого являются: ограниченная антагонистическая ак-тивность используемых в производстве пробиотиков штаммов, узкий спектр дисбиотиче-ской коррекции препаратов, низкая приживляемость в кишечнике и т. д. [3]. В этой связи перспективными представляются исследования по подбору опти-мальных форм выпуска пробиотиков и поиску соответствующих технологий. Все больший интерес проявляется к получению инкапсулированных форм микроорганизмов, что спо-собствует повышению стрессоустойчивости клеток в неблагоприятных условиях.
Целью работы явились фармакологические исследования разработанной ле-карственной формы биоспорина, основанной на принципах иммобилизации микрокапсулы биоспорина с альгинатом натрия и активированным углем, модифицирован-ной хитозаном. Материалы и методы. Фармакологические исследования микрокапсул биоспорина с альгинатом натрия и активированным углем, модифицированных хитозаном, включали изучение раздражаю-щей активности, острой токсичности и специфической активности препарата. Оценку раздражающего действия препарата in situ проводили тестом на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона, НЕТ - САМ test [1, 4]. Вещество тестиро-вали в 48 повторностях. Раздражающая активность in vivo исследовалась на переднем сегменте глаза 15 морских свинок. Острую токсичность рассматривали в экспериментах на мышах по методу Кер-бера [1, 4]. Специфическая активность препарата изучалась на экспериментальной модели дисбиоза кишечника у крыс, индуцированного комбинацией антимикробных препара-тов: ампициллин и метронидазол. Эксперименты проводили на 48 половозрелых бе-лых лабораторных крысах самцах линии Вистар (масса тела 200-250 г). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответ-ствии с требованиями «Правила проведения работ с использованием эксперименталь-ных животных» (Приложение к приказу М3 СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались в одинаковых условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания (комбикорм ПК-120-1. Россия). Результаты и обсуждение. При нанесении на хорион-аллантоисную оболочку куриного эмбриона иссле-дуемого препарата в чистом виде не отмечалось какого либо воздействия. Наблюда-лась ненарушенная прозрачная
тонкая оболочка с нормально функционирующей се-тью кровеносных сосудов и капилляров. Результаты, полученные в ходе эксперимента, позволяют отнести препарат к 1 классу веществ по степени раздражения in situ. Раздражающая активность in vivo оценивалась по степени отека и гиперемии пе-реднего сегмента глаза морских свинок. Время оценки составляло: 30 секунд, 2 минуты, 6 часов, 24 часа. Контролем служил второй глаз животного. Результаты раздражения конъ-юнктивы морских свинок регистрировали в баллах по 5-балльной шкале [1]. Отек на 30-й секунде составил 0,33±0,471 балла, гиперемия также 0,33±0,471 балла, итого в сумме 0,66±0,471 балла, что свидетельствует о слабом раздражающем действии. Через 2 минуты раздражающее действие составило: отек 1,0±0,0 балла и ги-перемия 1,0±0,0 балла, суммарный показатель равен 2±0,0 баллам, что также соответ-ствует слабому раздражающему действию. Через 6 часов и 24 часа у всех наблюдаемых животных отек и эритема отсутствовали. Это позволяет согласно классификации веществ по степени раздражения отне-сти исследуемый препарат к 1-му классу соединений, коэффициент раздражающего воздействия - 1,0±0,0. Острую токсичность определяли по оценке выживаемости мышей и по рассчи-танной среднесмертельной дозе. В течение первых 2 часов введения препаратов в до-зировке 5000 мг/кг (8х10ю КОЕ) не наблюдалось изменений со стороны психической деятельности животных. Снижения двигательной активности и потребления воды и пищи не происходило. Тонус скелетных мышц, реакция на тактильные, болевые, зву-ковые и световые раздражители была такая же, как и у интактной группы. К окончанию первых суток животные не отличались по внешнему виду, количе-ству и консистенции фекальных масс, частоте мочеиспускания и характеру поведения от животных интактной группы. При пероральном применении препарата в объемных дозах: 0,014 мл, 0,028 мл, 0,056 мл, 0,12 мл. гибели животных во всех группах не отмечалось. Результаты, полученные в ходе эксперимента по определению острой токсично-сти, позволяют отнести исследуемый препарат к малоопасным веществам (4 класс опасности) [1, 4].
При проведении фармакодинамического исследования определяли специфиче-скую активность препарата и побочные действия. Перед проведением экспериментов животные были разделены на 4 группы: (по 12 крыс в группе): интактная, группа негативного контроля, группа сравнения, группа, получавшая микрокапсулы биоспорина. Животным опытных групп ежедневно в одно и то же время per os в течение 3 дней вводили в количестве 15 мг ампициллин (ОАО «Органика», Россия) и 10 мг метронидазол (ОАО «Ирбитский химико-фармацевти-ческий завод», Россия), растворенного в дистиллированной воде, соответственно. За-тем крысам группы сравнения с 3-го дня в течение 6 дней вводили пробиотик - бакти-субтил (Сотекс, Россия). Оценка результатов проводится на основании следующих показателей:
□ характер стула;
□ аппетит (количество съеденной еды);
□ масса тела животных;
□ гистологическая картина срезов органов животных.
Под воздействием введенных антибиотиков у опытных животных отмечались следующие симптомы: полифекалия, понос, запор или их чередование, изменение консистенции стула, ухудшение аппетита, снижение веса. В табл. 1 представлены данные наблюдений за стулом животных каждой экспе-риментальной группы.
Таблица 1 Влияние препаратов на дисбиоз крыс, индуцированный антибиотиками
(характер стула), болюсы (на 1 животное)
1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 6 день 7 день 8 день
Интактная группа 27,5 25 28 28,75 27,75 25 27,5 25
Группа негативного контроля 25 33,75 жидк. жидк. жидк. жидк. жидк. жидк.
Бактисубтил 30 32,5 жидк. жидк. жидк. 25 28 26,72
Микрокапсулы био-спорина с альгина-том натрия и активированным углем 26,5 25 12 18,75 27,75 25 27,5 25
Как следует из представленных данных, лечение разработанным препаратом по-зволило устранить диспепсические явления уже через 45-50 часов. Под воздействием антибиотиков у всех групп животных наблюдалось резкое сни-жение аппетита (рис. 1).
Рис. 1. Динамика потребления пищи
В дальнейшем аппетит у животных, получавших пробиотики, восстанавливался полностью. Восстановление аппетита в группе животных, получавших исследуемый препарат, происходило интенсивнее. После введения антибактериальных препаратов на 2-3-й день исследования животные опытных групп теряли в весе до 25 г (рис. 2), в то же время животные интакт-ной группы
продолжали набирать массу тела.
Рис. 2. Динамика изменения массы тела животных
После введения пробиотических бактерий животные стали набирать вес. В группе, получавшей иммобилизированный биоспорин, снижение массы наблюдалось на 5,5±0,12%, затем масса монотонно возросла на 8,7±0,31% (р=0,05). После эвтаназии у экспериментальных животных оценивалось состояние же-лудка и кишечника. У животных группы негативного контроля желудок и кишечник вздуты, в ки-шечнике обнаружены вспененные желчные кислоты (пропотевшие через стенку ки-шечника). Внутренняя сторона плевры окрашена в желтый цвет. Выражены эритема слизистой толстой кишки, зернистость, отечность, появление геморрагий. В группе животных, получавших микрокапсулы биоспорина с альгинатом на-трия и активированным углем, модифицированные хитозаном, наблюдалась более благоприятная картина: в желудке обнаружена пища, небольшое вздутие, в кишечнике желчь, кишечник пуст. Слизистая толстой кишки не измена. Более быстрое восстановление веса и аппетита животных группы, получавшей исследуемый препарат, можно связать с нормализацией пищеварительных функций желудочно-кишечного тракта, более интенсивными процессами разрушения и выве-дения антибактериальных препаратов в результате использования пробиотиков. От каждой группы животных забирали желудок, тонкий и толстый кишечник , изучали их гистологические срезы. На рис. 3 представлены гистологические срезы желудка. На гистологических срезах желудка группы негативного контроля (рис. 3б) на-блюдаются значительные резкие изменения структурных и вазоцитарных взаимоот-ношений во всех отделах желудочно-кишечного тракта. Поверхностный однослойный эпителий полностью отсутствует. Дифференцировать отдельные железы не представ-ляется возможным. Из секреторных клеток, выполняющих просветы желудочных желез, определяются лишь единичные с размытыми контурами и мутной цитоплазмой. В группе животных, получавших бактисубтил, слизистая оболочка желудка за-метно повреждена, однако относительно группы негативного контроля повреждения менее выражены (рис. 3в) Просматриваются расширенные просветы желудочных же-лез. Участков полной десквамации слизистой (что наблюдается на рис. 3б) нет. Клетки, выполняющие железы, дифференцируются, хотя часть клеток содержит признаки дис-трофических и некротических изменений.
в) группа, получавшая бактисубтил г) группа, получавшая исследуемый препарат
Рис.3. Гистологические срезы желудка Структура желез слизистой оболочки желудка животных, леченных исследуе-мым препаратом, относительно сохранена (рис. 3г). Дифференцируются все виды же-лезистых секреторных клеток. Отдельные желудочные железы плотно прилегают друг к другу. Различимы желудочные ямки. Однако часть железистых клеток имеет при-знаки мутного набухания цитоплазмы, кариорексиса и кариолизиса. При большом увеличении обнаруживаются многочисленные митозы в эпителиоцитах шеек желез, что может говорить об активных регенераторных процессах, протекающих в среде сек-реторных клеток Затем был выполнен сравнительный анализ гистологических картин тонкого кишечника (рис. 4).
а) интактная группа б) группа негативного контроля
в) группа, получавшая бактисубтил г) группа, получавшая исследуемый препарат
Рис. 4. Гистологические срезы тонкого кишечника На срезах тонкого кишечника (рис. 4б) видны специфические гистологические изменения, характерные для дисбиоза. Архитектоника слизистой оболочки тонкого кишечника резко нарушена. Ворсинки слизистой полностью отсутствуют. Остатки крипт представляют бесструктурную некротизированную массу причудливых форм, которая отслаивается от мышечной пластинки по всему периметру. Клетки, выпол-нявшие крипты, не дифференцируются На гистологических срезах тонкой кишки животных группы, получавшей бак-тисубтил (рис. 4в), наблюдается умеренная степень повреждения собственной пла-стинки слизистой оболочки. Ворсинки укорочены и разделены искривленными дуга-ми, придавая слизистой оболочке вид извилистой поверхности клеток. Строма ин-фильтрирована плазматическими клетками, эозинофилами и лимфоцитами. увеличе-но и число тучных клеток, часть из них разрушена до уровня крипт. В группе животных, леченных исследуемыми микрокапсулами, отмечены не-значительные изменения (рис. 4г). Ворсинки слизистой оболочки расширены или раз-ветвлены, но не укорочены; наблюдается некоторое увеличение плотности клеток стромы. На заключительном этапе гистологических исследований рассматривались сре-зы толстого кишечника (рис. 5).
а) интактная группа б) группа негативного контроля
в) группа, получавшая бактисубтил г) группа, получавшая исследуемый препарат
Рис. 5. Гистологические срезы толстого кишечника Под действием вводимых антибиотиков в слизистой оболочке толстого кишеч-ника развился некроз по всему периметру среза толстой кишки, доходящий до мы-шечной пластинки. Часть некротизированных масс секвестрирована в просвет кишеч-ника . Клетки, выполнявшие выстилку крипт, не
дифференцируются (рис. 56). При применении бактисубтила поражение толстого кишечника значительно менее выражено, хотя признаки поверхностного некроза и истончение слизистой тол-стого кишечника еще заметны. Трубчатое строение желез сохранено. Здесь клетки дифференцируются по своей функции: кишечные, эпителиальные и бокаловидные (рис. 5в).
Наименьшее поражение слизистой толстого кишечника наблюдается в группе животных, получавших микрокапсулы биоспорина с альгинатом натрия и активированным углем. Трубчатое строение желез толстого кишечника сохранено на протяже-нии всей толщи слизистой оболочки за исключением поверхностных зон, где наблю-даются неглубокие слои некротизированных бесструктурных масс, слущивающихся в просвет кишечника. На срезе хорошо различимы клетки желез - бокаловидные и ки-шечные эпителиальные. При большом увеличении в данной группе наблюдается по-вышенное количество митозов, что может свидетельствовать в пользу активности ре-генераторных процессов (рис. 5г). Выводы. На экспериментальных моделях в доклинических исследованиях изучены ток-сичность, раздражающая активность и протективные характеристики разработанного пробиотического препарата, установлена его эффективность. Микрокапсулы биоспо-рина с альгинатом натрия и активированным углем, модифицированные хитозаном, отвечает всем современным требованиям, предъявляемым к пробиотикам: выполняют деконтаминацию и заселение биотопа нормальными симбионтами, безопасны и имеют экспериментально подтвержденный эффект.
Литература
1. Арзамасцев, Е.В. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изуче-нию новых фармакологических веществ / Е.В.Арзамасцев, Т.А. Гуськова, И.В. Березовская [и др.]. - М., 2005. - С. 41-54
2. Костюкевич, О. II. Современные представления о микробиоценозе кишечника: дис-бактериоз и его коррекция / О.П. Костюкевич // РМЖ. - 2007. 2176.www.mij.ni
3. Молохова, Е.И. Лекарственные препараты - пробиотики на российском фармацев-тическом рынке / Е.И. Молохова, В.Н. Тарасевич // Фармация. - 2004. - № 3. - С. 55-58.
4. Сидоров, К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических ве-ществ (Токсикология)/ К.К. Сидоров. - М. : Медицина, 1990. - 171 с.
PHARMACOLOGICAL STUDIES OF THE DOSAGE FORM OF BIOSPORINA IMMOBILIZED ON MICROCAPSULES
A V KOROCHINSKIY1E F STEPANOVA1 I M We consider the pharmacological studies of the
Pfflvuoviiuf. SERGIO, IA SAVENKO IU. ^;cap[:^fwWh,sssoz:Wiln''' and
ogurtsovi Pyatigorsk State Pharmaceutical investigate the irritating activity, acute toxicity and
Academy 2 Pyatigorsk State Humanities and specific activity of the drug. Key words:
Technology University e-mail: microcapsules, probiotics, biosporin, pharmaco-
a.v.korochinskii@mmLru logical studies.
