CC BY
32
УДК 616.932:616-074
А.Б.Мазрухо, А.И.Шелохович, Г.Д.Харабаджахян, ГЛ.Карбышев, А.Н.Терентьев, В.Д.Кругликов, Л.В.Григоренко, В.В.Агафонова, И.К.Савельева, Д.И.Симакова, О.Г.Сокиркина, О.Г.Булахова,
И.С.Егоренкова
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ НОВОЙ ЭЛЕКТИВНО-ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ (СЭДХ-М) ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ
ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»
Модернизирована ранее разработанная элективно-дифференциальная среда для культивирования V. cholerae. Показано, что модернизированная среда (СЭДХ-М) обладает необходимой чувствительностью и показателем прорастания. Рост на ней E. coli ингибировался полностью, а P vulgaris - в значительной степени. Среда имеет выраженные дифференцирующие свойства: оранжевые колонии холерного вибриона четко отличаются от колоний сопутствующей микрофлоры. В лабораторных испытаниях среда СЭДХ-М продемонстрировала некоторые преимущества перед референс средой TCBS при выделении V. cholerae из контаминированных фекалий.
Ключевые слова: холера, элективные питательные среды, элективная среда для выделения холерного вибриона - СЭДХ-М, лабораторные испытания.
A.B.Mazrukho, AJ.Shelokhovich, G.D.Harabadzhakhian, G.L.Karbyshev, A.N.Terentev,
V.D.Kruglikov, L.V.Grigorenko, V.V.Agaphonova, I.K.Saveleva, D.I.Simakova, O.G.Sokirkina,
O.G.Bulakhova, I.S.Egorenkova
Evaluation of Biological Properties of New Selective Differential Medium for Cholera Vibrios Isolation Based on the Results of Laboratory Trials
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute
Previously developed selective differential medium for V cholerae growth was modernized. The modernized medium called SDMV-M was shown to possess the required sensitivity and germination index. The growth of E. coli was entirely inhibited, that of P. vulgaris was inhibited considerably. The medium possessed good differentiating ability: orange V. cholerae colonies were clearly distinguished from concomitant microorganisms. In the laboratory trials SDMV-M demonstrated some advantages as regards V. cholerae isolation from contaminated faeces in comparison with the reference medium TCBS.
Key words: cholera, selective nutrient media, selective medium for V. cholerae isolation, laboratory trials.
В настоящее время предложены разнообразные селективные и элективные среды для выделения холерного вибриона от человека и из внешней среды. Лучшей среди них остается среда ТСВS, разработанная около 50 лет назад и принятая ВОЗ в качестве референтной [2]. Данная среда обладает хорошими ростовыми, ингибирующими и дифференцирующими свойствами, стабильностью физико-химических показателей и надежностью в работе в стационарных и полевых условиях. В Ростовском противочумном институте разработана элективная среда СЭДХ, которая действующими Методическими указаниями МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» была регламентирована для проведения мониторинга холерных вибрионов в объектах внешней среды и исследования материала от людей.
Однако технологическая модификация производства одного из элективных компонентов среды (препарата «Прогресс») привела к изменению его свойств и сделала непригодным для использования в составе среды. В связи с этим была разработана новая среда с улучшенными элективными свойствами, получившая название СЭДХ-М (модернизированная).
Модернизация среды произведена за счет введения других, ранее не использовавшихся селективных агентов. Данное сообщение представляет результаты лабораторных испытаний среды.
Целью исследований является определение основных биологических показателей элективнодифференциальной среды СЭДХ-М (чувствительность, показатель прорастания, скорость роста холерных колоний, ингибирующие и дифференцирующие свойства), а также оценка ее эффективности при исследовании испражнений от людей, искусственно контаминированных тест-штаммом холерного вибриона.
Материалы и методы
Испытания среды проводили в соответствии с утвержденной программой и действующими инструктивными материалами. Для испытаний представлено три серии сред, опыты проведены с трехкратной повторностью.
В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов, полученные из музея живых культур
PостНИПЧИ: Vibrio cholerae О1 P-l классический биовар - тест-штамм; V. cholerae О1 M-878 био-вар эльтор - тест-штамм; V. cholerae non О1 P-9741 - тест-штамм; V. cholerae O139 МО-45; V. cholerae O139 P-16064; V. cholerae O139 P-16131; V. cholerae O139 P-17918; V. cholerae O1 16 классический биовар; V.cholerae O1 569B классический биовар; V. cholerae O1 1а биовар эльтор; V. cholerae O1 И-33 биовар эльтор; V. cholerae O1 1 биовар эльтор; V. cholerae O1 P-5879 биовар эльтор; V. cholerae O1 P-14863 биовар эльтор; Esherichia coli 18 - тест-штамм; Proteus vulgaris HX 19 N222 - тест-штамм; V. alginolyticus 13076; V. parahaemolyticus 17094; V. mimicus 133534; Comamonas sp. P-6101; Plesiomonas sp. P-1035; Aeromonas sp. 16024; Pseudomonas aeruginosa 14; Klebsiella sp. 6; Salmonella typhi 1289; Shigella dysen-teriae 13; Enterococcus sp. 11.
Питательные среды
Опытная: CЭДX-M - элективно-дифференциальная среда для выделения холерных вибрионов.
Контрольные среды лабораторного приготовления: агар Мартена (рН 7,6) - неселективная среда для культивирования холерных вибрионов; XДC-агар (рН 7,8) - неселективная среда для культивирования и выделения холерных вибрионов [1]; CЭДX -элективно-дифференциальная среда PостНИПЧИ для выделения холерных вибрионов, заранее откон-тролированных на соответствие инструктивным требованиям. Контрольная коммерческая селективная среда TCBS - референтная среда ВОЗ, производства «Мерк» Германия [3].
Выращивание культур холерных вибрионов и приготовление их взвесей проводили согласно действующей инструкции. Штаммы микроорганизмов, не относящихся к вибрионам, инкубировали на соответствующих средах, их взвеси приготовляли в растворе хлорида натрия с помощью стандартного образца мутности ОCО 42-28-85-09П (2009).
Биологические показатели среды и критерии оценки
Для определения показателя чувствительности (наличие роста культуры при максимальном разведении взвеси клеток) производили высев трех тест-штаммов холерного вибриона из разведений культур (начальная концентрация клеток 109 м.к.) 10-6 и 10-7 в объеме 0,1 мл, учет производили в течение 18 ч. На чувствительной среде должен отмечаться специфический рост культуры в виде типичных колоний диаметром не менее 1,0-1,5 мм.
Показатель прорастания определяли по количественному росту колоний на чашках при высеве 102 и 10 м.к штаммов холерного вибриона. Cогласно действующим стандартам при посеве 102 м.к. должно вырастать не менее 30 типичных колоний холерных вибрионов (30 %) диаметром минимум 1-1,5 мм, 10 м.к. - единичные колонии. При этом популяция должна быть стабильной: из сотни колоний не должно быть более двух атипичных по морфологии.
Порость роста колоний тест-штаммов холер-
ного вибриона (посев 102 м.к.) оценивали по минимальному времени, в течение которого вибрионы образовывали типичные колонии диаметром не менее 1,0 мм.
Указанные показатели как опытной среды, так и сред сравнения изучались также еще на 11 музейных штаммах холерного вибриона.
Для выявления показателя ингибиции и дифференцирующих свойств среды производили одновременный посев на чашки контрольного штамма холерного вибриона V cholerae О1 М-878 биовара эльтор и микробов-ассоциантов E.coli 18 и P. vulgaris НХ 19 № 222. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Элективная питательная среда при посеве в объеме 0,1 мл смеси, содержащей холерный вибрион в концентрации 103 м.к./мл, а также кишечную палочку и протей - по 107 м.к./мл, должна обеспечивать рост холерного вибриона и полностью подавлять рост кишечной палочки. Допускается рост изолированных колоний указанного штамма протея. Должна наблюдаться четкая дифференциация представителей рода Vibrio от протея по морфологии и окраске колоний.
Для дополнительной характеристики ингибирующих и дифференцирующих свойств среды СЭДХ-М производились посевы указанного штамма холерного вибриона в той же дозе и сопутствующей смеси микроорганизмов-ассоциантов - кишечной палочки и протея, взятых в более высокой концентрации по сравнению с той, которая предусмотрена нормативными условиями испытаний. Ассоцианты высевались на чашку по 0,1 мл из пробирок с концентрациями 1010 м.к./мл. Помимо этого, способность среды СЭДХ-М выявлять холерные вибрионы проверялась при посеве испражнений здорового человека, разведенных до концентрации 10 МЕ мутности стандарта ОСО 42-28-85-09 П, что соответствует 0,93409 м.к./мл для микробов кишечной группы, и искусственно контаминированных культурой холерного вибриона V. cholerae О1 M-878 биовара эльтор до концентрации 103 м.к./мл. В этом случае высев 0,1 мл взвеси испражнений соответствовал посеву на пластинку среды 102 м.к. холерного вибриона.
Для проверки ингибирующих свойств среды СЭДХ-М по отношению к морфологически сходным с вибрионами микроорганизмам (комамонас, плезио-монас, аэромонас), некоторых галофильных вибрионов, псевдомонад, сальмонелл, клебсиелл, шигелл, протея, кишечной палочки и энтерококка производили их посев по 106 м.к. на чашку с параллельным высевом холерного вибриона в дозе 102 м.к. Результаты опыта учитывали после инкубации в термостате в течение 24 ч.
Результаты и обсуждение
Приготовленная среда СЭДХ-М представляет собой непрозрачную агаровую пластинку чернофиолетового цвета, рН (8,4±0,1). Микроорганизмы
Таблица 1
Показатели прорастания среды СЭДХ-М и сред сравнения для холерных вибрионов
Биовар холерных вибионов Кол-во штаммов Кол-во выросших колоний на средах при посеве 100 и 10 м.к. (соответственно числитель и знаменатель), М±т, Р - 0,05
CЭДX-M Агар Мартена XДC-агар CЭДX TCBS
Классический 3 31±3 40±4 39±4 47±3 38±2
4±1 6±1 3±1 5±1 3±1
Эль Тор 6 43±2 40±2 35±2 43±3 36±2
3±1 6±1 4±1 5±1 4±1
О139 4 38±2 48±1 38±1 40±2 41±1
3±1 4±1 3±1 4±1 3±1
Non O1 1 40±1 50±1 35±1 30±1 32±3
3±1 4±1 4±1 5±1 2±1
Примечание. В числе испытанных культур холерных вибрионов находились три тест-штамма.
рода Vibrio образуют на среде СЭДХ-М колонии оранжевого цвета, при рассматривании в стереомикроскоп с косым верхним освещением - оранжевые с темно-коричневым центром и узким ободком синеватой прозрачной периферии, гладкие, блестящие, выпуклые, при пробе иглой образуется короткий тяж («полувязкость»). Для колоний вибрионов на данной среде не характерно тускло-желтоватое свечение, жидковатая консистенция без тяжа, гомогенность без синеватого пояска периферии и темно-коричневого центра. Колонии оранжевых типичных холерных вибрионов хорошо агглютинируются соответствующими О-холерными сыворотками в реакции агглютинации на стекле. Микроскопически в материале из оранжевых колоний - типичные грам-отрицательные подвижные вибрионы.
Результаты, отражающие биологические показатели и эффективность выделения холерных вибрионов из различных смесей и субстратов на проверяемой среде СЭДХ-М и средах сравнения, представлены в табл. 1 и 2 .
Как видно из табл. 1, показатели прорастания СЭДХ-М и других сравниваемых сред по отношению к 14 испытанным штаммам холерных вибрионов, включая и три контрольных, соответствовали требуемой норме. Все испытанные среды (опытная
и контрольные) характеризовались достаточной чувствительностью в отношении всех взятых в работу штаммов: при посеве 10 м.к. вырастали единичные колонии холерного вибриона. Все колонии холерных вибрионов обладали морфологией, характерной для соответствующих сред: оранжевые, гладкие -на CЭДX-M, желтые, гладкие - на C^AX и TCBS, полупрозрачные и прозрачные, гладкие - на агаре Мартена и XДC-агаре.
Порость роста холерных вибрионов на среде C^flX-M, CЭДX и TCBS составила 14-16 ч, на среде Мартена и XДC-агаре - 12 ч, когда их колонии достигали 1,0 мм в диаметре и отличались типичной для соответствующих сред морфологией. Атипичных колоний не зарегистрировано.
В табл. 2 представлены данные, характеризующие ингибирующие и дифференцирующие свойства испытуемых сред, т.е. способность их к элективному выявлению холерного вибриона в присутствии микробов-ассоциантов. При посеве требуемых инструкцией смесей холерного вибриона (102 м.к.), кишечной палочки и протея (по 106 м.к.) на чашках со средой C^flX-M вырастало не менее 30 оранжевых колоний холерных вибрионов диаметром до 2,0 мм, рост ассоциантов подавлялся. Аналогичный результат был получен и на среде TCBS. На среде C^flX ингибиция
Таблица 2
Элективное выделение холерных вибрионов на среде СЭДХ-М и средах сравнения из искусственных смесей с E. coli и P. vulgaris
и с нативными испражнениями здорового человека
Cостав смеси и исходные концентрации микроорганизмов, м.к./мл
Кол-во микроорганизмов в 0,1 мл посева, м.к.
Pост колоний XB и другой микрофлоры через 14-16 ч на средах:
CЭДX-M Агар Мартена CЭДX TCBS
V. cholerae O1 M-878 биовар эльтор - 103
E. coli 18 - 107
P. vulgaris HX 19 № 222 - 107 V. cholerae O1 M-878 биовар эльтор - 103
E. coli 18 - 1010
Pr. vulgaris HX 19 № 222 - 1010
V. cholerae O1 M-878 биовар эльтор - 103
Испражнения, разведенные примерно до 109
102
10б
10б
102
109
109
102
108
40±2 оранжевых колоний XB*
42±3 оранжевых колонии ХВ 40-60 мелких черных колоний P. vulgaris
26±2 оранжевых колоний ХВ
Pост в виде газона
E. coli и P. vulgaris
Pост в виде газона
E. coli и P. vulgaris
Pост газоном кишечной флоры
2 желтые колонии XB в газоне роста
E. coli и P. vulgaris
Pост в виде газона
E. coli и P. vulgaris
1 желтая колония XB в газоне роста кишечной флоры
32±1 желтые колонии XB
1 желтая колония ХВ в газоне роста
P. vulgaris зеленого цвета
12±1 желтых колоний ХВ
*XB - холерный вибрион.
микробов-ассоциантов была слабой, что значительно затрудняло поиск колоний холерных вибрионов.
Увеличение посевной дозы кишечной палочки и протея до 109 м.к. при прежней дозе холерного вибриона несколько снижало ингибирующую активность среды СЭДХ-М - на чашке появлялось до 60 мелких черноватых колоний протея, которые, однако, не мешали росту, обнаружению и снятию иглой 40 оранжевых колоний холерных вибрионов. Для облегчения последней процедуры необходим стереомикроскоп с косым освещением. Кишечная палочка на данной среде ингибировалась полностью. Среда ТСВS при посевах столь высоких концентраций ассоциантов позволяла выявлять лишь единичные желтые колонии холерных вибрионов среди густого роста протея голубовато-зеленоватого цвета, т.е. по элективности была немного слабее опытной среды. Среда СЭДХ по этому свойству полностью уступала средам сЭДх-М и TCBS.
Сходные результаты получены и при посеве кон-таминированных тест-штаммом холерного вибриона испражнений здорового человека. В этом случае среда СЭДХ-М оказалась также несколько более эффективной, чем ТСВS. Среда СЭДХ, как и в предыдущем случае, была недостаточно элективной.
Среда СЭДХ-М подавляла рост V. parahаemo-\yticus, V. тШ1сш и значительно тормозила рост V. а^то1уНсш, при этом окраска колоний последнего была темно-бурой. Comamonas sp. и Plesiomonas sp. подавлялись полностью, Aeromonas sp. вырастал на среде в виде мелких колоний желтоватого цвета, которые легко можно было отличить от оранжевых колоний вибрионов. Псевдомонады, клебсиеллы, сальмонеллы, шигеллы и кишечная палочка на данной среде не росли. Протей прорастал в виде черных мелких колоний. ЕМегососсш sp. только при посеве весьма высоких концентраций микроба (109 м.к.), рос на среде СЭДХ-М в виде очень мелких сероватых колоний, легко отличимых от холерных вибрионов.
В результате проведенных лабораторных ис-
пытаний установлено, что испытуемая элективнодифференциальная среда СЭДХ-М по показателям чувствительности и прорастания, а также скорости роста колоний холерного вибриона соответствует требованиям Методических указаний МУ 3.3.2.212406 и не уступает контрольным средам: неселективным - агару Мартена и ХДС и селективной - референтной среде ВОЗ - TCBS, а по показателю инги-биции микробов-ассоциантов и дифференцирующему свойству несколько превосходит последнюю. Предполагается апробация среды СЭДХ-М в ходе мониторинга водных объектов внешней среды на наличие холерного вибриона.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мазрухо А.Б., Каминский Д.М., Телесманич Н.Р. Использование новых питательных сред на этапах подготовки сотрудников специализированных противоэпидемических бригад к работе в зонах чрезвычайных ситуаций. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2010; 3:75-80.
2. American Society for Microbiology. Manual of Clinical Microbiology. 4nd ed. 1985.
3. MERCK Microbiology Manual. Darmstadt; 1996. 405 p.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Mazrukho A.B., Kaminskii DM., Telesmanich N.R. [Application of new nutrient media at different stages of training of specialized anti-epidemic teams personnel for work in emergency situations zones]. Mediko-Biol. Socio-Psykhol. Probl. Bezop. Chrezv. Sit. 2010; 3: 75-80.
Authors:
Mazrukho A.B., Shelokhovich A.I., Harabadzhakhian G.D., Karbyshev G.L., Terent'ev A.N., Kruglikov V.D., Grigorenko L.V., Agaphonova V.V., Savel'eva I.K., Simakova D.I., Sokirkina O.G., Bulakhova O.G., Egorenkova I.S. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. M.Gor'kogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia. E-mail: plague@aaanet.ru
Об авторах:
Мазрухо А.Б., Шелохович А.И., Харабаджахян Г.Д., Карбышев Г.Л., Терентьев А.Н., Кругликов В.Д., Григоренко Л.В., Агафонова В.В., Савельева И.К., Симакова Д.И., Сокиркина О.Г., Булахова О.Г., Егоренкова И.С. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru
Поступила 09.03.11.
