CC BY
10
щимся в .стационарной фазе роста. Культуры, выращенные при 27 °0, занимают промежуточное положение.
Анализ данных табл. 2 показывает, что отмечается корреляция между' температурой выращивания и содержанием гидроксикислоты (С14-ОН), наличие которой вносит вклад в проявление пирогенных свойств грамотрицательных микроорганизмов [6].
Таким образом, увеличение содержания цикло-пропановых ЖК, снижение количества ненасыщенных кислот, а также индекса активности ЖК-пула в клетках У. рзеи<1ошЬегси1о515 с увеличением температуры культивирования свидетельствуют об адаптационном механизме метаболизма жирных кислот, обеспечивающем оптимальное структурно-функциональное состояние клеточных мембран к окружающим условиям существования микробов. Это характерно для большинства энтеробактерий [4].
Отмеченное увеличение содержания гидроксикислоты с возрастанием температуры культивирования и связь с пирогенными свойствами возбудителя нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке. ■ • . ’
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреев Л.В. // Докл. II Всесоюзн. конф. - М., 1982. - С. 75-106. - 2.'Варбанец Л.Д. // Микробиол. журн. -1994. - Т. 56, №3. - С. 76т-97. - 3. Васюре.нко З.П. Жирно-
кислотный состав патогенных микроорганизмов как таксономический признак: Автореф. дис........... д-ра мед. наук. - Киев,
1982. - 46 с. - 4. Васюренко З.П., Знаменский В.Л.// Микробиол. журн. - 1980. - Т. 42, № 4. - С. 462-469. - 5. Еременко Ю.Д., Смирнов С.Г., Чернядьев А.В. и др. // Биопрепараты. - 2002. - № 1. - С. 21-23; - 6. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К.//Биохимия. - 1993. - Т, 58, вып. 2. - С. 166— ¡81. - 7. Конюхов В.Ф., Мальцева Л. А., Лейман М.Д. и др. //ЖМЭИ. - 1986. -№ 10.-С. 25-27.- 8. Синяк К. М., Рудиченко В.Ф. //Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1980. -№ 1. -С. 62-72. - 9. Bligh E.G., Dyer W!J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - № 37. - P. 911-916. - 10. Carniel E. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2003. - Vol. 529.,- P. 3-12. - 11. Mayberry W.P. // J. Bacteriol. - 1981. - Vol. 147, N 2. - P. 373-381. -12. Sandhu' K.K. // Diss. PH: D. John'S University. - New York, 1981.-87 p. :
Yu.D.Yeremenko, A.A.Byvalov, E.V.Pimenov
■ Peculiarities of Fatty-Acid Composition • of Yersinia pseudotuberculosis Cells Grown on Solid Nutritional Medium at Different Temperatures
Microbiology Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov; Physiology Research Institute of the Komi SC,
Ural Division, RAS, Syktyvkar,
Investigations, into the effects of cultivation temperature’upon fatty acids content within Y. pseudotuberculosis cells showed that growth temperature of 37 °C, as compared to 10 °C, resulted in increased quantities of 17-carbon atoms cyclopropane acid and of 14-carbon-atoms hydroxy-acid as well as to reduced volumes of non-saturated fatty acids. .
■ ' . Поступила'01.12.04
УДК 616.932 - ;
Н.Д.Исаев, Ю.ВЛозовский, С.ПЗаднова, Н.И.Смирнова
ПОПУЛЯЦИОННАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА: КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ КОЛОНИЙ, ПОДВИЖНОСТИ, ТОКСИГЕННОСТИ И ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
При изучении популяционного состава 76 природных штаммов V. cholerae классического биовара было выявлено 20 штаммов, формирующих типичные прозрачные и атипичные мутные колонии. Среди последних выявили 5 штаммов, вариабельность морфологии которых коррелировала с изменением продукции экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности.
й функции генома Vibrio cholerae классического биовара позволит лучше понять механизм формирования патогенных клонов холерных вибрионов с новыми свойствами.'
Несмотря на глубокие исследования возбудителя холеры, многие свойства этого патогена остаются неизученными. В частности, до сих пор отсутствуют данные о возможности присутствия в гетерогенной популяции природных штаммов клонов с одновременным изменением ряда признаков, связанных с вирулентностью, а также о Механизме этого события. Бол¿е высокий уровень продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных вибрионов классического биовара по сравнению с вибрионами эльтор делают'их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуля-
Введение
. Холерные вибрионы классического биовара, возбудитель, по крайней мере 5-й и 6-й пандемий азиатской холеры, до сих пор сохранились в эндемичных по холере районах - Индии и Бангладеш [1, 4]. Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются, по-видимому, одним из природных резервуаров генов вирулентности. Об этом свидетельствует выделение в 1991-1994 гг. в Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры - ген ІсрА из острова патогенности УРІ-1 и ген ш/? из профага СТХф [4, 12]. В этой связи исследование структуры
ции генной активности in vitro.
Цель работы - изучение популяционного состава природных штаммов холерных вибрионов классического биовара для выявления клонов с одновременным изменением нескольких свойств: морфологических, токсигенных, ферментативных, а также подвижности.
Материалы и методы
В работе использованы 76 природных штаммов V. cholerae классического биовара (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб», Саратов). В качестве питательных сред применяли бульон и агар Хоттингера (pH 7,2), LB-бульон и агар, а также агар, приготовленный на основе перевара сердечной мышцы. Морфологию изолированных колоний определяли на агаре, изготовленном из перевара сердечной мышцы. Подвижность определяли на полужидком 0,5 % LB агаре. РПИГ ставили по методу M;G.Bramucci, R.K.Holmes модифицированному И.А.Шагиняном, Б.М.Маракушей [3]. Продукцию растворимой гемагглютинин/протеазы (НАР) оценивали путем посева культур на агар, содержащий 10 % обезжиренного молока [6].
Белковый спектр клеток определяли, используя электрофорез в полиакриламидном геле по U.K.La-emmli [10]. Окрашивание полисахарида, разделенного SDS-ПААГ электрофорезом, ионами серебра проводили согласно P.I.Hitchcock [8]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно методу K.Hoshino et al. [9].
Результаты и обсуждение
Изучение морфологии колоний холерных вибрионов на плотной среде наблюдали многие исследователи [2]. В посевах, наряду с типичными прозрачными (П) колониями, часто появляются нетипичные мутные (М), морфология которых не была связана с изменением биосинтеза 01-антигена, поскольку оба типа колоний агглютинировались в равной мере диагностической холерной О-сывороткой. Существование различий в морфологии колоний могло быть связано с изменением биосинтеза поверхностных структур клетки, включая белки внешней мембраны [6] и экзополисахаридный слой, недавно обнаруженный у холерных вибрионов эльтор [13]. Более того, можно также допустить, что появление клонов с атипичной морфологией могло быть следствием избирательной активности набора различных генов, в том числе и генов вирулентности. Для подтверждения этих предположений нами был изучен популяционный состав 76 штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных на территории Пакистана и Индии в 1942-1969 гг. и хранящихся в Государственной коллекции патогенных, бактерий «Микроб» в лиофилизированном состоянии. .
На первом этапе работы после рассева каждого штамма на плотной среде (на 2 чашках с агаром из сердечной мышцы) оценивали морфологию изолированных колоний. В результате обнаружено две группы штаммов, в первую из которых входили 56 (что составило 73,6 %), характеризующихся одно-
родным популяционным составом относительно морфологических свойств. Вторая группа представлена 20 штаммами (26,4 %), в популяции ¡которых обнаружены как типичные П-колонии, так и атипичные М-колонии. Одной из возможных причин появления атипичных, колоний может быть продукция ими экзополисахаридного слоя и (или) белков внешней мембраны. Основанием для этого предположения служат данные о том, что у описанного 11.Ртке1-БСет е? а1. [6] штамма V. ско1егае 3083 биовара Огава мутность колоний была связана с присутствием не только дополнительного белка с молекулярной массой 49 кДа, но и с измененным биосинтезом липопо-лисахарида. Для получения данных, подтверждающих эту гипотезу, было проведено сравнительное изучение поверхностных свойств П- и М-колоний ряда штаммов с использованием БОБ-ПААТ-электрофореза. Оказалось, что среди 5 произвольно выбранных из второй группы штаммов у 3 (26, 2 Огава Саху, 9361) М- и П-колонии имели практически идентичный белковый профиль. Лишь у двух штаммов В1307 и Дакка35 мутность колоний коррелировала с появлением белка Отри размером . 38 кДа, который обычно составляет 10 % от всей клеточной поверхности, (рис. 1). Взятые в качестве контроля штаммы 104/63 и В5 3-5, как образующие только мутные колонии, также не отличались друг от друга по белковому спектру (рис. 1, дорожки 5,6, 9, 10).
При последующем окрашивании разделенных электрофорезом поверхностных структур ионами серебра на поверхности М-колоний исследуемых штаммов V. сНо1егае классического биовара впервые обнаружено присутствие четко выраженного экзополисахаридного слоя, который образовывал мощную нижнюю зону (рис. 2, дорожки 2, 4, 5, 6, 8, 9,10,11,14).
До сих пор считали, что лишь у холерных вибрионов биовара эльтор могут появляться атипичные по морфологии клетки, продуцирующие экзополисахарид, биосинтез которого кодируют хромосомные гены, обозначенные vps [11]. Выявление нами экзополисахаридного слоя у М-колоний холерных вибрионов классического биовара послужило ука-
150
їшттШ.
>
ШР
t OmpT 'OmpU
кОа М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
• I
Рис. 1. Электрофореграмма общей белковой фракции штаммов V. сИо1егае классического биовара (10 % ПААГ+803). Здесь и на рис. 2: П - прозрачные, М - мутные колонии:
1 - V: сИокгае 26 (П); 2 - V. сЬо1егае 26 (М); 3-2 Огава Саху (П); 4-2 Огава Саху (М); 5 - В-53-5 (М); 6 - В-53-5 (М); 7 - В1307 (П);
8 - В1307 (М); 9- 104/63 (М); 10 - 104/63 (М); / / - 9361 (М);
12 - 9361 (П); 13 - Дакка35 (М); 14 -г Дакка35 (П)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Рис. 2. Окрашенные серебром-10 % ПААГ+503 гели для выявления экзополисахаридного слоя:
1 - V. с!го1егае Дакка35 (П); 2 - Дакка35 (М); 3 - 9361 (П);
4-9361 (М); 5- 104/63 (М); б- 104/63(М); 7-В-1307 (П); ' ■
8 - В1307 (М); 9 - В-53-5 (М); 10 - В-53-5 (М); 11- 26 (М);
12 - 26 (П); 13 - 2 Огава Саху (П); 14- 2 Огава Саху (М)
занием для определения наличия в хромосоме вибрионов этого биовара генов vps.
ПЦР-тестирование хромосомной ДНК П- и М-колоний двух штаммов Дакка3.5 и 9361 с использованием специфического праймера (ур5-1: ААвА АОААОТОАТСОАТАТТСОТСА, урз-2: АТСАСО . СОСТТГСТТСАТСТ) показало, что в бактериальном геноме изученных вибрионов действительно, содержится участок ДНК, идентичный фрагменту гена уря. Присутствие структурного гена урх в хромосомах обоих типов колоний позволяет говорить, что различия в их морфологии обусловлены, по-видимому, отсутствием экспрессии гена vps у П-колоний.
Поскольку известные глобальные регуляторные системы у возбудителя холеры (ЮлЯ/Б, гсрР/Н, гохТ и 1ихд/карК), как правило, контролируют экспрессию более 20 различных структурных генов [7, 14], следует полагать, что изогенные П- и М-клоны могут отличаться друг от друга и по другим свойствам. Для доказательства справедливости этого предположения 20 штаммов были проверены на продукцию ими ключевых и дополнительных факторов патогенности: холерного токсина, токсин-корегулиру-емых пилей адгезии, биосинтез растворимой ге-магглютинин/протеазы (РГ/П), а также на подвиж-
Фенотипические свойства прозрачных (П) и мутных (М) колоний
ность. Кроме того, были рпределены их питательные потребности. Действительно, среди 20 исследованных штаммов выявлено 5 (9361, В1307, 2 Огава Саху, 26, Дакка35), у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась, изменением продукции некоторых факторов патогенности (таблица).
Следует особо отметить, что М-колонии чаще всего были более подвижны и имели высокий уровень продукции РГ/П. по сравнению с П-колониями. Наибольший интерес представляют П- и М-колонии штаммов 9361 и Дакка35, которые четко отличаются друг от друга по 4 свойствам: продукции экзополисахарида, холерного токсина, РГ/П, а также подвижности. Тицичные прозрачные колонии не имели экзополисахарида,, были нетоксигенны и продуцировали незначительные количества РГ/П, тогда как для М-колоний характерна альтернативная экспрессия указанных факторов патогенности - наличие экзополисахарида, отсутствие продукции токсина, высокий уровень биосинтеза РГ/П и значительная подвижность (таблица).
Таким образом, в результате анализа популяционного состава 76 штаммов холерного вибриона классического биовара мы обнаружили 2 штамма (Дакка35 и 9361), особенность которых заключалась в формировании ими двух колоний с альтернативной экспрессией 4, генов, включая и основные гены вирулентности. Пока не ясно, насколько общим является этот феномен, поскольку из 76 штаммов V/-Ьпо сИокгае классического биовара мы.обнаружили с указанным свойством только 2 штамма, что составляет 2,6 %. Тем не менее можно утверждать, что в популяции некоторых штаммов холерных классических вибрионов присутствуют клоны, у которых' изменение морфологии колоний коррелирует с изменением важнейших свойств, связанных с вирулентностью. Полученные данные расширяют наши представления о механизмах регуляции экспрессии генов у возбудителя и позволяют предполагать о наличии нового глобального переключателя генной активности, механизм действия которого предстоит изучить.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1531.2003.4) -и гранта РФФИ №03-04-48438.
штаммов холерного вибриона классического биовара
. / ’ . Фенотип
Штамм Место выделения Год выделения Серовар Морфология Продукция токсина по данным РПИГ, мм* Подвижность, мм** Продукция протеази, мм*** Питат. потребности
9361 Восточный 1969 Инаба П. , 3. 0 0 Прототроф
Пакистан ' М .0 ю 5
В-1307 . Пакистан 1964 Огава .п 1 3 6 Прототроф
м 0 . 10 , 3
2 Огава Саху . Н.И. Н.И. Огава м. 0 5 . 5 Прототроф
п . ,0 10. 1
26 , - ни. Н.И. . Н.И... п. о ; 7 4 . Прототроф
м ,2 ; 7 .4
Дакка 35 Пакистан 1958 Огава. - п 5 2 2 ‘ Прототроф
м 0 ■12 4
Примечание. * ширина зоны иммунного гемолиза; ** радиус макроколоний; *'** величина зоны просветления; Н.И. - не известно.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Бароян О.В. Холера Эль-Тор. - М: «Медицина», 1971,- 2. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. - Ростов н/Д, 1981. - 3. Шагинян И.А., Мара-куша Б.И. // ЖМЭИ. - 1983. - № 7. - С. 92-96. - 4. Balak-rish G.N. et al. II J. Clin. Microbiol. - 2002. - P. 3296-3299. -5. Faruque S.М., Albert М., Mekalanos J.J.//Microbiol. Mol. Rev. - 1998. - Vol. 62. - P. 1301-1314. - 6. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein М., Chang Y. et al. II Infect. Immun. - 1992. - Vol. 60. - P. 472^178. - 7. Hase CiC., Barquera B. // Biochem. Biophys. Acta. - 2001. - Vol. 1505. -P. 169-178. - 8. Hitchcock P.I., Brown T.M.//J. Bacteriol.-
1983,- Vol. 154. - P: 269-277. - 9.Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. II FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1998. - Vol. 20. - P. 201-207. - 10. Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - 11. Rashid M.H. et al. II FEMS Microbiol. Lett. - 2004. - Vol. 230, N 1. - P. 105-113.- 12. Suraia Nusrin et al. II J. Clin. Microbiol. - 2004. -P. 5854-5856. - 13. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. .- Vol. 96. - P. 4028^1033. -
14. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 3129-3134.
N.D.Issayev, Yu.V.Lozovsky, S.P.Zadnova, N.I.Smirnova
Populational Heterogeneity of Natural Vibrio cholerae Strains of Classical Biovariant: Coordinated Changes, in Colony Morphology, Motility, Toxigenicity, : and Enzymatic Characteristics
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Analysis of populational composition of 76 natural V. cholerae strains classical biovar, permitted the detection of 20 strains capable of forming typical transparent and atypical opaque colonies. The latter group contained 5 vibrio strains whose morphologic variability correlated with the altered properties of motility and the modified production of exopolysaccharide, cholera toxin and soluble hemagglutinin/protease.
Поступила 18.03.05
УДК 616.932(571)
К.С.Нефедов, А.В.Осин, Н.И.Смирнова
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПАНДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ НА ТЕРРИТОРИИ ЮГО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ
5- ' ' ' „ ) I
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов \
Посредством ПЦР-тестирования 20 генов, входящих в состав мобильных генетических элементов (профаги СТХф и КБ 1 (р, острова патогешгости УР1-1 и УР1-2, острова пандемичности УБР-1 и У8Р-2, остров персистен-ции), а также коровой части хромосомы (ЬарА, юхЯ, пхА, а»/?5), получены генные «портреты» 62 штаммов, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии. 70 % клинических штаммов характеризуются высоким уровнем стабильного наследования генов вирулентности, 8,7 % были лишены профага СТХ, либо его гена МхА. Вирулентных штаммов, утративших лишь ген 1срА, было 3,5 %. Нестабильность'других МГЭ с генами вирулентности колебалось от 1,0% (для Я81ф) до 12,3 % (для У8Р-1). В целом клинические штаммы, выделенные на территории разных стран, в 30 % случаев лишены какого-либо из тестируемых генов, связанных с вирулентностью. Эти данные свидетельствуют о том, что популяция штаммов, выделенная от инфицированных людей, генетически неоднородна.
Введение
Изучение закономерностей эволюционных преобразований возбудителя холеры эльтор свидетельствует о том, что в их основе лежит горизонтальный перенос чужеродных генных блоков, размещенных на мобильных генетических элементах или МГЭ (профагах, островах пандемичности, пер-систенции), полученных этим патогеном от неизвестных доноров [5]. Внедрение указанных блоков генов в коровую часть обеих хромосом обеспечило появление вирулентных клонов не только с пандемическим потенциалом, но и наделенных способностью выживать как в инфицированном макроорганизме, так и в окружающей внешней среде. Более того, присутствие на малой хромосоме интег-ронного острова позволяет, по-видимому, этому возбудителю захватывать полезные для себя гены с помощью описанных ранее генетических механизмов [8].
Высокий уровень пластичности генома возбудителя 7-й пандемии холеры, обусловленный наличием в нем разных по структуре и функции МГЭ,
определяет генетическое разнообразие генома,этого патогенного микроба. Однако, несмотря на принятые в последнее время меры по расширению, исследований в этом направлении [3], пока отсутствует полная информация о геномных вариациях этого патогена, которая весьма необходима как для адекватного мониторинга за этим патогеном с целью усовершенствования эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями, так и для совершенствования диагностикумов и вакцин.
Поскольку вторжение холеры эльтор во многие государства началось с азиатского континента, мы сочли необходимым провести анализ геномных вариаций V. ско1егае, выделенных на территории Юго-Восточной Азии, тем более, что многие страны из этого региона являются пограничными с Территорией России.
Цель работы - оценить уровень генетического разнообразия штаммов V. с1го1егае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии, с помощью ПЦР-тестирования 20 различных генов, входящих в состав МГЭ и коровой части хромосом.
