CC BY
20
УДК 616.932:576.8.097.21
С.П.Заднова, Л.Ф.Ливанова, Ю.В.Лозовский, Н.И.Смирнова
ВЫЯВЛЕНИЕ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА КЛОНОВ С РАЗЛИЧНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ
И ИХ ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
При изучении популяционного состава 41 природного штамма Vibrio cholerae эльтор биовара получены новые данные о популяционной гетерогенности природных штаммов. Обнаружено 12 штаммов, формирующих типичные прозрачные и атипичные мутные колонии. Среди последних выявлено 3 штамма, вариабельность морфологии которых коррелировала с изменением продукции экзополисахарида, холерного токсина, гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности. Одним из внешних сигналов, вызывающих координированное переключение продукции указанных факторов патогенности и персистенции является щелочная (рН 9,0) реакция среды. Возможно, переключение «прозрачные-мутные» варианты относится к одной из форм фазовых вариаций и необходимо V. cholerae для выживания в изменяющихся условиях внешней среды.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, гетерогенная популяция, координированное переключение экспрессии генов вирулентности и персистентности.
Vibrio cholerae - возбудитель холеры, тяжелого диарейного заболевания, относится к группе патогенных бактерий, которые в определенных условиях способны существовать не только в организме хозяина (человек), но и вне его - в воде открытых водоемов. Пребывание в таких разных экологических нишах приводит к появлению фенотипически и генотипически измененных форм. В настоящее время накоплен значительный фактический материал, свидетельствующий о том, что изменчивости подвергаются все основные фенотипические признаки холерного вибриона (морфология колоний, серологические, биохимические, антигенные и другие свойства) [1, 3, 6]. Появление измененных вариантов V. cholerae затрудняет идентификацию возбудителя. Фенотипическая изменчивость может быть следствием различной экспрессии генов патогенности и персистенции. В связи с этим большой интерес вызывает анализ вариантов, отличающихся от типичных форм одновременно по нескольким фенотипическим свойствам. Появление таких клонов может быть связано с согласованным изменением экспрессии ряда генов, что является одним из важных механизмов адаптации этого патогена к меняющимся условиям среды обитания.
В связи с вышеизложенным цель нашей работы состояла в выявлении штаммов V. cholerae, имеющих в популяции клоны с измененными морфологическими свойствами, и их фенотипический анализ.
Материалы и методы
В работе был использован 41 штамм V. cholerae биовара эльтор и 4 штамма V. cholerae классического биовара, полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов).
При определении подвижности клеток (Mot)
учитывали зону распространения колонии в мм у подвижных штаммов или отсутствие таковой у неподвижных при культивировании на полужидком 0,6 % LB-агаре. Продукцию растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар) определяли путем посева культур на агар, содержащий 10 % обезжиренного молока, гемолитическую активность (Hly) - с использованием сред, содержащих эритроциты барана. Продукцию холерного токсина (СТ) определяли иммуноферментным методом GM1 ELISA [15] после выращивания холерных вибрионов классического биовара в LB бульоне (рН 7,2) при 30 °С на круговой качалке, а штаммов V. cholerae эльтор биовара в AKI бульоне при 37 °С по схеме [12].
Для определения синтеза белков проводили электрофорез по методу U.K.Laemmli [13]. Для выявления экзополисахаридов гелевую пластину после проведения электрофореза окрашивали раствором, содержащим 20 % азотнокислого серебра, и проявляли в растворе с добавлением 0,05 % формалина [11, 13]. Токсигенность культур определяли по методу, описанному S.N.De и D.N.Chattergee [4]. Формирование биопленки определяли, выращивая культуру в LB бульоне в полистироловых плашках (объем 200 мкл) [14].
Результаты и обсуждение
В ранее проведенной работе при изучении популяционного состава 76 природных штаммов V. cholerae классического биовара (возбудителя 5-й и 6-й пандемий азиатской холеры) было выявлено 20 штаммов, формирующих типичные прозрачные или Т (от англ. translucent) и атипичные мутные или O (от англ. opaque) колонии. Поскольку морфологические изменения могут сопровождаться изменением
Рис. 1. Морфология колоний штаммов V. cholerae эльтор биовара:
1-2 - M-1085 эльтор биовара; 3-4 - М-132б эльтор биовара;
5-б - C-418 эльтор биовара; 7-8 - 93б1 классического биовара (контроль). Четные номера - варианты, формирующие прозрачные колонии; нечетные - мутные колонии
других признаков, включая и свойства, определяющие вирулентность популяции, у изогенных вариантов данных штаммов была изучена продукция ряда факторов патогенности и персистенции. При этом впервые было выявлено 5 штаммов, вариабельность морфологии которых коррелировала с изменением продукции экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности [2]. Для выявления штаммов V. cholerae эльтор
биовара (возбудителя 7-й пандемии холеры), также содержащих клоны с одновременным изменением продукции нескольких факторов патогенности и пер-систенции, была изучена коллекция из 41 штамма, выделенных в разное время и на различных территориях России и стран зарубежья. В результате морфологического анализа выявлено 12 штаммов (или 30 % от числа изученных), в популяции которых, наряду с Т клонами, были обнаружены O варианты (рис. 1). При этом у 7 штаммов вариабельность морфологи колоний сопровождалась изменением продукции 2-4 факторов патогенности. Особое внимание привлекли штаммы V. cholerae М-132б, М-1085 и C-418, содержащие варианты, которые отличались друг от друга одновременно по четырем признакам. Т варианты синтезировали меньшее количество CT, но больше Hly, Нар и были более подвижны, чем О варианты (таблица). Фенотип Т клонов был обозначен как Т Tох+Hly++Hap++Mot++, а О вариантов - как O Tох++Hly+Hap+Mot+. Полученные нами результаты относительно синтеза CT и гемолизина у О вариантов эльтор вибрионов соответствовали данным литературы [7]. В то же время сведения о продукции Нар и подвижности у О вариантов эльтор вибрионов представлены нами впервые.
При сравнительном анализе Т и О вариантов холерных вибрионов разных биоваров было выявлено, что Т варианты классических вибрионов в отличие от Т вариантов холерных эльтор вибрионов были более токсигенны, продуцировали незначительное количество Нар и были менее подвижны (Т Tох++Hар+Mot+), чем О варианты, фенотип кото-
Фенотипические свойства двух морфологически различных вариантов V. ско1втае эльтор и классического биоваров
Штаммы V. cholerae Фенотип
Продукция CT, мкг/мл Продукция гемолизина, мм* Подвижность, мм** Продукция Hap, мм*** Морфология колоний
Холерные вибрионы биовара эльтор
М-1085 0,01±0,00б 3,0±0,4 5,0±0,5 5,0±0,5 T
0,17±0,005 1,0±0,4 2,0±0,3 3,0±0,5 O
C-418 0,02±0,005 3,0±0,2 10,0±0,4 3,0±0,3 T
0,0б±0,02 1,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,4 O
М-132б 0,02±0,005 4,0±0,5 10,0±0,5 3,0±0,2 T
1,1±0,05 2,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,б О
Холерные вибрионы классического биовара
Дакка 35 13,0±1,0 0,0 2,0±0,2 2,0±0,5 T
0,03±0,02 0,0 8,0±0,5 б,0±0,5 О
93б1 2,8±0,5 0,0 5,0±0,3 1,0±0,б T
0,01±0,01 0,0 15,0±0,5 5,0±0,7 О
B-1307 3,0±0,5 0,0 3,0±0,5 3,0±0,2 T
0,02±0,01 0,0 10,0±0,5 б,0±0,4 О
49520 8,0±0,5 0,0 0,0 2,0±0,5 T
0,02±0,004 0,0 1,0±0,2 3,0±0,5 О
Примечания: * - в мм дана ширина зоны гемолиза; ** - в мм представлен радиус распространения макроколонии в полужидком агаре; ** - в мм дана зона просветления на агаре с 10 % молоком. Т - прозрачные, О - мутные колонии.
рых был О Тох+Нар++Мо^ (таблица). Гемолизин, как известно, вибрионы классического биовара не продуцируют.
Обнаруженный обратный характер связи между морфологией колоний и продукцией СТ, Нар, а также подвижностью у холерных вибрионов двух био-варов, возможно, является следствием различной регуляции экспрессии данных факторов патогенности у V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor [5, 9].
При определении токсигенности двух изоген-ных вариантов штаммов эльтор биовара (V. cholerae М-1085 и 1326) на модели лабораторных животных обнаружено, что Т и О клоны были токсигенны и обладали выраженным холерогенным эффектом, вызывая сильное растяжение и истончение стенок кишечника и накопление значительного количества жидкости внутри кишечника. Полученные нами данные не согласуются с данными литературы. Так, О варианты штамма V. cholerae 3083 Огава не отличались по токсигенности от Т клонов, V. cholerae С6709 обладали сниженной токсигенностью, в тоже время О варианты штамма V. cholerae С6707 так же, как и в нашем случае, были более токсигенными, чем Т колонии [7]. При сравнительном изучении токсигенности Т и О вариантов классического и эльтор вибрионов обнаружено, что изученные О варианты классического биовара были атоксигенными в отличие от Т клонов.
Присутствие в природных популяциях штаммов V. cholerae как классического, так и эльтор биовара О клонов ставит вопрос о том, какие клеточные структуры определяют непрозрачную морфологию колоний? Одной из возможных причин появления атипичных по морфологии колоний холерного вибриона может быть продукция белков внешней мембраны и/или экзополисахаридного слоя, кодируемого генами vps (от англ. Vibrio polysaccharide synthesis) [7, 17]. При изучении Т и О клонов штаммов классического био-вара нами не выявлено различий по составу белков внешней мембраны, но впервые обнаружен экзопо-лисахаридный слой (EPS) на поверхности клеток О вариантов [2]. При сравнительном анализе белкового спектра изогенных вариантов штаммов V. cholerae эльтор биовара нами также не обнаружено различий по составу белков внешней мембраны. В то же время при проведении гель-электрофореза и последующем окрашивании гелевых пластин ионами серебра у O вариантов эльтор вибрионов так же, как и у классических вибрионов, обнаружено большее количество экзополисахарида, который выявлялся в нижней части электрофореграммы (рис. 2). Полученные экспериментальные данные дают основание предположить, что различия в морфологии колоний у изоген-ных вариантов обусловлены слабой экспрессией vps генов у T-клонов.
Механизм появления мутных О колоний, связанный с продукцией капсульного полисахарида, выполняющего защитную функцию, подробно изучен у родственных видов V. parahaemolyticus и V. vulnificus. Переключение «мутные-прозрачные» варианты у
Рис. 2. Выявление экзополисахарида в штаммах V ско1егае эльтор биовара (окраска азотнокислым серебром):
1 - О Тох^Шу+Нар+Мо^ вариант М-1326; 2 - Т Тох+Шу+^Нар+^Мо^ вариант М-1326; 3 - О Тох++Шу+Нар+Мо^ вариант С-418;
4 - Т Тох+Шу+^Нар+^Мо^ вариант С-418; 5 - Т Тох+Н1у++Нар++Мо^ вариант М-1085; 6 - О Тох++Hly+Hap+Mot+ вариант М-1085;
7—8 (контроль) соответственно О Тох+Нар++Mot++ и Т Тох++Нар+Mot+ клоны V ско1егае Дакка 35 классического биовара
данных микроорганизмов классифицируется как фазовые вариации. При изучении механизма фазовых вариаций было установлено влияние условий внешней среды (температуры, аэрации, времени инкубации), глобального регулятора сигма-фактора RpoS, фосфатазы. Обнаружены позитивный и негативный регуляторы продукции капсульного полисахарида [8, 10]. У V. ско1егае также обнаружены фазовые вариации - «гладкие-ругозные». Появление ругоз-ных колоний связано с продукцией на поверхности клеток значительного количества экзополисахарида. Наличие дополнительного экзополисахаридного слоя обеспечивает адаптивные преимущества клеткам и защищает их от повреждающих факторов внешней среды (хлор, кислый рН, ультрафиолетовое излучение, осмотический и оксидативный стресс, действие сывороток и комплемента), уничтожения простейшими, инфицирования фагами, а также повышает способность к формированию биопленки. Как известно, в составе биопленки вирулентные клоны V. ско!егае способны к длительной персистенции во внешней среде [16].
Для выяснения функциональной роли EPS, обнаруженного на поверхности О клонов классических и эльтор вибрионов, была изучена способность изогенных вариантов к формированию биопленки, а также проведен сравнительный анализ резистентности двух клонов штамма V. ско1егае Дакка 35 классического биовара и V. ско1егае М-1326 эльтор биовара к действию осмотического (2,5 М раствор №С1) и оксидативного (20 мМ раствор перекиси водорода) стрессов. В результате проведенных исследований установлено, что Т и О варианты как классических, так и эльтор вибрионов не отличаются по способности формировать биопленку. В то же время при изучении устойчивости О вариантов к стрессовым факторам было обнаружено, что О Тох+Нар++Мо1++ клоны V. ско1егае Дакка 35 действительно более устойчивы к действию высоких концентраций соли и перекиси водорода, чем Т Тох++Нар+Мо1;+ варианты. При одинаковой начальной концентрации бактерий в растворе клетки Т Тох++Нар+Мо1+ варианта в присутствии высокой концентрации соли и перекиси водорода к концу
опыта снизили свою численность почти в 100 раз. тогда как снижение КОЕ у О Тох+Нар++Мо^ вариантов было незначительным. В то же время у эльтор вибрионов не обнаружено отличий по выживаемости между Т и О вариантами при действии данных стрессовых факторов.
Таким образом. обнаруженный на поверхности О вариантов холерного вибриона экзополисаха-ридный слой определяет морфологию колоний. но не оказывает значительного влияния на их способность формировать биопленку. EPS О вариантов V. ско!ете классического биовара повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксида-тивного стрессов и образуется. видимо. в результате адаптации холерных вибрионов к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Функциональная роль экзополисахарида О вариантов эльтор вибрионов пока не установлена.
Одновременное изменение экспрессии нескольких генов вирулентности и персистенции у изученных штаммов V. ско!ете указывает на присутствие у холерного вибриона общего белка-регулятора и/ или регуляторной системы. Среди изученных и описанных в литературе регуляторных систем. контролирующих продукцию факторов патогенности и персистенции. мы не нашли сведений об участии какой-либо из них в одновременном изменении продукции СТ, Нар, экзополисахарида и подвижности. Возможно, у V. ско!ете существует еще неизвестная двухкомпонентная регуляторная система, которая в ответ на определенные сигналы внешней среды изменяет экспрессию генов с^АВ, hapA, vps, Ыу, кодирующих соответственно синтез СТ, Нар, экзополисахарида, гемолизина, а также подвижность. В пользу данного предположения указывают результаты, полученные при изучении сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение экспрессии факторов патогенности и персистенции в изученных штаммах V. ско!ете.
В качестве сигналов внешней среды было исследовано влияние различных факторов (температура, рН, осмолярность, присутствие аминокислот), изменяющих экспрессию известных регуляторных белков (ToxRS, ТохТ, ТсрРН, AphAB) [6]. В результате проведенных исследований выявлено, что одним из внешних сигналов, вызывающих одновременное альтернативное переключение активности генов, кодирующих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеа-зы, гемолизина и подвижности, является щелочная (рН 9,0) реакция среды. При культивировании штаммов на средах с рН 9,0 в популяции Т колоний появлялись О варианты с координированным изменением экспрессии указанных генов.
Таким образом, важным итогом проведенных исследований является получение новых данных о
популяционной гетерогенности природных штаммов V ско1егае О1 серогруппы эльтор биовара. В популяции ряда штаммов впервые обнаружено два типа клонов, различающихся по уровню продукции экзополисахарида, СТ, Нар, гемолизина, а также подвижности. Экспрессия генов, связанных с указанными фенотипическими свойствами, имеет координированный характер. Одним из внешних сигналов, вызывающих переключение активности генов, кодирующих холерный токсин, растворимую гемагглю-тинин/протеазу, экзополисахарид, подвижность, а также гемолизин в штаммах холерного вибриона является щелочная (рН 9,0) реакция среды. Возможно, переключение «прозрачные-мутные» варианты является одной из форм фазовых вариаций и необходимо V. ско!егае для выживания в изменяющихся условиях внешней среды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та; 1984. 328 с.
2. Исаев Н.Д., Лозовский Ю.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств. Пробл. особо опасных инф. 2005; 1(89):43—6.
3. Милютин В.Н.,ДрожевкинаМ.С., Ломов Ю.М., Уралева
B.С., Либинзон А. Е., Подосинникова Л.С. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. Ростов н/Д: Ростовское книжное изд-во; 1981. 176 с.
4. De S.N., Chatterje D.N. An experimental study of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane. J. Path. Bacteriol. 1953; 66(2):559—62.
5. DiRita V.J., Neely M., Taylor R.K., Bruss P.M. Differential expression of the ToxR regulon in classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae is due to biotype-specific control over toxT expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93(15):7991-95.
6. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae Genomics and Molecular Biology. Caister Academic Press, Norfolk, UK; 2008. 218 p.
7. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Hase
C.C. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment. Infect. Immun. 1992; 60:472-8.
8. Guvener Z.T., McCarter L.L. Multiple regulators control capsular polysaccharide production in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 2003; 185(18):5431—41.
9. Hammer B.K., Bassler B.L. Distinct sensory pathways in Vibrio cholerae El Tor and classical biotypes modulate cyclic dimeric GMP levels to control biofilm formation. J. Bacteriol. 2009; 191(1):169-77.
10. Hilton T., Rosche T., Froelich B., Smith B., Oliver J. Capsular polysaccharide phase variation in Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(11):в98в—93.
11. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 1983; 154:269—77.
12. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986; 30:1075—83.
13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T. Nature. 1970; 227:680—5.
14. Nesper J., Lauriano C.M., Klose K.E., Kapfhammer D., KraifiA., Reidl J. Characterization of Vibrio cholerae 01 El Tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect. Immun. 2001; 69(1):435—45.
15. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GM1-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 1983; 17:596—600.
16. YildizF.H., LieX.S., Heydorn A., Schoolnik G.K. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae 01 El Tor phase variant. Mol. Microbiol. 2004; 53(2):497—515.
Об авторах:
Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Российской научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, Университетская, 46. Тел. (845-2) 26-21-31. Факс (845-2) 51-52-12. E-mail: microbe@san.ru
S.P.Zadnova, L.F.Livanova, Yu.V.Lozovskiy, N.I.Smirnova
Detection of Clones with Different Expression of Virulence and Persistence Factors in Natural Populations of Cholera Vibrio and Their Phenotypic Analysis
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”, Saratov
Analysis of the population structure of 41 Vibrio cholerae biovar eltor natural strains permitted to detect 12 strains forming typical transparent and
atypical opaque colonies. Among the later were identified 3 strains which morphology variability correlated with altered production of exopolysaccharide, cholera toxin, hemolysine, soluble hemagglutinin/protease and altered mobility. One of the external signals causing coordinating switching of production of the indicated pathogenicity and persistence factors is alkaline (pH 9,0) reaction of the medium.
Key words: Vibrio cholerae, heterogeneous population, coordinated change of virulence and persistence gene expression.
Authors:
Zadnova S.P., Livanova L.F., Lozovskiy Yu.V., Smirnova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: microbe@san.ru
nociynHna 25.03.09.
