CC BY
39
МЕДИЧНА ГЕНЕТИКА
йО! 10.29254/2077-4214-2018-1-1-142-227-230 УДК 591.156:575.113:616-005.6:616.155.191
Полубень Л. О., Неумержицька Л. В., Вербиленко Р. М., Шумейко О. О., Клименко С. В. ОСОБЛИВОСТ1 КЛ1Н1КО-ГЕМАТОЛОПЧНИХ ПОКАЗНИК1В У ХВОРИХ НА М1СЛОПРОЛ1ФЕРАТИВН1 НЕОПЛАЗМ 13
ОАЬЯ-ПОЗИТИВНИМ МУТАЦ1ЙНИМ СТАТУСОМ
ДУ «Нацюнальний науковий центр радiацiйноí медицини НАМН УкраТни» (м. Кив)
Зв'язок публ1кацп з плановими науково-до-сл1дними роботами. Публiкацiя е фрагментом планово! науково-дослщно! роботи ДУ «Нацюналь-ний науковий центр радiацiйноI медицини НАМН Укра!ни»: «Молекулярно-генетичнi особливостi РИ-негативних мiелопролiферативних неоплазiй у оЫб, якi зазнали впливу чинникiв авари на Чорнобиль-ськiй АЕС», № державно! реестраци 011711000625.
Вступ. Класичн хронiчнi Ph-негативнi мiело-пролiферативнi неоплазм (МПН) - це окрема група гематолопчних захворювань, до яких вщносять справжню полiцитемiю (СП), ессенцiальну тром-боцитемiю (ЕТ) та первинний мiелофiброз (ПМФ). МПН спричиненi появою соматичних мутацм у ге-матопоетичнiй стовбуровм клiтинi (ГСК), якi акти-вують вiдповiдальнi за гематопоез фiзiологiчнi вну-трiшньоклiтиннi сигнальнi шляхи. Таким чином, ГСК набувають селективних переваг до пролiферацiI у порiвняннi зi здоровими, iз наступним зрушенням до мiелоIдного диференцiювання та встановлен-ням клонального мiелопролiферативного фенотипу [7,10,13]. Важливим для розумiння генетичного пщфунтя розвитку МПН був 2005 рк, коли вперше була описана рекурентна мута^я псевдокiназного домену ЛН2 гена Янус юнази 2 (МК2) у 14-му екзо-нi, МК2 V617F, у бтьшост хворих на СП, а також у частини хворих на ЕТ та ПМФ [3,12]. ^знше, у 2006 роц^ була виявлена мута^я позаклiтинного домену гена рецептора тромбопоетину (МРЦ у 10-му екзо-ы, МР1- W515L, у МК2 V617F-негативних хворих на ЕТ та ПМФ [12]. Соматичн мутацiI гена кальретику-лiну (СЛИЗ) у 9-му екзон були описанi у 2013 роц у бiльшостi хворих на ЕТ та ПМФ, негативних за МК2 та MPL. В лiтературi описано понад 40 рiзно-видiв мутацiй гена CЛLR (делецiI та шсерци iз зсу-вом рамки зчитування), iз яких найчастiше зустр^ чаються мутацiя 1-го типу (деле^я 52 пар основ) у 53% та 2-го типу (шсер^я 5 пар основ) у 37,1% [2,4,8]. Нещодавно були описан iншi мутаци генiв МК2 у 12-му та 13-му екзонах та MPL у межах 10-го екзону та поза ним. В бтьшост випадюв мутаци, яю спричиняють розвиток МПН, виникають у взаемо-виключаючий спосiб у одному iз трьох драйверних геыв (МК2, MPL або CЛLR) та переважно активу-
ють иАК-БТАТ3/5 внутршньокгитинний сигнальний шлях [7]. За даними лтератури мутацiя МК2 V617F позитивна близько у 95% випадюв хворих на СП та у 50-60% випадюв хворих на ЕТ та ПМФ [1,5,6,8]. Мутаци гена CЛLR в 9-му екзон описан у 25% та 35% хворих на ЕТ та ПМФ, вщповщно [2,4,8]. Окрiм МК2 та CЛLR, у незначно! юлькост хворих на ЕТ та ПМФ визначаються мутаци гена MPL у 10-му екзон вщ 5 до 10% випадкiв [7,8,12]. Таким чином, врахо-вуючи сптьы молекулярно-генетичнi характеристики, цi захворювання за клiнiчними проявами мо-жуть маскувати одне одного. Однак, в результат ди специфiчних внутрiшнiх та зовншых факторiв, що впливають на ГСК iз соматичною мутацiею, фено-типовi ознаки МПН можуть значно в^^знятися. На-приклад, було показано, що наявнють мутаци гена CЛLR асоцтеться iз вищим рiвнем тромбоци^в, нижчим рiвнем лейкоцитiв у хворих на ЕТ та ПМФ та кращою загальною виживанютю, порiвняно iз МК2- позитивними пацiентами [4,11]. Також попе-редне дослiдження показало, що МПН у хворих, яю зазнали дм низьких доз юызуючо! радiацi! (1Р), вщ-рiзняються на молекулярно-генетичному рiвнi вiд спонтанних МПН. Зокрема, у хворих на радiацiй-но-асоцмований ПМФ частота мутаци МК2 нижча, ыж у пацiентiв зi спонтанним ПМФ [9]. Визначення мутацм геыв МК2, CЛLR та MPL у хворих на МПН е необхщним для встановлення дiагнозу та прогно-зування груп ризикiв.
Мета дослщження: вивчення частоти найбiльш розповсюджених мутацм гена CЛLR та !х асо^ацт iз клiнiко-гематологiчними показниками у хворих на ЕТ та ПМФ в Укра!ы iз акцентом на радiацiйно-асоцiйованi МПН.
Об'ект I методи дослщження. В дослiдження включено 144 хворих, яким був встановлений дiа-гноз ЕТ або ПМФ у рiзних медичних закладах Укра!-ни з 2009 по 2016 рк, з них 79 чоловшв та 65 жшок. Середнiй вiк хворих склав 53,3 роки. Група па^ен-^в складалася iз 42 хворих, яю попередньо зазнали ди 1Р внаслiдок авари на ЧАЕС та iз 102 хворих на спонтанн МПН. Дiагностичнi критери Всесв^ньо! оргаызаци охорони здоров'я (ВООЗ) 2016 року перегляду були використан для верифкаци дiагнозу
МПН. Bci па^енти пщписали iнформовану згоду на проведення до^дження в ДУ «Нацiональний на-уковий центр радiацiйноï медицини НАМН Украши» (ННЦРМ). Дослiдження було схвалене Етичним Ко-мiтетом ННЦРМ. Були проаналiзованi клшко-гема-тологiчнi показники периферичноï кровi хворих на МПН на момент встановлення дiагнозу. Зразки ДНК були отриман i3 лейкоцитiв периферичноï кровi за допомогою набору для видтення ДНК Quiamp DNA (Qiagen, Ымеччина) у вiдповiдностi до рекоменда-цм виробника. Мутацiю JAK2 V617F визначали за допомогою методу алель-специфiчноï полiмераз-ноï ланцюговоï реакцiï (ПЛР). Мута^ю 1-го типу гена CALR визначали за допомогою ПЛР в реальному час (РЧ-ПЛР) iз аналiзом температури плав-лення продуктiв амплiфiкацiï. Мутацiю 2-го типу гена CALR визначали за допомогою методу РЧ-ПЛР TaqMan iз використанням специфiчних ол^онукле-отидних проб до дiлянки дикого типу гена CALR та дтянки iз iнсерцiею 5 пар основ. Використовували iнструмент для РЧ-ПЛР (Applied Biosystems 7500 Fast-Time PCR Sysyem), а також 2X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Bbsystems, Великобрита-нiя) та 2X TaqMan Universal PCR Master mix (Applied Bоisystems, Великобритаыя) для визначення мута-цiй гена CALR 1-го та 2-го титв, вiдповiдно.
Обробка даних: статистичн розрахунки проводили за допомогою статичного пакету для аналiзу даних в середовищщ Microsoft Excel 2016. Дан оц^ нювали iз використанням точного тесту Фiшера у двобiчному варiантi та дисперсiйного аналiзу. Рiз-ницю мiж показниками вважали значимою при р <
0,05.
Результати дослщження та ïx обговорення.
З 144 хворих мута^я JAK2 V617F була виявлена у 83 i3 144 (57,6%) випадюв, i3 них у 20 i3 42 (47,6%) хворих, яю попередньо зазнали дм 1Р внаслiдок авари на ЧАЕС, та у 63 i3 102 (61,8%) хворих на спонтанн МПН. Мутацiю 1-го та 2-го титв гена CALR визначали у JAK2 V617F-негативних па^енпв. Мутаци гена
CALR були виявлен у 26 iз 144 (18,1%) випадюв, iз них у 12 iз 42 (28,6%) хворих на радiацiйно-асоцi-йованi МПН та у 14 iз 102 (13,7%) хворих на спон-таннi МПН. Пщ час аналiзу клiнiко-гематологiчних показникiв хворих на МПН були врахован мутацм-ний статус генiв МК2 та CALR, а також факт впливу малих доз 1Р в анамнезi (табл.).
Отже, мутацмний статус гена МК2 у хворих на ЕТ та ПМФ був визначений у першу чергу, адже мутацiя МК2 V617F виявляеться позитивною у 5060% випадкiв таких пацiентiв. Отриман данi можна порiвняти iз результатами авторiв iнших опублко-ваних роб^ [1,5,6,8]. Необхiдно вiдмiтити, що частота МК2 V617F мутацiI дещо нижча серед пащен-тiв, яю попередньо зазнали дИ малих доз 1Р, 47,6% проти 61,8% серед хворих на спонтанн МПН (р = 0,1), однак знаходиться поза межами статистично! вiрогiдностi. Недавне до^дження показало, що у хворих на радiацiйно-асоцiйований ПМФ частота МК2 V617F мутацiI також дещо нижча та знаходиться на межi статистично! вiрогiдностi [9]. Оскiльки мутацiI гена CALR, яю спричиняють розвиток МПН, виключен у МК2 V617F-позитивних хворих, тесту-вання на наявнiсть 1-го та 2-го титв мутацiй гена CALR проводилось лише у МК2 V617F-негативних пацiентiв. Частота мутацiй гена CALR дещо нижча, ыж за даними опублкованих дослiджень, що можна пояснити особливостями укра!нсько! популяцiI, проте для пщтвердження наших даних необхщ-но розширити дослiджувану групу хворих на ЕТ та ПМФ iз МК2 V617F-негативним статусом. На вщ-мiну вiд МК2 V617F, мутаци гена CALR виявляють-
ся частше серед хворих на радiацiйно-асоцiйованi МПН, 28,6% проти 13,7% (р = 0,05). Виявилося, що юльюсть еритроци^в та рiвень гемоглобiну нижчi серед CALR- позитивних хворих, ыж у хворих i3 JAK2 V617F-позитивним мутацiйним статусом, 4,1 ± 0,3 х1012/л проти 5,1 ± 0,2 х1012/л (р = 0,04) та 122,1 ± 0,8 г/л проти 137,4 ± 3,4 г/л (р = 0,05), вщ-повщно. Натомiсть, кiлькiсть тромбоцитiв е вищою
Таблиця.
Кл1н1ко-гематолог1чн1 показники хворих на МПН
Мутацмний статус МПН (ЕТ та ПМФ) Кшшко-гематолопчш показники
Еритроцити, х 1012/л Гемоглобш, г/л Тромбоцити, х 109/л Лейкоцити, х 109/л
JAK2 V617F Рад1ац1йно-асоц1йован1 МПН 4,6 ± 0,2 132,6 ± 6,8 541,9 ± 79, 1 12,4 ± 2,7
Спонтанн МПН 5,1 ± 0,2 139,1 ± 3,9 729,1 ± 48,0 14,6 ± 1,3
Рад1ац1йно-асоц1йован1 МПН vs спонтанн1 МПН р = 0,4 р = 0,4 р = 0,1 р = 0,6
Загалом 5,1 ± 0,2 137,4 ± 3,4 691,4 ± 41,6 14,2 ± 1,2
CALR Рад1ац1йно-асоц1йован1 МПН 3,8 ± 0,3 117,1 ± 5,0 1026,8 ± 223,4 11,5 ± 1,6
Спонтанн1 МПН 4,3 ± 0,1 126,5 ± 12,0 1091,5 ± 120,0 9,3 ± 0,5
Рад1ац1йно-асоц1йован1 МПН vs спонтанн1 МПН р = 0,1 р = 0,2 р = 0,8 р = 0,5
Загалом 4,1 ± 0,3 122,1 ± 0,8 1064,3 ± 119,6 10,5 ± 1,2
JAK2 V617F vs CALR р = 0,04 р = 0,05 р = 0,0004 р = 0,1
серед CЛLR- позитивних хворих 1064,3 ± 119,6 х109/л проти 691,4 ± 41,6 х109/л (р = 0,0004), про що повщомлялось i в недавнiх роботах шших дослщни-кiв. Згiдно дiагностичних критерив для ЕТ та ПМФ ВООЗ 2016 року перегляду, визначення наявност мутацм в генах МК2 та CЛLR вщносять до великих дiагностичних критерив разом iз патогiстологiчним до^дженням трепанобiоптату кiсткового мозку та клiнiко-гематологiчними показниками перифе-рично! кровi. Таким чином, тестування мутацмного статусу гена CЛLR серед МК2 V617F-негативних хворих е необхщним для пiдвищення точност дiа-гностики МПН, особливо радiацiйно-асоцiйованих МПН, визначення групи ризику патента для вибору адекватно! тактики в лкуваны з метою покращення загально! виживаностi та збереження якостi життя.
Висновки. За результатами нашого до^джен-ня, частота мутацiй гена CЛLR вища серед хворих на радiацiйно-асоцiйованi ЕТ та ПМФ. Хворi на ЕТ та ПМФ iз CALR-позитивним мутацiйним статусом характеризуються пiдвищеною юлькютю тромбо-цитiв, та нижчим рiвнем гемоглобiну та еритроци-тiв, порiвняно iз МК2-позитивними пацiентами.
Перспективи подальших досл1джень. Ви-вчення частоти та спектру драйверних та не драй-верних мутацiй серед хворих на РИ-негативы м^ елопролiферативнi неоплазм в Укра!ы допоможе краще зрозум™ молекулярно-генетичнi мехаыз-ми розвитку захворювання, пщвищить точнiсть дiагностики, визначення груп ризиюв та вiдкрие дослiдникам дано! проблеми новi напрямки таргет-ного л^вання.
Лiтература
1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005 Mar;19-25;365(9464):1054-61.
2. Imai M, Araki M, Komatsu N. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Int J Hematol. 2017 Jun;105(6):743-7.
3. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycytheamia vera. Nature. 2005 Apr 28;434(7037):1144-8.
4. Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, Nivarthi H, Rumi E, Milosevic J, et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2013 Dec;269(25):2379-90.
5. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. A-gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disoders. N Engl J Med. 2005 Apr 28;352(17):1779-90.
6. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig G, Huntly BJ, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycethemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):387-97.
7. Mead AJ, Mullally A. Myeloproliferative neoplasm steam cells. Blood. 2017 Mar 23;129(12):1607-16.
8. Milosevic Feenstra JD, Nivarthi H, Gisslinger H, Leroy E, Rumi E, Chachoua I, et al. Whole-exome sequencing identifies novel MPL and JAK2 mutations in triple-negative myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016 Jan 21;127(3):325-32.
9. Mishcheniuk OY, Kostukevich OM, Dmytrenko IV, Sholoyko VV, Prokopenko IM, Martina ZV, et al. Molecular characterization og Ph-negative myeloproliferative neoplasms in Ukraine. Exp Oncol. 2013 Sep;35(3):202-6.
10. Murati A, Brecqueville M, Devillier R, Mozziconacci MJ, Gelsi-Boyer V, Birnbaum D. Myeloid malignancies: mutations, models and management. BMC Cancer. 2012 Jul 23;12:304.
11. Pietra D, Rumi E, Ferretti VV, Di Buduo CA, Milanesi C, Cavalloni C, et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 2016 Feb;30(2):431-8.
12. Pikman Y, Lee BH, Mercher T, McDowell E, Ebert BL, Gozo M, et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006 Jul;3(7):1140-51.
13. Tefferi A, Thiele J, Vardiman JW. The 2008 World Health Organization Classification System for Myeloproliferative Neoplasms. Cancer. 2009 Sep 1;115(17):3842-7.
ОСОБЛИВОСТ1 КЛШ1КО-ГЕМАТОЛОПЧНИХ ПОКАЗНИК1В У ХВОРИХ НА М1еЛОПРОЛ1ФЕРАТИВН1 НЕОПЛАЗМ 13 CALR-ПОЗИТИВНИМ МУТАЦ1ЙНИМ СТАТУСОМ
Полубень Л. О., Неумержицька Л. В., Вербиленко Р. М., Шумейко О. O., Клименко С. В.
Резюме. Визначена частота мутацм 1-го та 2-го титв гена CALR у 144 хворих на ЕТ та ПМФ. Мутаци гена CALR були виявлен у 26 (18,1%) випадюв, i3 них у 12 (28,6%) хворих на радiацiйно-асоцiйованi МПН. Показано, що мутаци гена CALR виявляються частше серед хворих на радiацiйно-асоцiйованi МПН (р = 0,05). Хворi на ЕТ та ПМФ характеризуються пщвищеною ктькютю тромбоци^в (р = 0,0004). Ктькють еритроци^в (р = 0,04) та рiвень гемоглобшу (р = 0,05) е нижчими серед CALR-позитивних хворих, ыж у хворих i3 JAK2 V617F-позитивним мутацмним статусом.
Ключовi слова: мiелопролiферативна неоплазiя, мута^я, CALR, JAKV617F.
ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ С МИЕЛОПРОЛИ-ФЕРАТИВНЫМИ НЕОПЛАЗИЯМИ С CALR-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ МУТАЦИОННЫМ СТАТУСОМ
Полубень Л. А., Неумержицкая Л. В., Вербиленко Р. Н., Шумейко А. А., Клименко С. В.
Резюме. Определена частота мутаций 1-го и 2-го типов гена CALR у 144 больных ЭТ и ПМФ. Мутации гена CALR были обнаружены в 26 (18,1%) случаях, из них у 12 (28,6%) больных радиационно-ассоцииро-ванные МПН. Показано, что мутации гена CALR оказываются чаще среди больных радиационно-ассоции-рованными МПН (р = 0,05). Больные ЭТ и ПМФ характеризуются повышенным количеством тромбоцитов (р = 0,0004). Количество эритроцитов (р = 0,04) и уровень гемоглобина (р = 0,05) является ниже среди CALR-положительных больных, чем у больных с JAK2 V617F-положительным мутационным статусом.
Ключевые слова: миелопролиферативная неоплазия, мутация, CALR, JAKV617F.
FEATURES OF HEMATOLOGICAL PARAMETERS IN CALR-POSITIVE PATIENTS WITH MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASMS
Poluben L., Neumerzhitska L., Verbylenko R., Shumeiko O., Klymenko S.
Abstract. Classic chronic Ph-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs) are an unique group of hematologic diseases encompassing polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF). Our understanding of the mechanisms of MPNs development was dramatically changed in 2005, when recurrent mutation of tyrosine kinase JAK2 V617F was described in most patients with PV and in 50-60% patients with ET and PMF. Later, other MPNs-causing mutations were reported in MPL, CALR genes as well as in JAK2 gene involving other localizations. In most cases mutations in these genes arise in mutually exclusive way and cause establishment of myeloproliferative phenotype predominantly through JAK-STAT3/5 signalling pathway. Therefore, MPNs have common molecular genetic features and can mimic each other. However, due to impact of the factors such as specific disease-causing mutations in one of three mentioned genes, experiencing of low doses of ionizing radiation, they can present with different clinical characteristics.
Aim of our research was to study the frequency of the most common CALR gene mutations and their association with clinical hematological characteristics in Ukrainian patients with ET and PMF with accent on radiation-associated MPNs. 144 patients with ET and PMF (including 42 patients who were previously exposed to low doses of ionizing radiation) were tested for presence of JAK2 V617F mutation using allele-specific PCR, 1st type CALR (52 bp deletion) and 2nd type CALR (5 bp insertion) gene mutations using RT-PCR. Hematological parameters in 144 MPN patiens were analysed. CALR gene mutations were detected in 26 (18,1%) cases, including 12 (28,6%) patient with MPNs previously exposed to ionizing radiation. In our study we showed that CALR gene mutations are more common among MPN patients who were previously exposed to ionazing radiation (p = 0,05). Platelets count is higher (p = 0,0004), but red blood cells count (p = 0,04) and level of hemoglobin (p = 0,05) are lower in CALR-positive patients, than in JAK2-positive patients.
Key words: myeloproliferative neoplasm, mutation, CALR, JAKV617F.
Рецензент - проф. Скрипник I. М.
Стаття надшшла 22.01.2018 року
