CC BY
11
DOI 10.29254/2077-4214-2018-4-2-147-204-208 УДК 591.156:575.113:616-005.6:616.155.191
1Полубень Л. О., 2Чен С., 2Юан Ш.,3Шумейко О. О., 2Вознесенски О., 4Адам М.,4Френкель Е., 5Разник Р., 5Линдал М., 1Клименко С. В., 2Балк С., 2Френкель П. СПЕКТР ПОШКОДЖЕНИХ ГЕН1В У ХВОРИХ НА ПЕРВИННИЙ М16ЛОФ1БРОЗ В УКРА1Н1 1ДУ «Нацюнальний науковий центр радiацiйноí медицини НАМН Украши», вiддiл медично! генетики (м. Кшв) 2Бес Израел Диконесс Медичний Центр, вiддiл гематологи/онкологи (м. Бостон, МА, США) вНацiональний медичний ушверситет iм. О. О. Богомольця (м. Кшв) 4Массачусетський технологiчний iнститут, вщдкл бюлопчно! шженерп (м. Кембридж, МА, США) 5Хебрю унiверситет, школа комп'ютерних наук, вiддiл бюлопчно! хiмií (м. Ерусалим, 1зра'|'ль)
[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]
*Вклад aemopie в роботу pieH03Ha4Huü.
Зв'язок публшацм з плановими науково-дослщ-ними роботами. Публтащя е фрагментом планово! науково-дослщноТ роботи ДУ "Нацюнальний науковий центр радiацiйно! медицини НАМН УкраТни": "Молекулярно-генетичш особливостi Ph-негативних мiелопролiферативних неоплазiй у оаб, якi зазнали впливу чиннимв авари на Чорнобильськш АЕС", № державно! реестраци 0117U000625.
Вступ. Первинний мiелофiброз (ПМФ), справжня полiцитемiя (СП) та ессенцiальна тромбоцитемiя вiдносяться до групи Ph-негативних хрошчних mí-елопролiферативних неоплазiй (МПН), ям загалом характеризуються клональною пролiферацiею Mie-лоТдних клiтин рiзноТ морфолопчноТ зршостч. Сьо-годнi причина розвитку МПН може бути встановлена у бтьшосп випадмв на молекулярно-генетичному рiвнi [1,2,3,4,5,6]. Зазвичай набут соматичнi мута-ци виявляють у Janus Kinase 2 (JAK2), Thrombopoietin Receptor (MPL) та Calreticulin (CALR) генах (до 90% випадмв), ям взаемо виключають одна одну та при-зводять до постшноТ активаци JAK/STAT сигнального внутршньокл^инного шляху i встановлення мieло-пролiферативного фенотипу [2,6,7]. Однак, у випад-ках, коли соматичнi мутаци JAK2, MPL або CALR гешв вщсутш (близько 15%) у хворих на МПН, можливе залучення iнших молекулярно-генетичних меха-нiзмiв до розвитку захворювання [2,4,6,8]. Додат-ковi мутаци у хворих на МПН можуть визначатися одночасно з одшею iз мутацш генiв JAK2, MPL або CALR або у взаемовиключний спосiб з ними. Зазна-ченi мутаци були описан в генах, якi приймають участь у внутрiшньоклiтинному сигналюваннi, при-гнiченнi пухлинного росту, сплайсингу, етгенетич-ному регулюваннi або лейкемiчнiй трансформаци [8,9,10,11,12].
Метою нашого дослiдження було визначен-ня спектру пошкоджених гешв у хворих на ПМФ в УкраТш, додатково до мутацш у звичайних драйвер-них генах (JAK2, MPL та CALR).
Об'ект i методи дослiджень
Пацieнти та зразки. В дослiдження включено 30 хворих на ПМФ, яким був встановлений дiагноз у рiзних медичних закладах Украши з 2009 по 2016 piK, з них 17 чолов^в та 13 жiнок. Середнiй вт хворих на момент встановлення дiагнозу склав 56,2 роки (24 - 79 ромв). Дiагностичнi критери Всесв^-ньоУ оргашзацп охорони здоров'я (ВООЗ) 2016 року перегляду були використаш для верифтаци дiагно-зу ПМФ. Пащенти пiдписали iнфоpмовану згоду на проведення дослщження в ДУ "Нацюнальний науковий центр pадiацiйноï медицини НАМН Украши" (ННЦРМ). Дослщження було схвалене Етичним Ко-м^етом ННЦРМ. Зразки ДНК отpиманi iз лейкоцитiв периферичноУ кpовi за допомогою набору для види лення ДНК Quiamp DNA (Qiagen, Нiмеччина) у вщпо-вiдностi до pекомендацiй виробника.
Повне екзомне Ыквенування. Дослiдження ге-нетичних ваpiант здiйснювали за допомогою аквенування наступного поколшня (повне екзомне аквенування). Асамблея геному людини GRCh37/hg19 була використана у якост контролю. Генетичнi ва-piанти кодуючих дiлянок ДНК були пpоаналiзованi. Для уникнення помилок сiквенування та амплiфiка-ци пiд час проведення полiмеpазноï ланцюговоУ ре-акци, генетичш ваpiанти були пpоаналiзованi, якщо вони вщповщали наступним умовам: (1) принаймш 5 абсолютних зчитувань; (2) ваpiант було виявлено в > 5% уах зчитувань в дiлянцi локалiзацiï ваpiанта. Статистичнi розрахунки проводили за допомогою статичного пакету для аналiзу даних в середовищ1 Microsoft Excel 2016. Даш оцшювали iз використан-ням t-кpитеpiя Стюдента. Рiзницю мiж показниками вважали значимою при р < 0.05.
ЕкспреЫя BeKTopiB та кл^инна культура. В досли дженш були викоpистанi MSCV-MPL-Neo та MSCV-MPL(W515L)-IRES-GFP pетpовipуснi вектори. MPL p.P222S (c. C664T) мiссенс ваpiант було згенерова-но за допомогою QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Санта Клара,
Калфоршя, США), вщповщно до рекомендацш ви-робника, та пщтверджено Сангер1вським ствену-ванням. 293Т кл^ини культивували в середовищ1 DMEM ¡з додаванням фетальноТ бичачоТ сироватки (ФБС). Трансфекщя 293Т кл^ин та продукцт ретро-в1русного супернатанту були здмснеш, використо-вуючи Lipofectamine 3000 Reagent Kit (ThermoFisher Scientific, США), вщповщно до рекомендацш ви-робника. Ba/F3 клiтини культивували в середови-щi RPMI 1640 i3 додаванням ФБС та штерлейкшу 3 (IL3). Ba/F3 були трансдукованi вiрусним суперна-тантом. Селекщю клiтини проводили, використову-ючи неомiцин в концентрацiТ 4 мг/мл. Живi клiтини були перемiщенi у середовище без додавання ци-томшв або у середовище i3 рiзною концентрацieю тромбопоетину.
Вестерн-блот анал1з. Клiтини були зiбранi та ли зованi у лiзуючому розчинi, бiлковi молекули були роздтеш методом електрофорезу. Жтроцелюльоз-ну мембрану блокували в TBST/5% молоц та шку-бували з перелiченими антитiлами: анти^ТАТ3, анти-рSTAT3, анти-JAK2, анти-pJA^, анти-TPOR, анти-рTPOR та анти-актин.
Результати дослщження та Ух обговорення
Частоти каношчних мутацш трьох драйвер-них гешв (JAK2, MPL та CALR). Повне екзомне ак-венування (ПЕС) було проведене, використовуючи зразки ДНК, отриман iз лейкоцитiв периферичноТ кровi вiд 30 хворих на ПМФ. За допомогою ПЕС були виявлен попередньо щентифтоваш в iнших дослщженнях та новi генетичнi варiанти, розцшеш як патогеннi або потенцiйно патогены, керуючись ClinVar, dbSNP, COSMIC та шшими базами даних. Ка-ношчш мутацй трьох драйверних генiв МПН були виявлеш у 70% (21/30) хворих на ПМФ: JAK2 V617F - у 43.3% (13/30), MPL W515K/L - у 10% (3/30) та мутацй" гена CALR (1-ий тип: делещя 52 пар нукле-отидiв; та 2-ий тип: шсерщя 5 пар нуклеотидiв) - у 16.7% (5/30) випадмв. В нашому дослщженш частота мутацiй JAK2 V617F була дещо нижчою у хворих на ПМФ, шж за даними опублтованих дослiджень (50-60%), що можна пояснити вiдносно малою ви-бiркою хворих [1,5,6]. Частоти мутацш MPL та CALR генiв, отриманих у нашому дослщженш, не супер-ечать даним л^ератури - 5 - 10% та 12% - 35%, вщповщно [6,7]. Також, в одного хворого, негативного за цими мутащями, ми щентифтували мксенс вари ант MPL P222S (c.C664T), локалiзований поза 10-им
екзоном, в зовшшньокл^иннш частинi тромбопое-тинового рецептора [13]. В нещодавшх опублтова-них дослщженнях було виявлено дектька мутацт MPL гена i3 набуттям функцп поза 10-им екзоном [6]. Враховуючи, що деякi i3 них (MPL P204S, MPL E230G) знаходиться поблизу MPL P222S, ми припустили, що цей варiант набувае бюлопчноТ функцп та може бути потенцшним драйвером захворювання.
Гени, залучен до розвитку та еволюцп ПМФ. Загалом, виключаючи канонiчнi мутацй" звичайних драйверних гешв (JAK2, MPL та CALR), бтьше па-тогенних та потенцшно патогенних генетичних ва-рiантiв було виявлено серед хворих, негативних за цими мутащями. Серед хворих на ПМФ, позитивних за мутащями в звичайних драйверних генах, серед-ня кшьккть патогенних або потенцшно патогенних генетичних варiантiв склала 3.3 (1 - 9), а серед хворих, негативних за мутащями цих гешв, - 5 (4 - 7) (р = 0.03). Це вказуе на складшсть та гетерогеншсть генетичних пошкоджень серед хворих на ПМФ, негативних за мутащями звичайних драйверних гешв, у яких розвиток та модифшащя захворювання реа-лiзуються за рахунок комбшованих молекулярно-генетичних механiзмiв.
Серед рекуррентно пошкоджених гешв у хворих на ПМФ, як позитивних, так i негативних за мутаци ями звичайних драйверних гешв, були ASXL1, PEG3, EZH2, ATM, U2AF1 та CDH23. (рис. 1). Одним iз най-частiше пошкоджених генiв у нашому дослщжен-нi, додатково до звичайних драйверних гешв, був Additional Sex Combs Likel (ASXL1), регулятор тран-скрипцп, частота пошкоджень якого склала 23.3% (8/30), що вщповщае результатам шших дослiджень [11,14]. Експреая мутованого ASXL1 призводить до порушення функцiй гематопоетичноТ" стовбуро-воТ кл^ини, що надае Тй переваг до виживання та лейкемiчноТ трансформацiТ [15]. Мутацй та цитоге-нетичнi пошкодження Enhancer of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit (EZH2) гена порушують функщю Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) та часто описують у хворих на МПН (~10%). В представ-леному дослщженш пошкодження EZH2 гена були виявлеш у 16.7% (5/30) хворих на ПМФ, в тому числ1 у 22.2% (2/9) хворих на ПМФ, негативних за мутаци ями в трьох драйверних генах. Пошкодження EZH2 гена - це найбтьш ранш поди лейкомогенезу, як1 асощюються iз поганим прогнозом та модифтащя-ми МПН фенотипу [16,17]. Додатково, гени JARID2,
13 12 11
Назваген¡в
Рис. 1. Спектр гешв i3 патогенними або потенцшно патогенними генетичними вар1антами, виявленими у хворих на первинний м[елоф[броз, позитивних за одшею i3 каношчних мутацiй звичайних драйверних генiв (JAK2, MPL або CALR) (чорний), та хворих,
негативних за цими мутащями (бтий).
Рис. 2. Потенцшно пошкоджеш внyтрiшньо-клiтиннi мехашзми y хворих на первинний мieлофiброз, позитивних за одшею i3 кaнонiчниx муацш звичайних драйверних гешв (JAK2, MPL або CALR) (чорний), та хворих, негативних за цими муащями (бiлий).
MPL WT MPL P222S MPL W515
ТРО
pStat3 Stat3 TPOR Actin
s с s ТЕ i
От-ЮЮОт-ЮЮ ó LO LO
Jfcii 0
«W —• —
• m mm
— — — — - —• — •
pJAKYI 007/1008, TPORpY- не виявлено
Рис. 3. Вестерн-блот. Не виявлено активацп STAT3 сигнальноТ молекули в клгтиннш культура BA/F3 клгтин з експреаею MPL P222S за умови стимулювання тромбопоетином у р^зних концентрациях протягом 7 хвилин. TPO: тромбопоетин;
TPOR: рецептор тромбопоетину; Actin: актин; MPL WT: клгтинна культура BA/ F3 клггин з експреаею MPL дикого типу (негативний контроль); MPL W515: клггинна культура BA/F3 клггин з експреаею каношчноТ мутацп MPL (позитивний
контроль).
RBBP8, RTEL1, SUZ12, BRCA2, LAMB4, NF1, RBM12B, RBM43, RBP3 були рекуррентно пошкоджеш серед хворих, позитивних за каношчними мутащями в драйверних генах. Серед хворих на ПМФ, негативних за каношчними мутащями в трьох драйверних генах, додатковими рекуррентно пошкодженими генами були DNMT3A та TET2, хоча значна мльмсть генетичних варiантiв була виявлена у RTEL1, SUZ12, CBL, CUX1, FLT3LG i UMODL1 генах в одиничних ви-падках.
Демлька гешв були пошкоджеш виключно серед хворих на ПМФ, негативних за каношчними мутащя-ми втрьохдрайверних генах, в одиничних випадках. Згадаш гени включали KIT, SF3B1, JAK3, KRAS, GNAS, DAXXта RBKS, ям можуть бути потенцшними драйверами захворювання у цш груш хворих на ПМФ (рис. 1). Proto-Oncogene Receptor Tyrosine Kinase (KIT) функцюнуе, як кл^инний рецептор та бере участь у регуляцп клггинноТ' пролiферацп i виживання, гема-топоезу, тдтримання життeдiяльностi стовбурових
кл^ин та розвитку мастоцилв. Близько у 90% хворих мастоцитозом виявляють соматичш мутацп i3 набуттям функцп гена KIT [18]. Splicing Factor 3b Subunit 1 (SF3B1) - це компонент протеУново-го комплексу сплайсингового фактору 3b. Мутацп SF3B1 гена були описаш при демлькох мiелоïдних неоплазiях, найчастiше у хворих на мiелодисплас-тичний синдром, а також у хворих на хрошчну лiмфоцитарну лейкемiю, зло-якiснi новоутворення молочноУ залози та пщшлунковоУ залози [19,20,21]. Мутацп Guanine Nucleotide-Binding Protein G(S) Subunit Alpha (GNAS) гена рашше були описаш у випадках лейкемп, а нещодавне дослщження вказуе, що пошкодження вказаного гена можуть бути подiями, iнiцiюючими розвиток МПН, мieлодиспластичного синдрому, хрошчноУ лiмфоцитарноï лейкемп та го-строУ мiелоïдноï лейкемп [22].
Загалом, серед 30 хворих на ПМФ найчаспше були пошкоджеш гени, ям приймають участь у внутршньокл^ин-ному сигналюваннi, сплайсингу, ре-моделюваннi хроматину, механiзмах реагування на пошкодження ДНК та транскрипцп (рис. 2).
Функцюнальний аналiз MPL P222S. Пiсля стимуляцп ^тинноУ культури (Ba/ F3) з експресieю MPL P222S тромбопоетином протягом 7 хвилин, вестерн-блот не показав вщмшностей щодо штенсивносп фосфорилювання JAK/ STAT сигнальних бтмв у порiвняннi з культурою клiтин з експреаею MPL дикого типу (негативний контроль). Хоча, в кулы^ кл^ин (Ba/F3) з експресiею MPL W515L спостеркаеться пперчутли-вiсть до тромбопоетиновоУ стимуляцп
(рис. 3).
Висновки. В представленому дослщженш ми визначили спектр гешв, пошкоджених у хворих на ПМФ в УкраУш, якi можуть приймати участь у розвитку та модифтацп захворювання. Серед них були виявлеш рекуррентно пошкоджеш гени, як одно-часно iз каношчними мутащями драйверних генiв (JAK2, MPL та CALR), так i окремо вщ них. Серед хворих на ПМФ, негативних за каношчними мутащями драйверних гешв, ми щентифтували демлька генетичних варiантiв, ям можуть бути потенцiйними драйверами МПН.
Перспективи подальших дослiджень. Необ-хiдне подальше вивчення у функцiональних екс-периментах щентифтованих у нашому дослщжен-нi генетичних варiантiв, якi можуть потенцiйними драйверами мiелопролiферативних неоплазiй, для вивчення Ух бiологiчних функцiй.
Лггература
1. Constantinescu SN, Leroy E, Gryshkova V, Pecquet C, Dusa A. Activating Janus kinase pseudokinase domain mutations in myeloproliferative and other blood cancers. Biochem Soc Trans. 2013;41(4):1048-54.
2. Mead AJ, Mullally A. Myeloproliferative neoplasm stem cells. Blood. 2017;129(12):1607-16.
3. Murati A, Brecqueville M, Devillier R, Mozziconacci MJ, Gelsi-Boyer V, Birnbaum D. Myeloid malignancies: mutations, models and management. BMC Cancer. 2012;12:304.
4. Guglielmelli P, Pacilli A, Rotunno G, Rumi E, Rosti V, Delaini F, et al. Presentation and outcome of patients with 2016 WHO diagnosis of prefi-brotic and overt primary myelofibrosis. Blood. 2017;129(24):3227-36.
5. Bartels S, Lehmann U, Büsche G, Schlue J, Mozer M, Stadler J, et al. SRSF2 and U2AF1 mutations in primary myelofibrosis are associated with JAK2 and MPL but not calreticulin mutation and may independently reoccur after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia. 2015;29(1):253-5.
6. Milosevic Feenstra JD, Nivarthi H, Gisslinger H, Leroy E, Rumi E, Chachoua I, et al. Whole-exome sequencing identifies novel MPL and JAK2 mutations in triple-negative myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016;127:325-32.
7. Lim K-H, Lin H-C, Chen CG-S, Wang W-T, Chang Y-C, Chiang Y-H, et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using highresolution melting analysis. Clin Chim Acta. 2015;440:133-9.
8. Rumi E, Cazzola M. Diagnosis, risk stratification, and response evaluation in classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017;129(6):680-92.
9. Lundberg P, Karow A, Nienhold R, Looser R, Hao-Shen H, Nissen I, et al. Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood. 2014;123(14):2220-8.
10. McCabe MT, Ott HM, Ganji G, Korenchuk S, Thompson C, Van Aller GS, et al. EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations. Nature. 2012;492(7427):108-12.
11. Tefferi A, Thiele J, Vardiman JW. The 2008 World Health Organization classification system for myeloproliferative neoplasms: order out of chaos. Cancer. 2009;115(17):3842-7.
12. Yogarajah M, Tefferi A. Leukemic Transformation in Myeloproliferative Neoplasms: a Literature Review on Risk, Characteristics, and Outcome. Mayo Clinic Proceedings. 2017;92(7):1118-28.
13. Poluben L, Puligandla M, Neuberg D, Bryke CR, Hsu Y, Shumeiko O, et al. Characteristics of myeloproliferative neoplasms in patients exposed to ionizing radiation following the Chernobyl nuclear accident. Am J Hematol. 2018. DOI: 10.1002/ajh.25307
14. Brecqueville M, Rey J, Bertucci F, Coppin E, Finetti P, Carbuccia N, et al. Mutation analysis of ASXL1, CBL, DNMT3A, IDH1, IDH2, JAK2, MPL, NF1, SF3B1, SUZ12, and TET2 in myeloproliferative neoplasms. Genes Chromosom Cancer. 2012;51(8):743-55.
15. Nagase R, Inoue D, Pastore A, Fujino T, Hou H-A, Yamasaki N, et al. Expression of mutant Asxl1 perturbs hematopoiesis and promotes susceptibility to leukemic transformation. J Exp Med. 2018;215(6):1729-47.
16. Score J, Hidalgo-Curtis C, Jones AV, Winkelmann N, Skinner A, Ward D, et al. Inactivation of polycomb repressive complex 2 components in myeloproliferative and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms. Blood. 2012;119(5):1208-13.
17. Marti'nez-Avilés L, Besses C, Alvarez-Larran A, Torres E, Serrano S, Bellosillo B. TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Ann Hematol. 2012;91(4):533-41.
18. Jara-Acevedo M, Teodosio C, Sanchez-Munoz L, Alvarez-Twose I, Mayado A, Caldas C, et al. Detection of the KIT D816V mutation in peripheral blood of systemic mastocytosis: diagnostic implications. Mod Pathol. 2015;28(8):1138-49.
19. Biankin AV, Waddell N, Kassahn KS, Gingras MC, Muthuswamy LB, Johns AL, et al. Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes. Nature. 2012;491(7424):399-405.
20. Sashida G, Wang C, Tomioka T, Oshima M, Aoyama K, Kanai A, et al. The loss of Ezh2 drives the pathogenesis of myelofibrosis and sensitizes tumor-initiating cells to bromodomain inhibition. J Exp Med. 2016;213(8):1459-77.
21. Wan Y, Wu CJ. SF3B1 mutations in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2013;121(23):4627-34.
22. Xie M, Lu C, Wang J, McLellan MD, Johnson KJ, Wendl MC, et al. Age-related mutations associated with clonal hematopoietic expansion and malignancies. Nat Med. 2014;20(12):1472-8.
СПЕКТР ПОШКОДЖЕНИХ ГЕН1В У ХВОРИХ НА ПЕРВИННИЙ М16ЛОФ1БРОЗ В УКРА1Н1 Полубень Л. О., Чен С., Юан Ш., Шумейко О. О., Вознесенски О., Адам М., Френкель Е., Разник Р., Линдал М., Клименко С. В., Балк С., Френкель П. Резюме. Метою нашого дослщження було вивчення спектру пошкоджених гешв у хворих на первин-ний мieлофiброз (ПМФ) в УкраУш. За допомогою повного екзомного аквенування були визначеш рашше щентифтоваш та нещентифтоваш генетичш варiанти, як були розцшеш, як патогены або потенцшно патогены. Найчаспше пошкодженими генами серед хворих на ПМФ в УкраУш були ASXL1, PEG3, EZH2, ATM, U2AF1 та CDH23 додатково до JAK2, MPLта CALR. ^м того, у одного хворого був щентифтований неканошчний варiант MPL P222S. В клп"иннш кулы^ експреая MPL P222S в клп"инах Ba/F3 не продемонструвала вщмшностей у фосфорилюванш сигнальних молекул JAK/STAT у вщповщь на стимулювання тромбопоетином у порiвняннi i3 експреаею MPL дикого типу. Загалом бтьше патогенних та потенцшно патогенних варiантiв було визначено серед хворих на ПМФ, негативних за каношчними мутащями в трьох драйверних генах (JAK2, MPL та CALR), порiвняно з хворими, позитивними за цими мутащями. ^м того, ми щентифтували дектька гешв, пошкоджених в окремих випадках (KIT, SF3B1, GNAS) у хворих на ПМФ, негативних за каношчними мутащями в трьох драйверних генах, як можуть бути потенцшними драйверами МПН. Ключовi слова: первинний мieлофiброз, мутащя, ген.
СПЕКТР ПОРАЖЕННЫХ ГЕНОВ У ПАЦИЕНТОВ С ПЕРВИЧНЫМ МИЕЛОФИБРОЗОМ В УКРАИНЕ Полубень Л. А., Чен С., Юан Ш., Шумейко А. А., Вознесенски О., Адам М., Френкель Э., Разник Р., Линдал М., Клименко С. В., Балк С., Френкель П. Резюме. Целью нашего исследования было изучение спектра поврежденных генов в украинских пациентов с диагнозом первичного миелофиброза (ПМФ). Используя полное экзомное сиквенирование (ПЭС), мы обнаружили ранее идентифицированные и неидентифицированные генетические варианты, которые считаются патогенными или потенциально патогенными. Наиболее часто поврежденными среди украинских пациентов с ПМФ были гены ASXL1, PEG3, EZH2, ATM, U2AF1 и CDH23 в дополнение к JAK2, MPL и CALR. Кроме того, у одного пациента, был обнаружен неканонический вариант MPL P222S. Однако, в анализе клеточной культуры, экспрессия MPL P222S в клетках Ba/F3 не продемонстрировала различий в фосфорилировании сиг-
нальных белков JAK/STAT в ответ на стимуляцию тромбопоэтином по сравнению с экспрессией MPL дикого типа. В целом, больше патогенных и потенциально патогенных вариантов было обнаружено среди пациентов с ПМФ, негативных по каноническим мутациям в трех драйверных генах (JAK2, MPL и CALR), по сравнению с пациентами, положительными по одной из этих мутаций. Кроме того, мы идентифицировали несколько генов, поврежденных в единичных случаях (KIT, SF3B1, GNAS) у пациентов с ПМФ, негативных по каноническим мутациям в трех драйверных генах, которые могут быть потенциальными драйверами MPN.
Ключевые слова: первичный миелофиброз, мутация, ген.
SPECTRUM OF AFFECTED GENES IN UKRAINIAN PATIENTS WITH PRIMARY MYELOFIBROSIS
Poluben L., Chen S., Yuan X., Shumeiko O., Voznesensky O., Adam M., Fraenkel E., Rasnic R.,
Linial M., Klymenko S., Balk S. P., Fraenkel P. G.
Abstract. In this study we aimed to identify the spectrum of affected genes in Ukrainian patients diagnosed with primary myelofibrosis (PMF). DNA samples were obtained from peripheral blood leukocytes of 30 Ukrainian PMF patients. Using Whole Exome Sequencing, we detected previously reported and unreported sequence variants considered as pathogenic or potentially pathogenic. Canonical mutations of usual MPN-driver genes were detected in 70% of PMF patients, including JAK2 V617F - in 43.3%, MPL W515 - in 10% and CALR mutations (type 1-like and 2-like) - in 16.7% of patients. Also, a non-canonical MPL P222S variant was detected in one patient negative for these mutations. However, in cell culture assay, MPL P222S expression in Ba/F3 cells did not demonstrate differences in phosphorylation of JAK/STAT signaling proteins in response to TPO stimulation compared to MPL WT expression. Overall, more pathogenic and potentially pathogenic sequence variants were found among PMF patients negative for canonical mutations in three driver genes (JAK2, MPL and CALR), compared to patients, positive for one of these mutations. The mean numbers of variants were 5 (range: 4 - 7) versus 3.3 (range: 1 - 9), respectively (p = 0.03). The most frequently affected among Ukrainian PMF patients were genes ASXL1, PEG3, EZH2, ATM, U2AF1, and CDH23 in addition to JAK2, MPL and CALR. Pathogenic or potentially pathogenic sequence variants of ASXL1 and EZH2 genes were identified in 23.3°% and 16.7°% of cases, respectively. Genes JARID2, RBBP8, RTEL1, SUZ12, BRCA2, LAMB4, NF1, RBM12B, RBM43, and RBP3 were recurrently affected in PMF patients who were also positive for usual mutations in three driver genes. Among PMF patients negative for usual mutations in three driver genes recurrently affected genes were DNMT3A and TET2 in addition to mentioned earlier, and some genetic variants were identified in RTEL1, SUZ12, CBL, CUX1, FLT3LG and UMODL1 genes in single cases. Also, we identified several genes affected in single cases (KIT, SF3B1, GNAS) in PMF patients negative for canonical mutations in three driver genes which may be potential MPN drivers.
Key words: primary myelofibrosis, mutation, gene.
Рецензент - проф. Скрипник I. М.
Стаття надшшла 01.11.2018 року
