ОСОБЕННОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ ПШЕНИЧНОГО БЕЛКА В СОСТАВЕ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ МИКРОСТРУКТУРНЫМИ МЕТОДАМИ Текст научной статьи по специальности «Прочие технологии»

УДК 637.5:611.018:577.112:633.11 Ил. 9. Библ. 18.

особенности выявления пшеничного белка в составе мясных продуктов м икроструктурными методами

Пчелкина В.А., канд.техн.наук

ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН

Ключевые слова: гистохимия, иммуногистохимия, идентификация компонентов, пшеничная клейковина

Реферат

Представлены результаты микроструктурных исследований пшеничной муки, пшеничной текстурированной муки и пшеничной клейковины с целью определения их основных структурных характеристик. Применяли разные методики гистологического, гистохимического и имму-ногистохимического окрашивания: окрашивание гематоксилином и эозином, раствором йода, Calleja, PAS Calleja и метиленовым синим. Использовали безбиотиновый ИГХ метод с мульти-мерной системой детекции. При идентификации пшеничной муки обращали внимание на характерные клетки алейронового слоя и клетки эндосперма, заполненные крахмальными зернами. Пшеничная текстурированная мука представляет собой преимущественно слоистые углеводные структуры с включением плотных белковых гранул. Особенностью текстурированной клейковины является губчатая структура с вкраплением крахмальных зерен. Углеводная составляющая/ крахмал окрашивается раствором йода и PAS Calleja (лилово-розовый), белковая - эозином, метиленовым синим и Calleja/PAS Calleja (зеленый). Гистологические и гистохимические методики окрашивания целесообразно применять в совокупности. Наиболее чувствительным и надежным является ИГХ анализ, при котором окрашиванию подвергается только белковая часть.

detection of wheat protein in meat products by microstructural methods

Pchelkina V.A.

Gorbatov Research Center for Food Systems

Key words: histochemistry, immunohistochemistry, identification of components, wheat gluten

Summary

The article presents the results of microstructural studies of wheat flour, textured wheat flour and wheat gluten to determine their main structural characteristics. Used different methods of histological, histochemical and immunohistochemical as say: staining with hematoxylin and eosin, iodine solution, Calleja, PAS Calleja and methylene blue, IHC the multimer detection system. When you identify the wheat flour should pay attention to cells characteristic of the aleurone layer and endosperm cells filled with starch grains. Textured wheat flour is a carbohydrate layered structure with the incorporation protein granules. Feature of textured gluten is a spongy structure interspersed with starch grains. Carbohydrate component/starch stained by iodine solution and PAS Calleja (purple-pink), protein — eosin, methylene blue and Calleja/PAS Calleja (green). Histological and histochemical methods is advisable to apply together. The most sensitive and reliable is the IHC assay when only the protein part is stained.

Введение

Использование растительного сырья в мясной отрасли обусловлено его высокой пищевой ценностью, хорошими функциональными свойствами и низкой стоимостью. В настоящее время актуальным вопросом для мясоперерабатывающих предприятий является применение растительных белковых компонентов, являющихся альтернативой соевым. В связи с этим значительно расширилась линейка мясных продуктов, в производстве которых используются продукты переработки зерновых культур.

Из зерновых культур наиболее важной и доступной на территории России является пшеница. В колбасном производстве в небольших количествах для увеличения вязкости и влагоудерживающей способности фарша традиционно используют пшеничную муку и крахмал [9]. Перспективным является пшеничный белок клейковины, который на 80% состоит из глютена и характеризуется редкими адгезивными, когезивными и пленкообразующими свойствами [11]. С расширением производства пшеничного крахмала, глютен, как побочный продукт отрасли, доступен в больших количествах и по сравнительно низким ценам. Ранее его использование ограничивалось хлебной промышленностью, однако путем химической или ферментативной модификации область его применения

была расширена [14]. Сейчас данный ингредиент используется в качестве добавок в мясные изделия и изделия из мяса птицы [12].

В качестве аналогов мяса в мясной промышленности используют различные текстурированные формы пшеничных компонентов: текстурированный пшеничный белок/клейковина, текстурированная пшеничная мука [2, 10]. Еще одним продуктом, нашедшем применение в мясном производстве, является изолят пшеничного белка, который обладает хорошими связывающими свойствами и применяется в составе рассолов для шприцевания, а также при изготовлении вегетарианских продуктов, создавая текстуры близкие к традиционным мясным продуктам [6, 7].

Следует отметить, что фактором, ограничивающим применение пшеницы в качестве ингредиента мясного продукта, является озабоченность аллергенным потенциалом пшеничного белка и глюте-новой болезнью (целиакией) [1, 5]. Пшеница относится к наиболее распространенным источникам пищевых аллергенов у детей [3]. В нашей стране крупных эпидемиологических исследований по распространению целиакии до настоящего времени не проводилось. По данным Министерства здравоохранения РФ, предполагаемая частота заболевания в России может составлять 1:100-1:250.

Для защиты таких потребителей разрабатываются различные аналитические методы, способные обнаруживать вызывающие аллергические реакции компоненты. К сожалению, определение аллергенов в пищевых продуктах является сложной задачей, так как чаще всего они присутствуют в небольших, даже следовых количествах, а структура растительных белков может быть существенно модифицирована в процессе технологического воздействия. В соответствии с Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 022/2-11 «Пищевая продукция в части ее маркировки» указывать злаки, содержащие глютен, и продукты их переработкив составе продукта необходимо независимо от их количества.

Микроструктурные методы являются одними из самых старых аналитических методов, которые все еще широко используются для обнаружения пищевых компонентов в основном благодаря их простому воспроизведению и способности различать и идентифицировать отдельные животные и растительные ингредиенты в мясных продуктах [15-17]. Технологии визуализации являются одними из лучших подходов к оценке структуры пищевых продуктов [13]. В настоящее время существует большое количество вариантов обработки и подготовки образцов к исследованию: от классических техник, до методик, в которых использу-

ется современное оборудование и микроскопия.

В России для выявления растительных компонентов в составе мясных продуктов применяют ГОСТ 31500-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных углеводных добавок» и ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок». Однако в них отсутствует информация по идентификации пшеничных ингредиентов. В связи с этим целью исследования было изучение возможностей микроструктурных методов выявления пшеничного белка в мясных продуктах.

Материалы и методы

Объектами исследования в данной работе являлись модельные мясные системы, содержащие манную крупу, пшеничную муку (массовая доля белка 9-10%), пшеничную муку с повышенным содержанием белка (не менее 22 %), тек-стурированную пшеничную муку (массовая доля белка 9-10%), текстурирован-ную пшеничную клейковину(массовая доля белка около 68 %), а также готовые мясные продукты, купленные в торговой сети, в рецептуре которых использовались пшеничные ингредиенты. Исследования проводили гистологическим, гистохимическим и иммуногистохимиче-ским (ИГХ) методами.

Гистологический анализ осуществляли согласно методике ГОСТ 19496-2013 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования», срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и 1% водно-спиртовым раствором эозина (ГЭ), а также раствором йода (РЙ). Гистохимическую окраску проводили, применяя красители Calleja (Cal), PAS Calleja (PC) и метиленовый синий (МС). Срезы образцов толщиной 14-16 мкм изготавливали на микротом-криостатате "MIKROM -HM525" (Microm International GmbH, Германия). Для ИГХ анализа образцы

Рисунок 1. Микроструктура манной крупы. Фрагмент алейронового слоя

(ГЭ, об.40х)

заключали в парафин по общепринятой методике [4], срезы толщиной 7-10 мкм изготавливали на ротационном микротоме Microm HM 325 (Microm International GmbH, Германия), далее окрашивали с использованием системы детекции REVEAL (Biovitrum) [8]. Антитела против пшеницы применяли фирмы Sigma в рабочих титрах, рекомендованных производителем.

Анализировали гистологические препараты на световом микроскопе «Axio Imaiger A1» (Carl Zeiss, Германия). Последующую обработку изображений осуществляли с применением компьютерной системы анализа Axio Vision 4.7.1.0. Для получения достоверных результатов эксперименты повторяли не менее 3-х раз при 3-5-кратной повторности анализов каждого из образцов.

Результаты исследования и их обсуждение

Определение пшеничных компонентов с разной степенью измельчения, таких как манная крупа и мука, микроструктурными методами в первую очередь основано на обнаружении на гистологических препаратах структур, характерных для зерновки пшеницы: клеток алейронового слоя и клеток эндосперма. Алейроновый слой находится под семенной оболочкой и составляет 6,5-9,5% массы зерновки. Входящие в его состав клетки, расположенные в один слой, содержат алейроновые зерна - особые белковые образования, представленные у некоторых видов и сортов пшеницы в виде кристаллов с вкрапленными между ними мельчайшими капельками жира. Эндосперм занимает центральную часть зерновки и составляет 83,0-85,0 % ее массы.

В результате проведенных исследований было выявлено, что клетки алейронового слоя прямоугольной формы имеют толстую клеточную стенку, их размер составляет 30-60 мкм (рисунок 1). При окрашивании гематоксилином-эозином клеточная стенка остается неокрашен-

Рисунок 2. Микроструктура пшеничной муки. Фрагмент эндосперма

(ГЭ, об.20х)

ной, а входящие в состав клеток зерна приобретают темно-красный цвет. Под алейроновым слоем располагаются крупные тонкостенные клетки разнообразной формы, размером 40-110 мкм (рисунок 2). Данные клетки занимают всю внутреннюю часть эндосперма и заполнены преимущественно разной величины крахмальными зернами округло-овальной формы с характерной впадиной вдоль зерна, в промежутках между которыми находятся белковые вещества. Часть клеток эндосперма в результате помола разрушаются, поэтому на препарате можно обнаружить отдельно лежащие крахмальные зерна, которые отчетливо видны на препаратах, окрашенных раствором йода, приобретают коричневый цвет, а также PAS Calleja - окрашиваются в лилово-розовый цвет (рисунок 3).

При изучении текстурированной пшеничной муки было установлено, что основная часть компонента окрашивается эозином в бледно-розовый цвет и включает в свой состав более плотные интенсивно окрашенные в красный вкрапления (рисунок 4). При окрашивании раствором йода основная часть приобретала темно коричневый цвет, а при окраске PAS Calleja - лилово-розовый (рисунок 5), что говорит о ее полисаха-ридном происхождении. В общей массе компонента хорошо прослеживалась слоистость. Плотные белковые вкрапления окрашивались метиленовым синим (рисунок 6), а также Calleja в зеленоватый цвет.

Текстур и ро ванная клейковина характеризовалась губчатой структурой с многочисленными порами, окрашиваемой эозином и метиленовым синим в соответствующие цвета (рисунок 7). Кроме того, при окраске раствором йода и PAS Calleja в белке выявлялась углеводная составляющая (рисунок 8).

Полученные данные согласуются с работами Rezácová Z. Lukásková (2011) [15] и B. Tremlová (2002) [18]. Гистологические и гистохимические методы окрашивания

Рисунок 3. Микроструктура пшеничной муки. Крахмальные зерна

(PC, об.20х)

2017 i №5 все о мясе

Рисунок 4. Микроструктура текстурированной пшеничной муки (ГЭ, об.20х)

.-Г4*»1 . SV • с ■

л-' . а ■■ ' •

■J .

* - .:■

step • -

M

Рисунок 5. Микроструктура текстурированной пшеничной муки (PC, об.20х)

Рисунок 6. Микроструктура текстурированной пшеничной муки (МС, об.20х)

е

kwf

ш 1> w

- ж

Рисунок 9. Микроструктура пшеничной муки (ИГХ, об.20х)

позволяют лишь косвенно определять присутствие пшеничного белка, а технологическая обработка продукта, способствующая изменению структуры клеток и крахмальных зерен, может существенно затруднить проведение идентификации.

Для таких случаев был адаптирован метод иммуногистохимического анализа, когда окрашиванию подвергается только выявляемый белковый компонент [8]. Данный метод обладает высокой специфичностью и позволяет проводить дифференциацию пшеничных белков от других ингредиентов мясного продукта. При ИГХ анализе выявление пшеничного белка основано на визуализации образующегося комплекса «белок - антитело» за счет хромогена (ди-аминобензидина), который придает ему коричневый цвет. На гистологических препаратах окрашиванию подвергается только идентифицируемый компонент - белок (рисунок 9).

Выводы

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены основные микроструктурные характеристики пшеничных компонентов, используемых в производстве мясных продуктов. При идентификации пшеничной муки в первую очередь следует обращать внимание на характерные клетки алейро-

3. Захарова, И.Н. Целиакия у детей: решенные и нерешенные вопросы этиопатогенеза / И.Н. Захарова, Т.Э. Боровик, Е.А. Рославцева, Е.Н. Андрюхина, Ю.А. Дмитриева, Ф.С. Дзебисова // Вопросы современной педиатрии. — 2011. — Т. 10. — № 4. — С. 30-35.

7. Подвойская, И.А. Новые изоляты растительных белков [Электронный ресурс] — Режим доступа: http:// www.protein.ru/userimages/pdf/005.pdf (Дата обращения 31.08.2017).

Zaharova, I.N. Celiakiya u detej: reshennye i nereshennye voprosy etiopatogeneza [Celiac disease in children: solved and unsolved questions of aetiopathogenesis] / I.N. Zaharova, T.Je. Borovik, E.A. Roslavceva, E.N. Andrjuhina, Ju.A. Dmitrieva, F.S. Dzebisova // Voprosy sovremennoj pediatrii [Current pediatrics]. — 2011. — T.10. — № 4. — P. 30-35.

Podvojskaya, I.A. Novye izoljaty rastitel'nyh belkov [New isolates of plant proteins] [Elektronnyj resurs] — Rezhim dostupa: http://www.protein.ru/userimages/pdf/005.pdf (Data obrashheniya 31.08.2017).

8. Пчелкина, В.А. Применение иммуногистохимическо- Pchelkina, V.A. Primenenie immunogistoximicheskogo го анализа для выявления пшеничного белка в соста- analiza dlya vyyavleniya pshenichnogo belka v sostave my-ве мясных продуктов/ В.А. Пчелкина //Вестник РГАУ asnyx produktov [Application of immunohistochemistry for им. П.А. Костычева. — 2017. — № 2(34). — С. 48-53. detection of wheat protein in meat products] / V.A. Pchelkina // Vestnik RGAU im. P.A. Kostycheva. — 2017. — № 2 (34). — Р. 48-53.

9. Сарафанова, Л.А. Современные пищевые ингредиенты. Особенности применения / Л.А. Сарафанова. -СПб.: Профессия, 2009. - 208 с. Sarafanova, L.A. Sovremennye pishhevye ingredienty. Oso-bennosti primenenija [Modern food ingredients. Application features] / L.A. Sarafanova. — SPb.: Professija, 2009. — 208 p.

4. Иммуногистохимические методы: Руководство / Immunogistokhimicheskie metody: Rukovodstvo [ImmunoEd. byG. Kumaretal.: DAKO / Пер. с англ. под ред. histochemical methods: Manual] / Ed. by G. Kumar et al.: Г.А. Франка и П.Г. Малькова. — М. — 2011. — 224 с. DAKO / Per. s angl.pod red. G.A. Frankai P.G. Mal'kova. — M. — 2011. — 224 p.

5. Лусс, Л.В. Пищевые аллергены и пищевые добавки: роль в формировании пищевой аллергии и пищевой непереносимости / Л.В. Лусс // Эффективная фармакотерапия. - 2014. - № 33. - С. 12-19. Luss, L.V. Pishchevye allergeny i pishchevye dobavki: rol' v formirovanii pishchevoi allergii i pishchevoi neperenosimosti [Food allergens and food additives: a role in the formation of food allergies and food intolerance] / L.V. Luss/ // Effek-tivnaia farmakoterapiia. — 2014. — № 33. — P. 12-19.

6. Плотников, Д.А. Анализ влияния дополнитель- Plotnikov, D.A. Analizvlijanija dopolnitel'nyh belkov v recep-

ных белков в рецептуре мясных продуктов на ture mjasnyh produktov na potrebitel'skie svojstva mjasnoj

потребительские свойства мясной гастрономии / gastronomii [Analysis of influence of additional proteins in

Д.А. Плотников, О.В. Рявкин, О.И. Сорокалетов // the recipe of meat products on consumer properties meat

Инновации и продовольственная безопасность. — hospitality]/ D.A. Plotnikov, O.V. Rjavkin, O.I. Sorokaletov

2017. — № 1(15). — С. 22-27. // Innovacii i prodovol'stvennaja bezopasnost. — 2017. —

№ 1(15). — Р. 22-27.

нового слоя и клетки эндосперма, заполненные крахмальными зернами. Пшеничная текстурированная мука хорошо окрашивается PAS Calleja. Особенностью текстурированной клейковины является губчатая структура с вкраплением крахмальных зерен. Гистологические и гистохимические методики окрашивания целесообразно применять в совокупности, так как они основаны на выявлении и белковой, и углеводной составляющих. Наиболее чувствительным и надежным является ИГХ анализ.

Современные микроструктурные методы являются эффективными и во многих случаях незаменимыми инструментами, так как позволяют определять различные компоненты мясных продуктов, идентифицировать белки-аллергены, выявлять случаи фальсификации.

© контакты:

Пчелкина Виктория Александровна a pchelkina@vniimp.ru

рынок масА

И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ

ПОДПИСКА

2018

Справки по тел: +7 (495) 676-95-68

Периодичность выхода обзора - ежемесячно.

Стоимость

годовой

подписки:

Подписка осуществляется с любого номера журнала.

3300 руб. (включая НДС),

бумажный носитель. 3540 руб. (включая НДС),

электронный носитель.

Телефон редакции:

+7 (495) 676-95-68 Сайт: www.vniimp.ru E-mail: journal@vniimp.ru, las@vniimp.ru, gordeev@vniimp.ru

Бесплатная доставка в любой город России и ближнего/дальнего зарубежья. Подписавшись на наши журналы, Вы получите возможность в числе первых узнавать о последних достижениях отраслевой науки, находить оптимальные решения для своих практических задач.

Электронная версия журнала: www.elibrary.ru Адрес: 109316, Москва, Талалихина, 26, ком. 205

Мы работаем для Вас!

Для того, чтобы подписаться на журнал, Вам достаточно отправить заявку на электронную почту редакции:

journal@vniimp.ru, las@vniimp.ru, gordeev@ vniimp.ru

2d17 | №5 все о мясе