Научная статья на тему 'Разработка иммуногистохимического метода выявления соевых белков в мясных продуктах'

Разработка иммуногистохимического метода выявления соевых белков в мясных продуктах Текст научной статьи по специальности «Прочие технологии»

CC BY
122
21
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Все о мясе
ВАК
Область наук
Ключевые слова
ИММУНОГИСТОХИМИЯ / IMMUNOHISTOCHEMISTRY / СОЕВЫЕ БЕЛКИ / SOY PROTEINS / МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ / MEAT PRODUCTS / HISTOLOGY ASSAY / ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Аннотация научной статьи по прочим технологиям, автор научной работы — Пчелкина В.А.

Актуальной задачей как в России, так и во всем мире является разработка высокоспецифичных методов идентификации состава мясных продуктов и выявления соевых белков. Объектами исследования являлись модельные мясные системы, содержащие соевый изолят, концентрат и текстурат. Для их выявления использовали гистологический анализ и иммуногистохимический безбиотиновый метод. При традиционной гистологической окраске гематоксилином и эозином соевые белки окрашиваются как мышечные в красный цвет. Это затрудняет применение компьютерных систем анализа изображения. При иммуногистохимическом анализе окраске подвергается только выявляемый соевый компонент. Его визуализации происходит за счет хромогена (в нашем исследовании диаминобензидин), который придает ему коричневый цвет. Это предоставляет возможность широкого применения системы анализа изображения для проведения морфометрического анализа.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по прочим технологиям , автор научной работы — Пчелкина В.А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DEVELOPMENT OF IMMUNOHISTOCHEMISTRY DETECTION OF SOY PROTEINS IN MEAT PRODUCTS

Important task both in Russia and around the world is development of high specific methods for identification the composition of meat products and detection of soy proteins. The objects of study were model meat systems containing soy isolate, concentrate and texturate. For their detection we used histology assay and immunohistochemistry biotin-free method. Soy proteins are stained as muscle ones in red when we used traditional histological staining by hematoxylin and eosin. Therefore, computer image analysis systems possess not enough resolution capability. When we used immunohistochemical assay only soy protein component are stained. Its visualization is due to the chromogen (in our study its diaminobenzidine), which gives it a brown color. Hence image analysis is suitable for morphometry assay.

Текст научной работы на тему «Разработка иммуногистохимического метода выявления соевых белков в мясных продуктах»

УДК 637.5.07 Ил. 6. Библ. 11.

РАЗРАБОТКА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ СОЕВЫХ БЕЛКОВ В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Пчелкина В.А., канд. техн. наук ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова»

DEVELOPMENT OF

IMMUNOHISTOCHEMISTRY DETECTION OF SOY PROTEINS IN MEAT PRODUCTS

Pchelkina V.A.

The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute

Ключевые слова:

иммуногистохимия, соевые белки, мясные продукты, гистологический анализ

Реферат.

Актуальной задачей как в России, так и во всем мире является разработка высокоспецифичных методов идентификации состава мясных продуктов и выявления соевых белков. Объектами исследования являлись модельные мясные системы, содержащие соевый изолят, концентрат и текстурат. Для их выявления использовали гистологический анализ и имму-ногистохимический безбиотиновый метод. При традиционной гистологической окраске гематоксилином и эозином соевые белки окрашиваются как мышечные в красный цвет. Это затрудняет применение компьютерных систем анализа изображения. При иммуноги-стохимическом анализе окраске подвергается только выявляемый соевый компонент. Его визуализации происходит за счет хромогена (в нашем исследовании - диаминобензидин), который придает ему коричневый цвет. Это предоставляет возможность широкого применения системы анализа изображения для проведения морфометрического анализа.

Введение

Растительные белки в мясной промышленности занимают важное место из-за их высоких функционально-технологических свойств, положительного влияния на органолептические и биологические характеристики мясных продуктов. Немалое значение имеют экономические показатели производства. Во всем мире, источниками растительного белка являются: 26 % пшеница, 18 % кукуруза, 15 % рис, 15 % соя и 26 % другие растения [5].

В России соевые бобы в рецептурах колбас используют с начала 40-х годов прошлого столетия. Соевые белковые компоненты, используемые в мясной промышленности, в зависимости от содержания белка,

Keywords:

immunohistochemistry, soy proteins, meat products, histology assay

Summary.

Important task both in Russia and around the world is development of high specific methods for identification the composition of meat products and detection of soy proteins. The objects of study were model meat systems containing soy isolate, concentrate and texturate. For their detection we used histology assay and immunohistochemistry biotin-free method. Soy proteins are stained as muscle ones in red when we used traditional histological staining by hematoxylin and eosin. Therefore, computer image analysis systems possess not enough resolution capability. When we used immunohistochemical assay only soy protein component are stained. Its visualization is due to the chromogen (in our study its diaminobenzidine), which gives it a brown color. Hence image analysis is suitable for morphometry assay.

жира и углеводов подразделяют на соевую муку, соевый концентрат и соевый изолят. Кроме того, используют текстурированные соевые белки. При переработке питательная ценность и химическая структура белка сои не изменяется, а изменяется лишь физическая форма.

Для выявления соевых компонентов в составе мясных продуктов применяется микроструктурный анализ. Во ВНИИМП был разработан ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» [3], однако он не всегда может дать однозначный ответ, так как применяемая методика окрашивания гистологического препарата не обладает высокой специфично-

стью [11]. В связи с этим требуется разработка новых высокоспецифичных и чувствительных методов.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод - метод выявления локализации клеточного или тканевого компонента-антигена при помощи объединения преимущества традиционных гистологических методов с чувствительностью иммунологических [2].

Основной принцип иммуногистохимии был предложен более 80 лет назад и заключался в том, что в качестве гистохимических реагентов используют антитела с присоединенным флуоресцентным маркером. Albert Coons в 1941 году впервые получил антитела, меченые флюоресцеином, и применил их в диагностических целях. В 1966 году были разработаны методы использования антител, конъюгированных ферментами. Независимые исследования провели P.K. Nakane с соавторами и S. Avrameas с соавторами. В 1970 году L.A. Sternberger изобрел пероксидазно-ан-типероксидазный метод, который получил широкое распространение. В конце реакции антиген-антитело для визуализации энзиматических маркеров проводят гистохимическую реакцию, в результате которой фермент становится видимый на световом уровне [4].

В последние годы применение иммуногистохими-ческого анализа в морфологии широко развивалось. Это связано с разработкой новых методов фиксации тканей, конъюгации антител, демаскирования антигенов, а также использованием новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии [7].

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом с последующим формированием комплекса «антиген-антитело». Антиген - вещество, которое при попадании в ткани восприимчивого организма вызывает иммунный ответ, приводящий к формированию специфических антител, связывающихся с данным веществом. Антигенами являются высокомолекулярные белки и полисахариды, реже - полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты [8].

Важным этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген-антитело». Выявить антитела, связавшиеся с антигеном, можно используя различные метки, среди которых наибольшее распространение получили ферментные.

В настоящее время наиболее широко используются два ИГХ метода исследований [1]:

1 - высокочувствительный трехступенчатый метод, основанный на формировании авидин-биотинового комплекса (АВС-метод) - на первом этапе немеченые первичные тела соединяются с антигеном, на втором этапе меченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными, на третьем добавляется комплекс авидин-биотин-фермент, который присоединяется к биотину вторичных антител. Преимущества данного метода состоят в том, что при использовании вторичных антител во много раз повышается чувствительность определения антигена; для проведения метода требуется меньшее количество антител; использование авидин-биотинового комплекса возможно в

течение нескольких дней. Недостатками этого метода являются, во-первых, сложность и длительность постановки реакций, а во-вторых, необходимость большого количества дорогостоящих реактивов.

2 - безбиотиновый метод с использованием муль-тимерной системы детекции - комплекс антиген-антитело выявляется гистохимической реакцией, включающей хромоген, который специфически реагирует с молекулами фермента (энзима), входящими в состав наборов для визуализации. Маркерный фермент взаимодействует со вторичным антителом при помощи небольших линейных молекул - мультимерных линкеров. Чувствительность данной системы очень высока, что достигается за счет связывания каждого вторичного антитела с несколькими молекулами фермента, малым размером мультимерных молекул, а также высокочувствительными хромогенами. Небольшой размер линкеров увеличивает специфичность, позволяя добиваться более контрастного изображения за счет локального связывания мультимерного комплекса с выявляемыми антигенами. Таким образом, данный метод обеспечивает высокое качество визуализации, отсутствие неспецифического связывания и контрастность изображения на хорошем уровне.

За рубежом иммуногистохимические и иммуно-флюоресцентные методы используются для определения состава мясных продуктов и идентификации компонентов [6, 9]. В Чехии АВС-метод был разработан для обнаружения небольших количеств соевых белков в составе пищевых продуктов [10]. В России ИГХ методы применяются только в ветеринарии и медицине при патологоморфологических исследованиях.

Материалы и методы

В своей работе мы остановились на безбиотиновом методе, как более быстром и подходящем для экспресс-анализа мясного продукта.

Объектами исследования являлись модельные мясные системы, содержащие соевые белковые компоненты (соевый изолят, концентрат и текстурат).

Изготовление срезов осуществляли с использованием микротом-криостатата М1КИОМ - НМ 525 (Германия).

Протокол иммуногистохимической окраски:

(1) высокотемпературная демаскировка антигена в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 20 минут;

(2) обработка срезов раствором перекиси водорода (Н2О2) 0,3 %, инкубация 10 мин при комнатной температуре;

(3) обработка раствором бычьего сывороточного альбумина (0,5 % БСА) с добавлением казеина (0,1 %) в фосфатном буфере (рН 7,6) для блокировки сайтов неспецифического связывания, инкубация 10 минут при комнатной температуре;

(4) добавление первичного антитела, инкубация 2 часа при 37 оС;

(5) обработка вторичным антителом, меченным пероксидазой хрена, инкубирование 15 минут при комнатной температуре;

(6) добавление раствора хромогена, инкубирование 5 минут при комнатной температуре;

(7) фоновая (контрастирующая) подкраска гематоксилином в течение 1 минуты (если требуется);

(8) заключение среза под покровное стекло.

Также срезы традиционно окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии с ГОСТ 31796 - 2012 «Мясо и мясные продукты. Ускоренный метод определения структурных компонентов состава».

Изучение гистологических препаратов проводили на световом микроскопе AxioImaiger A1 (Carl Zeiss, Германия) с помощью подключенной видеокамеры AxioCam MRc 5 с применением компьютерной системы анализа изображений AxioVision 4.7.1.0, адаптированной для гистологических исследований.

Результаты исследования и их обсуждение

Цель работы - разработка безбиотинового имму-ногистохимического метода выявления соевых белковых компонентов в составе мясного сырья. В качестве контрольных образцов выступали срезы, окрашенные традиционными красителями: гематоксилином и эозином.

Соевый изолированный белок на препарате, окрашенном гематоксилином и эозином, выявляется в виде отдельных более или менее округлых частиц, окрашенных эозином в красный цвет, характерной особенностью которых является довольно сложная структурированность, сочетающая множественные наложенные друг на друга кольца с небольшими каплевидными пустотами внутри (рисунок 1).

Соевые концентраты на гистологическом срезе идентифицируются как группы клеток с выраженной эозинофилией, отделенные друг от друга неокрашенными прослойками целлюлозы. Клетки могут быть ориентированы на гистологических срезах как в продольном, так и в поперечном направлениях относительно длинной оси клеток (рисунок 3).

Соевые текстураты характеризуются слоистой белковой структурой, составляющей его основную часть и зернистым компонентом, заполняющим пространство между слоями фибрилл. Фибриллярные слоистые белковые структуры и зернистый компонент окрашиваются в красно-розовый цвет с фиолетовым оттенком различной интенсивности. Также на препарате присутствуют комплексы растительных клеток оболочки соевого боба, содержащих значительное количество целлюлозы и не воспринимающие красители (рисунок 5).

При этом следует отметить, соевые белки окрашиваются в те же цвета, что и мышечные, что хорошо видно на представленных рисунках, а это существенно затрудняет применение систем анализа изображения.

При иммуногистохимическом окрашивании выявление соевого белка основано на его визуализации за счет хромогена (в нашем исследовании в роли хромогена выступал диаминобензидин), который придает ему коричневый цвет (рисунок 2, 4, 6). При этом окраске подвергается только идентифицируемый компонент, т.е. соевый белок, а другие ингредиенты остаются не окрашенными.

Рисунок 1. Соевый изолят, окраска гематоксилином и

эозином (об. х20).

Рисунок 2. Соевый изолят, ИГХ окрашивание (об. х20).

Рисунок 3. Соевый концентрат, окраска гематоксилином и эозином (об. х20).

Рисунок 4. Соевый концентрат, ИГХ окрашивание (об. х20).

Рисунок 5. Соевый тексту- Рисунок 6. Соевый тексту-рат, окраска гематоксилином рат, ИГХ окрашивание (об. и эозином (об. х20). х20).

При разработанном ИГХ методе достигается хорошее контрастирование среза, что дает возможность применения компьютерной системы анализа изображения для количественной оценки содержания выявляемого соевого белкового компонента в автоматическом режиме.

На следующем этапе работы будут проведены исследования по определению влияния технологических режимов обработки сырья на проведение ИГХ исследования и выявление входящих в состав соевых белков в готовых мясных продуктах, представленных на продовольственном рынке.

© КОНТАКТЫ:

Пчелкина Виктория Александровна +7(495)676-6971; +7(495)676-9231 a pchelkina@vniimp.ru

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by G. Kumar et al.:DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова. - М. - 2011. - 224 с.

2. Полак, Дж. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы / Дж. Полак, С. Ван Норден. - М.: Мир. - 1987. - С. 9-22.

3. Пчелкина, В.А. Практические аспекты применения ГОСТ 31474-2012 «Мясо и мясные продукты. Гистологический метод определения растительных белковых добавок» / В.А. Пчелкина, С.И. Хвыля //Техника и технология пищевых производств. - 2015. - №3.- С. 50-54

4. Райхлин, Н.Т. История иммуногистохимии / Н.Т. Райхлин, С.В. Петров, И.Н. Чаофиин /Н15 ich. Нуководство по иммуног истохимичеспой диагтоитмнс опухилейуеуомека./ Ппд ред. С.В. ПетрсмтИ /Н.Т. Оайхуина. м Казаем. н 2000. н С. 1M-1И.

5. Хвыля, П.И. ОмоНенности микроотууктуры соевых белтомых протмктов, применяемхч в мясной промышле чнитни /С.И. Хвыля.м. А. 1мт елконаы С .С. 0урлаиннм // Пищевои промышлинчоути. - 201И.. № 10. - С. Ty-MJi.

6. Boutten, В. QuKnTificntioi уН soy jnr^.cíiecs lb). assoiia.ion oy immunohisOochemistry video image analysis / B. Boutten,

C. HumberI, M. Chelbi, I*. Di^^an^, D. Peynaud // foodci^d Agricultural Immunology -s 19^9. - Vol. 11. - P. BC-59.

7. Chilosi, M. A rap.. imnn/nocvainine method foe frozen sections / M. CMloei, M. Lyntani, S. Pedron. L. Mootagea. A. Benedetti, G. I)izn0e0/ f. Menestóne // Biotecli HicXochem. -1994. - 69j - t1. 235.

8. Dabbs, DJ, Diagnontic 2-n- ed. l

D.J. Dabbs. - Eisenier. - tOOS. - 8Г8 p.

9. Heitmai/io J. Nw^weK von Sojaprotein in erhitzten Hnitcherzeugnisien mit einem inpipekten Immunfluoreszyuz1ott S J. Heftmenn // ])ii^csc]g'w-Ir^^i;hB-ei. -1987. - № Pir. - С. Ч21-62П.

10. Potciech, M. ImmumoPistochemccal detection of soya protdz - optimisation and veriUcation of thg myChoS 1 M. Pospí-ch- B.Tremlová, e. Rencová, 1/1 RanduloH. ./ Czech Journal of FooI Sciences. c 2009. y /S- 27. - P. tS-19.

11.Pospien0, M. Micrescupk metiicds Sn iood anH.ysss / /.o-c^iieclt M., Reza cova-Lekatkovt Z., Orem-ypa В., RtnOuicya Z., Oarti t. // Мaso interooO/onal. - В/во. -2000. - Xol. 1. - P. 27-34.

REFERENCES:

1. Immunogistohimicheskie metody: Rukovodstvo [Immunohis-tochemical methods: Manual]. Ed. by G. Kumar et al.: DAKO. Per. s angl. pod red. G.A. Franka, P.G. Mal'kova. Moscow, 2011, 224 p.

2. Polak Dzh., Van Norden S. Vvedenie v immunogistohimiju: sovremennye metody i problemy [Introduction to immunohis-tochemistry: modern methods and problems]. Moscow: Mir, 1987, pp. 9-22.

3. Pchelkina V.A., Khvylia S.I. Prakticheskie aspekty prime-neniia GOST 31474-2012 «Miaso i miasnye produkty. Gistolog-icheskii metod opredeleniiarastitel'nykh belkovykh dobavok» [Practicalaspects of the GOST 31474-2012 «Meat and meat products. Histolrgical method ef ideotification aOpknt protein a(o^itc've3»] Food Processing: Itechniqusiand Teclinology, 2015,

cm ii]p.a0]5'i

4. Raihiln N.T., Pitrov S.V. Charrf in LNo is-orija immunogisto-

lcte'^c^^^ of immuoohistoshem istry] In the book «Ru-koveds»vo po hiimunog^tohimichetkoj duv^iosUke opuholej t;lielev^]tti». Kazan] f OOP s»ti. »3.14.

». Chilosi M^Lestam l3[(, j9ed»rv S» Moitagna S..c lianedetti A., Pfzrofi GC Mencitrine F. A sapid immunosIainicTiiiTthod for frozef sections. OiotechaicOk HistochemisOry, 1994, vol. 69, p. 235. 6. Drbtt D.J. SiageoiPic imc^x^nciti^^ochemlilsyi O-nd ed. El-ccr»1 f0i6, 8C8 jn.

7„ KhvyHs v.I., Pche^rna VA^ Buokfava n^il[ Ooobennosti r^i1iiro^tru]k:'ci^r,r coefykh fri^llcoi^yltili f^i^odrktc^t^, poimeniae-n^^Iih v m(asnoicrnniyst1tTnesti[MtcrastrucIcral Statures of soyt>n^t^^i»s used in meet indutrhy]. gooiProoossine Industry, 20ici no-ft, pp. C4f5h.

8. Boctten V.i Humlert P» Clif^bt M„ Durvn» P., Ofyraud D. Qucntificatron of toy proteinc ty ccsodction oC immunohis-to»iceiniistttc vnd c[sdeo tmage onalpais. Food and Agficultural ^^mic^oloi^^, t^9c, so1.11, cp^iti-fi9.

9. Hcil^^o^ Jc Nachweic vc^ic 0ojanac^1^^ini^ si^^itzten Fleischer-zen4^irsp^n ^is ^^liam -pdiao^^i^n Immtpfluoreszenztest. F^i^iroi^«^iII^Iзllcft, ^^^i №1^7, i^r. »T4-620.

iI^eto^^(^vlS 1c.1 ^ lrv^l^ulova Z.

immcno^ifi:ii6l^omteal li^Io:r'iion ot soya protem - ^»tlmisation ti^^ l^^rif^c^Oion C^hv m^rliod. fv^g^^ [ournal e -Fcc^^ !>ciences,

rl.Posp^^f^h Me Z., nien^^t^va S^., Randu-

^^c^c OCcoro^^icoic ie^h^ah^(^(to in food analysis. Maso

international, Brno, 2011, vol. 1, pp.27-34.

МЯСНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ РОССИИ (ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ, БУДУЩЕЕ)

В 2016 году ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» выпустил книгу «МЯСНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ РОССИИ (ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ, БУДУЩЕЕ)». В книге рассмотрены все основные этапы становления и развития мясной отрасли в стране за весь период ее существования

(труд института под руководством Лисицына А.Б.). В книге отражены исторические аспекты переработки мяса в мире, даны показатели мясного производства в царской России.

Особое внимание уделено вопросам развития научно-технического прогресса в мясной промышленности, вопросам производства мяса и мясных продуктов в предвоенный период

(1917-1940 гг.), в годы Великой Отечественной войны. Приведены показатели по мясной отрасли народного хозяйства с 1946 по 1990 годы и в период 1991-2014 годы. Проанализированы основные направления развития мясной отрасли АПК до 2025 года.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.