CC BY
5Вестник РГАТУ, № 2 (34), 2017
tj
Vestnik RGATU, 2015. - №2. - S.21-27.
14. SHCHurA.V. EHkologicheskieosobennostimikrobiotypochvvusloviyakhradioaktivnogozagryazneniya territorii Respubliki Belarus' pri primenenii biologicheski aktivnykh preparatov [Tekst] / A.V. SHHur, D.V. Vinogradov, G.D. Gogmachadze //AgroEHkolnfo. - 2016, №1 (23) [http://agroecoinfo.narod.ru/journal/]
15. Byshov N.V. Peculiarities of spring rape harvesting in Russian Non-Blak soil Zone / N.V. Byshov, D.V. Vinogradov, I.A. Verteletskiy // International Student Scientific Multilingual Journal of Agri Ibrahim Qegen University (ISJICUA) Vol. 2, 2015, p. 14-22.
УДК 637.5:57.083.3:611.018
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПШЕНИЧНОГО
БЕЛКА В СОСТАВЕ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
ПЧЕЛКИНА Виктория Александровна, канд. техн. наук, ст. научн. сотрудник экспериментальной клиники-лаборатории биологически активных веществ животного происхождения, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М. Горбатова», pchelkina@vniimp.ru
Работа направлена на изучение возможностей применения иммуногистохимического (ИГХ) метода для исследования мясных продуктов с целью выявления пшеничного белка, являющегося аллергеном. Объекты исследования: модельные мясные системы, содержащие пшеничную муку в концентрациях 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 %; готовые мясные продукты, купленные в торговой сети. Выявление пшеничного белка проводили в соответствии со стандартизованным гистологическим методом с использованием красителей - гематоксилина Эрлиха и эозина, а также ИГХ методом с использованием мультимерной системы детекции и антител против пшеницы. Для фонового контрастирования среза при ИГХ анализе дополнительно применяли окраску ин-дигокармином по методу Calleja, толлуидиновым синим и гематоксилином Эрлиха. Установлено, что ИГХ метод является более специфичным по сравнению с гистологическим анализом. На препаратах окраске подвергается только искомый компонент (белковая часть пшеничной муки), который приобретает коричневый цвет за счет хромогена (диаминобензидина). При гистологической окраске белковая часть пшеничной муки окрашивается эозином в красный цвет, а углеводная часть (крахмал) остается неокрашенной. Такая окраска не является специфичной и характерна для муки, полученной из любого вида растительного сырья. Разница заключается в структуре крахмальных зерен, входящих в состав клеток, которая теряется после технологической обработки продукта. Достоверное обнаружение пшеничного белка ИГХ методом возможно при концентрации искомого компонента от 0,1 % и более. При концентрации 0,05 % частицы белка встречаются в отдельных случаях или не на всех срезах. При исследовании готовых мясных продуктов ИГХ анализ показал большую чувствительность, что позволяет использовать данный метод в спорных случаях, когда традиционная гистологическая окраска не может дать однозначный ответ о содержании пшеничного белка в составе мясного продукта.
Ключевые слова: гистология, иммуногистохимия, пшеничный белок, аллергены, мясные продукты, идентификация компонентов
Введение
В настоящее время в мясной промышленности России используются различные компоненты растительного происхождения. Значительно расширился ассортимент мясных продуктов, в рецептуре которых предусмотрены продукты переработки зерновых культур, которые обеспечивают высокую пищевую и биологическую ценность, способствуют повышению гибкости рецептуры, равномерному распределению ингредиентов и минимизируют потери. Традиционно в колбасном производстве применяют пшеничную муку и крупы (пшено, рис, перловую,
ячневую и др.). Пшеничную муку в небольших количествах (2-3%) используют для увеличения вязкости и влагоудерживающей способности фарша вареных, ливерных и других видов колбасных изделий. Пшеничная мука помимо углеводной составляющей также содержит в своем составе белок - глютен, который который может являться причиной развития пищевой аллергии и пищевой непереносимости (глютеновая энте-ропатия или целиакия) [1].
По данным Всемирной организации здравоохранения, в настоящее время около 40% населения в мире страдает аллергическими за-
© Пчелкина В. А., 2017г.
Сельскохозяйственные науки
болеваниями, среди них 2-7% взрослых людей и 7,5-13% детей имеют пищевую аллергию. Проявления атопии («аллергический марш») у генетически предрасположенных лиц начинаются, чаще всего, с симптомов пищевой аллергии, проявляющихся в раннем детстве. Данные симптомы могут быть со стороны желудочно-кишечного тракта в виде рвоты или диареи, могут реализоваться в коже (крапивница или атопический дерматит), реже - в верхних дыхательных путях (риноррея или астматический приступ). Самой тяжелой и потенциально опасной для жизни является анафилаксия, представляющая собой генерализованную аллергическую реакцию с развитием сосудистого шока, нередко приводящую к смертельному исходу. Пшеница относится к наиболее распространенным источникам пищевых аллергенов у детей [2].
Таким образом, выбор подходящих продуктов питания для людей, склонных к аллергическим реакциям, является актуальной проблемой, которой уделяется много внимания во всем мире. Для защиты таких потребителей разрабатываются различные аналитические методы, которые способны обнаруживать компоненты, вызывающие аллергические реакции. К сожалению, в пищевых продуктах определение аллергенов является сложной задачей: чаще всего они присутствуют в небольших, или даже следовых количествах; структура растительных белковых ингредиентов может быть существенно модифицирована в процессе технологического воздействия.
Основные требования к маркировке пищевых продуктов включены в законодательство ЕС и в Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 022/2-11 «Пищевая продукция в части ее маркировки». Список компонентов, употребление которых может вызвать аллергические реакции или вообще противопоказано при отдельных видах заболеваний, включает в себя 15 наименований, в том числе злаки, содержащие глютен, и продукты их переработки. При этом указывать данные компоненты в составе продукта необходимо независимо от их количества.
В России для выявления пшеничного белка (именно пшеничной муки) в составе мясных продуктов в настоящее время применяют методы гистологического анализа, которые основаны на идентификации компонентов в соответствии с их микроструктурными особенностями и тинктори-альными свойствами. Недостатком данного метода является, в первую очередь, низкая специфичность окрашивания, так как мука другого вида растения будет иметь схожие морфологические характеристики, а использование различных растительных компонентов в относительно небольших количествах в составе одного продукта существенно осложняет оценку.
В связи с вышеизложенным разработка нового высокоспецифичного и чувствительного метода выявления пшеничного белка является актуальной задачей. Одним из таких методов является иммуногистохимический (ИГХ) анализ, который объединяет преимущества традиционных гисто-
логических методов с чувствительностью иммунологических. В основе ИГХ лежит взаимодействие антигена с антителом и последующее образование комплекса «антиген-антитело». Антигеном является вещество, вызывающее при попадании в ткани восприимчивого организма иммунный ответ, приводящий к выработке специфических антител, которые будут связываться с данным веществом. Антигенами могут выступать высокомолекулярные белки и полисахариды, реже - полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты.
Основной принцип ИГХ был предложен более 80 лет назад и состоял в том, что в качестве гистохимических реагентов использовались антитела с присоединенным флуоресцентным маркером. Albert Coons в 1941 г. впервые получил антитела, меченые флюоресцеином, и применил их в диагностических целях. Позднее в 1966 году в результате независимых исследований, проведенных P.K. Nakane и S. Avrameas с соавторами, были разработаны ИГХ методы использования конъ-югированных ферментами антител. В 1970 году L.A. Sternberger изобрел пероксидазно-антиперок-сидазный метод, который в дальнейшем получил широкое распространение [3].
Важным этапом любого ИГХ анализа является визуализация результатов реакции «антиген-антитело», для этого используют различные метки, среди которых наибольшее распространение получили ферментные. В конце реакции взаимодействия антигена с антителом для выявления энзи-матических маркеров проводят гистохимическое окрашивание, результатом которого становится видимый на световом уровне фермент.
Применение ИГХ анализа в морфологии в последние годы широко развивалось, что связано с разработкой новых методов фиксации тканей, демаскирования антигенов, конъюгации антител, а также с использованием новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии [4, 5]. В России данные методы повсеместно применяются в ветеринарии и медицине при патологоморфологиче-ских исследованиях.
За рубежом ИГХ методы используют для определения состава мясных продуктов и идентификации растительных компонентов. В Чехии разработан ИГХ авидин-биотиновый метод для обнаружения небольших количеств соевых белков в составе пищевых продуктов, а также иммуноф-луоресцентный метод для выявления пшеничного белка [6, 7].
Сейчас наибольшее распространение приобретает безбиотиновый метод ИГХ с использованием мультимерных систем детекции. Комплекс антиген-антитело в результате гистохимической реакции выявляется за счет хромогена, который специфически реагирует с молекулами фермента, входящими в состав наборов для визуализации [8].
Таким образом, целью работы была адаптация ИГХ анализа на основе мультимерной (безбиоти-новой) системы детекции для исследования мясных продуктов и выявления входящего в состав
13-
Вестник РГАТУ, № 2 (34), 2017
пшеничного белка.
Объекты и методы
Объектами исследования в данной работе являлись модельные мясные системы, содержащие пшеничную муку в разных концентрациях (0,0l; 0,05; 0,10; 0,20; 0,50 и 1,00 %, контроль - без муки), а также готовые мясные продукты, купленные в торговой сети (20 образцов). Исследования проводили гистологическим и ИГХ методом.
Гистологический анализ осуществляли в соответствии с ГОСТ 19496 - 2013 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования». Срезы толщиной 14-16 мкм изготавливали на микротом-криостатате "MIKROM - HM525" (Microm International GmbH, Германия) и далее окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином.
Для ИГХ анализа образцы заключали в парафин по общепринятой методике, используя автоматический гистологический процессор TissueTek (Sakura, Япония). Далее на ротационном микротоме Microm HM 325 (Microm International GmbH, Германия) изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые монтировали на предметное стекло с адгезивным покрытием (Menzel-Glazer Polysine). С одного парафинового блока получали по три среза через интервал 50 мкм. После депарафи-низации срезов и демаскирования антигена с использованием цитратного буфера проводили ИГХ окрашивание с использованием системы детекции REVEAL (Biovitrum). Антитела против пшеницы применяли фирм Abnova и Sigma, в рабочих титрах, рекомендованных производителем.
Протокол ИГХ окрашивания: 1 - обработка срезов раствором перекиси водорода (H2O2) 0,3%, инкубация 10 мин при комнатной температуре; 2 - обработка раствором бычьего сывороточного альбумина (0,5% бСа) с добавлением казеина (0,1%) в фосфатном буфере (рН 7,6) для блокировки сайтов неспецифического связывания, инкубация 10 мин при комнатной температуре; 3 -добавление первичного антитела, инкубация при 37 оС 2 часа; 4 - обработка вторичным антителом, меченным пероксидазой хрена, инкубирование 15 мин при комнатной температуре; 5 - добавление раствора хромогена, инкубирование 5 мин при комнатной температуре; 6 - фоновая (контрастирующая) окраска в течение 1 мин; 7 - обезвоживание срезов; 8 - заключение среза под покровное стекло в полистирол.
Для подбора оптимального красителя для фонового контрастирования срезов использовали гематоксилин Эрлиха, толлуидиновый синий и ин-дигокармин по методу Calleja.
Анализ полученных гистологических препаратов осуществляли на световом микроскопе «Axiolmaiger A1» (Carl Zeiss, Германия) с подключенной видеокамерой «AxioCam MRc 5». Последующую обработку изображений производили с применением компьютерной системы анализа AxioVision 4.7.1.0. Для получения достоверных результатов эксперименты повторяли не менее 3-х раз при 3-5-кратной повторности анализов каждого из образцов по всем изучаемым параметрам.
Экспериментальная часть
В результате изучения препаратов, окрашенных гистологическим ИГХ методами, было установлено следующее. На гистологических препаратах опытных образцов присутствуют округлые частицы, внутри которых располагаются крахмальные гранулы, не воспринимающие окраску применяемыми красителями (гематоксилином и эозином), между ними находится белковый компонент муки, окрашенный эозином в розово-красный цвет (рис. 1). Данные структуры характерны для муки.
При ИГХ анализе выявление пшеничной муки основано на визуализации образовавшегося комплекса «белок муки - антитело» за счет хромогена (в нашем исследовании в роли хромогена использовался диаминобензидин), который придает ему коричневый цвет. На препаратах окрашивался только идентифицируемый компонент - белок пшеничной муки (являющийся антигеном), против которого использовали первичное антитело, а другие компоненты мясной системы остались не окрашенными (рис. 2).
Результаты по выявлению пшеничной муки в составе модельных мясных систем с разной концентрацией искомого компонента гистологическими и ИГХ методами в сравнении показали, что ИГХ окрашивание позволяет выявить искомый компонент в более низких концентрациях (табл. 1).
Таблица 1 - Сравнение гистологического и ИГХ методов при исследовании модельных мясных систем
Наименование образца Метод окраски
Гистологический ИГХ
ПМ 0,01 - +/-
ПМ 0,05 +/- +
ПМ 0,10 + +
ПМ 0,20 + +
ПМ 0,50 + +
ПМ 1,00 ++ ++
реакции;
«+/-» - результат недостоверен /пшеничная мука присутствует в единичных срезах; «+ »- пшеничная мука достоверно обнаружена в образце, но присутствует не во всех срезах; «++» - пшеничная мука достоверно обнаружена в образце, присутствует во всех срезах
Достоверное обнаружение пшеничной муки гистологическим методом возможно при концентрации искомого компонента от 0,10 % и более. При концентрации 0,05 % частицы муки встречаются в отдельных случаях или не на всех срезах, что затрудняет однозначную трактовку результатов. После термообработки образцов при температуре 75 оС изменений в выявлении пшеничной муки выявлено не было.
Сельскохозяйственные науки
Я
Рис. 1 - ПМ1^бкраска гематоксилином и эозином (об х20)
Также в ходе исследований был подобран оптимальный краситель для фонового контрастирования при ИГХ окрашивании. Наиболее контрастные срезы были получены с использованием индиго-кармина: мышечные волокна окрашивались в зеленый цвет, коллагеновая соединительная ткань - в синий, эластиновая - в желтый, пшеничный белок - в коричневый. При окраске гематоксилином ядра клеток окрашивались в темно-синий цвет, пшеничный белок - в коричневый, мышечные волокна приобретали фиолетовый оттенок. Использование толлуидинового синего не показало хороших результатов. Поскольку гематоксилин является традиционным красителем и не требует дополнительных работ при подготовке к окрашиванию, то для фонового контрастирования, в случае необходимости, можно использовать этот краситель.
При исследовании готовых мясных продуктов, купленных в торговой сети, были получены следующие результаты (табл. 2). Гистологический анализ выявил пшеничный белок в составе шести образцов. Такие же результаты показал и ИГХ метод. Следует отметить, что на этикетке пяти образцов была указана информацию о пшеничном белке или муке в составе продукта, а один образец такой информации не содержал, что свидетельствует о фальсификации
Таблица 2 - Результаты исследования мясных продуктов гистологическим и ИГХ методом на выявление пшеничного белка
№ образца Информация о пшеничном белке/муке на этикетке Метод окраски
Гистологический ИГХ
1 - - -
2 Мука пшеничная + +
3 Мука пшеничная + +
4 - - -
5 - - -
6 - - -
7 - - -
8 - - -
9 Мука + -
10 - + +
11 - - -
12 Мука пшеничная + +
2- ПМ1, ИГХ окрашивание (об. х20).
Продолжение таблицы 2
13 - - -
14 - - -
15 Мука пшеничная + +
16 - - -
17 - - +
18 Мука пшеничная + +
19 - - -
20 - - -
«-» - пшеничный белок не обнаружен; «+» - пшеничный белок обнаружен. В одном образце, в составе которого была указана «мука», гистологический анализ выявил частицы «муки», однако ИГХ с пшеничным антигеном дала отрицательный результат, это говорит об использовании муки другого растительного источника. В одном из образцов, при отрицательном результате гистологии, ИГХ окрашивание выявило пшеничный белок в незначительном количестве, а поскольку на этикетке информация о нем отсутствовала, то этот образец также относится к фальсифицированным.
Результаты и выводы Таким образом, в результате проведенных исследований иммуногистохимический метод был адаптирован для анализа компонентного состава мясных продуктов и выявления входящего в их состав пшеничного белка. Установлено, что применение мультимерных систем детекции для ИГХ позволяет получить хорошо окрашенные препараты за счет своей высокой чувствительности, что достигается связыванием каждого вторичного антитела с несколькими молекулами фермента. По сравнению с классическим гистологическим методом ИГХ анализ позволяет выявить искомый компонент в более низких концентрациях. Так как окраске подвергается только идентифицируемый компонент (являющийся в данной реакции антигеном), против которого используется первичное антитело, а другие компоненты мясной системы остаются не окрашенными, можно получить достоверный результат в спорных случаях, когда традиционное гистологическое окрашивание не дает однозначный ответ. Это говорит о высокой специфичности метода и позволяет проводить дифференциацию белковых компонентов, полученных из разных видов растительного сырья, имеющих схожую микроструктуру.
Вестник РГАТУ, № 2 (34), 2017
(J-
Список литературы
1. Колхир, П.В. Пищевые аллергены: классификация и характеристика / П.В. Колхир, Л.В. Лусс, И.В. Андреев // Физиология и патология иммунной системы. - 2005. - № 10. - С. 3-33.
2. Лусс, Л.В. Пищевые аллергены и пищевые добавки: роль в формировании пищевой аллергии и пищевой непереносимости / Л.В. Лусс // Эффективная фармакотерапия. - 2014. - № 33. - С. 1219.
3. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by G. Kumar et al.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова. - М. - 2011. - 224 с.
4. Chilosi, M. A rapid immunostaining method for frozen sections / M. Chilosi, M. Lestani, S. Pedron, L. Montagna, A. Benedetti, G. Pizzolo, F. Menestrine //
Biotech Histochem. - 1994. - №69. - p. 235.
5. Dabbs, D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. / D.J. Dabbs. - Elsevier. - 2006. - 828 p.
6. Pospiech, M. Immunohistochemical detection of soya protein - optimisation and verification of the method / M. Pospiech, B. Tremlovâ, E. Rencovâ, Z. Randulovâ // Czech Journal of Food Sciences. -2009. - №27. - P. 11-19.
7. Petrâsovâ, M. Immunofluorescent determination of wheat protein in meat products / M. Petrâsovâ, E. Zichovâ, M. Pospiech, B. Tremlovâ // Scientific Journal for Food Industry. - 2014. - vol.8. - №1. - P. 82-86.
8. Heras, A. Enhanced polymer detection system for immunohistochemistry / A. Heras, CM. Roach, ME. Key // Lab. Invest. - 1995. - 72. - p. 165.
APPLICATION OF IMMUNOHISTOCHEMISTRY FOR DETECTION OF WHEAT PROTEIN IN MEAT PRODUCTS
Pchelkina Viktoria A., candidate of technical sciences, senior research scientist, The V.M. Gorbatov's All-Russian Meat Research Institute, Moscow, Russia, pchelkina@vniimp.ru
The aim of the research work has been studying the possibilities of using the immunohistochemical assay (IHC) for examination meat products in order to identify wheat protein, which is an allergen. The objects of study were model meat systems containing wheat flour in concentrations of 0.01; 0.05; 0.1; 0.2; 0,5 and 1,0 %, meat products bought in the trade network. The detection of the wheat protein was carried out in accordance with a standardized histological method using stains Ehrlich hematoxylin and eosin and also using IHC the multimer detection system and anti-wheat antibodies. For background staining of the section in IHC assay applied indigo carmine by Calleja, toluidine blue and Ehrlich hematoxylin. It was found that IHC assay is more specific in comparison with histological method. Only the desired component (a protein part of wheat flour) is stained on the preparations, which get a brown color due to the chromogen (diaminobenzidine). At histological assay, the protein part of wheat flour is red with eosin, and the carbohydrate part (starch) is unstained. This staining is not specific and is characteristic of flour obtained from any kind of plant. The difference lies in the structure of the starch grains that make up the cells, which is lost after processing the product. A reliable detection of wheat protein by IHC is possible with a concentration of the component from 0.1 % or more. At a concentration of 0.05 %, protein particles are found in individual cases or not at all slices. The study of meat products showed IHC assay is greater sensitivity and it is possible to use this method for identification of components, when traditional histological staining cannot give an unambiguous answer about the content of wheat protein in the meat product.
Key words: histology assay, immunohistochemistry, wheat protein, allergens, meat products, identification of components.
Literatura
1. Kolkhir, P.V. Pishchevye allergeny: klassifikatsiia ikharakteristika/P.V. Kolkhir, L.V. Luss, I.V. Andreev// Fiziologiia i patologiia immunnoi sistemy. - 2005. - № 10. - P. 3-33.
2. Luss, L.V. Pishchevye allergeny i pishchevye dobavki: rol' v formirovanii pishchevoi allergii i pishchevoi neperenosimosti/L.V. Luss//Effektivnaia farmakoterapiia. - 2014. - № 33. - P. 12-19.
3. Immunogistokhimicheskie metody: Rukovodstvo / Ed. by G. Kumar et al.: DAKO / Per. s angl. pod red. G.A. Franka i P.G. Mal'kova. - M. - 2011. - 224 p.
4. Chilosi, M. A rapid immunostaining method for frozen sections / M. Chilosi, M. Lestani, S. Pedron, L. Montagna, A. Benedetti, G. Pizzolo, F. Menestrine // Biotech Histochem. - 1994. - №69. - p. 235.
5. Dabbs, D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. /D.J. Dabbs. - Elsevier. - 2006. - 828 p.
6. Pospiech, M. Immunohistochemical detection of soya protein - optimisation and verification of the method / M. Pospiech, B. Tremlova, E. Rencova, Z. Randulova // Czech Journal of Food Sciences. - 2009. -№27. - P. 11-19.
7. Petrasova, M. Immunofluorescent determination of wheat protein in meat products / M. Petrasova, E. Zichova, M. Pospiech, B. Tremlova //Scientific Journal for Food Industry. - 2014. - vol.8. - №1. - P. 82-86.
8. Heras, A. Enhanced polymer detection system for immunohistochemistry / A. Heras, C.M. Roach, M.E. Key //Lab. Invest. - 1995. - 72. - p. 165.
