Особенности структурной организации комплексов ДНК с белками HMGB1 и h1 Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 577.322.7+577.323.7+535.56+543.422.8 Всстник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 1

Е. В.Чихиржина*\ 3. Леоненко**\ X. Визер***\ Е. И. Костылева*\ В. И. Воробьев*\ Д. Крачб***\ М. Амрайн**\ О. В. Чихиржин*\ А. М. Поляничко

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КОМПЛЕКСОВ ДНК С БЕЛКАМИ HMGB1 И HI

Введение. Функционирование и хранение генетического материала в клеточном ядре тесно связано со структурной организацией хроматина, которую обеспечивают и различные «архитектурные» факторы [1-4]. К таким белкам прежде всего относятся линкерный гистон HI [5] и негистоновые белки семейства HMGB. Белок HMGB1 является одним из самых распространенных негистоновых белков хроматина [1]. Он принадлежит к суперсемейству белков, характеризующихся высокой электрофоретической подвижностью (High Mobility Group). Особый интерес представляют собой его ДНК-связывающие домены - HMGB-домены, обнаруженные во многих транскрипционных факторах [1,6, 7]. Следует отметить, что во всех белках HMGB в качестве ДНК-связывающего домена присутствуют только HMGB-домены.

Структурные аспекты взаимодействия HMGB1 и HI с ДНК существенны для понимания как функций HMGB1 в хроматине, так и структуры многокомпонентных функциональных ДНК-белковых комплексов. Известно, что оба белка связываются с ДНК на входе/выходе из нуклеосомы [8]. При этом гистон HI расположен таким образом, что он закрывает примерно 20 пар оснований ДНК [9, 10]. Он взаимодействует с ДНК по большой бороздке двойной спирали, в то время как белок HMGB1 - по малой. Некоторые авторы предполагают, что HI и HMGB1 конкурируют между собой за связывание с отдельными участками ДНК в хроматине [1, 11] и, таким образом, влияют на их функциональную активность.

К характерным особенностям системы ДНК-Н1 относится высокая степень агрегации комплексов даже при малом содержании белка. Агрегация молекул комплекса при взаимодействии ДНК с белком HMGB1 достигается при значительно больших количествах белка в комплексе. Однако отличительной особенностью комплексов ДНК с HMGB1 является возникновение упорядоченных структур в результате взаимодействия ДНК с этим белком [12-15]. В настоящей работе с помощью комбинации спектроскопических методов и атомной силовой микроскопии показано, что добавление белка HMGB1 в систему ДНК-Н1 приводит к упорядоченности молекул комплекса.

Материалы и методика эксперимента. Линкерный гистон HI (молекулярная масса М= 21 ООО Да) и негистоновый хромосомный белок HMGB1 (Д/= 26 500 Да) получены описанными ранее методами [12, 16]. Искусственные ДНК-белковые комплексы были приготовлены методом медленного прямого смешивания равных объемов растворов ДНК и белков HI и HMGB1 в 15 мМ NaCl (низкая ионная сила) и 150 мМ NaCl (высокая ионная сила). Концентрация ДНК в растворе комплекса составляла 20 мкг/мл. ДНК-белковые комплексы готовились исходя из весового соотношения г белок/ДНК в растворе в диапазоне от 0,25 до 2,0.

Институт цитологии РАН. г. Санкт-Петербург, Россия.

Факультет клеточной биологии и анатомии университета Калгари, г. Калгари, Канада.

Химический факультет университета Калгари, г. Калгари, Канада.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (фант № 05-04-49217), программы «Ведущие научные школы России» (грант № НШ-9396.2006.4), ФЦНТП по приоритетному направлению «Развитие инфраструктуры» (гос. контракт № 02.445.1 1.7338) с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях», Правительства Санкт-Петербурга (грант № РЭ06-1.4-55) и Санкт-Пстсрбургского научного центра (инициативный проект).

© Е. В. Чихиржина, 3. Лсонснко, X. Визер, Е. И. Костылсва, В. И. Воробьев, Д. Крамб, М. Амрайн, О. В. Чихиржин, А. М. Поляничко, 2007

Спектры кругового дихроизма (КД) представлены в виде разности поглощений лево- и правополя-ризованного света ДА (АА = Аь - AR). Для измерения КД и поглощения в ИК-диапазоне (ВКД) был использован прибор оригинальной конструкции на основе промышленного интерферометра ВОМЕМ, собранного по схеме Майкельсона, описанной ранее в работах Тсанкова с соавт. [17]. В экспериментах по атомной силовой микроскопии (АСМ) был применен микроскоп PicoScan, работающий в режиме магнитоэлектрических колебаний кантилевера с частотами собственных колебаний 20-55 кГц. Образец помещался на кремниевую подложку в водном растворе без дополнительных фиксирующих агентов.

Результаты и их обсуждение. С помощью биохимических и физико-химических методов были исследованы структурные изменения ДНК при одновременном взаимодействии с линкерным гистоном HI и негистоновым хромосомным белком HMGB1. Ранее было показано, что линкерный гистон HI на первых этапах структурной организации хроматина ком-пактизует ДНК [5, 18, 19]. Этот процесс сопровождается возникновением так называемого \|/-типа спектра КД (PSI - Polymer and Salt Induced) с интенсивной отрицательной (\\i~) или положительной (\\i+) полосой вблизи 270 нм. Ранее было показано, что ассоциация молекул ДНК-белкового комплекса при небольшом содержании HI незначительна, и спектр КД ДНК мало отличается от канонической В-формы [12, 19]. Увеличение концентрации белка в системе приводит к искажению спектра: появляется длинноволновый «хвост» и происходит сдвиг максимума полосы ДНК в длинноволновую область спектра (рис. 1, а). Характерной особенностью системы ДНК-Н1 является высокая степень агрегации комплексов даже при небольшом содержании белка, что затрудняет анализ кривых КД. Попытка визуализации

Рис. 1. Спектры КД ДНК-белковых комплексов в 150 мМ NaCl при разных весовых соотношениях белка и ДНК в растворе (приведено по [12]).

а - комплексы ДНК с гистоном HI тимуса крыс: / - 0, 2 - 0,5, 3 - 1,0, 4 - 1,75, 5 - 2,0; б - комплексы ДНК с белком HMGB1: 1 -0,2- 0,25, 3 - 0,5, 4 - 0,75.

комплексов ДНК-Н1 с помощью метода АСМ показала, что в этих условиях очень быстро образуются бесформенные конгломераты, типичные для интенсивной агрегации комплекса в растворе.

Более интересная картина получается при исследовании системы ДЫК-HMGBl. На рис. 1, б представлены спектры КД этой системы и процесс формирования частиц комплекса. Из рис. 1 видно, что при взаимодействии ДНК с белком HMGB1, в отличие от взаимодействия с гистоном HI, при тех же соотношениях белок/ДНК \|/-тип спектра КД ДНК не появляется даже в растворах с высокой ионной силой [13]. В этих условиях связывание белка с ДНК сопровождается очень незначительным понижением положительной полосы КД ДНК в области 270-280 нм, что обусловлено искажением локальной структуры ДНК в результате связывания белка по малой бороздке двойной спирали. Увеличение интенсивности отрицательного КД в области 220-230 нм с ростом концентрации белка в системе вызвано прежде всего взаимодействиями белок-белковой природы, которые в ходе дальнейшего комплексообразования играют существенную роль. Здесь наблюдается кооперативное взаимодействие между ДНК и HMGB1: новые молекулы белка садятся предпочтительно на участки ДНК, уже связанные с белком.

Наличие крупных частиц в растворе затрудняет анализ спектров КД в УФ-диапазоне. Поэтому при изучении рассматриваемых систем был применен комбинированный подход, основанный на одновременном использовании спектроскопии поглощения и КД в ИК-области, что позволяет проанализировать взаимодействие на уровне отдельных химических

Анализ данных АСМ подтверждает кооперативный характер связывания белка HMGB1 с ДНК. АСМ-изображение свободной ДНК иллюстрирует рис. 2. ДНК представляет собой отдельные вытянутые нити, расположенные на довольно большом расстоянии друг от друга. Из рис. 3, о и б видно, что при добавлении к ДНК малых количеств HMGB1 их взаимодействие носит одиночный и случайный характер. Распределение белка на молекуле ДНК при этом достаточно равномерное, о чем свидетельствуют частые изломы и постоянный диаметр нити. Однако с увеличением концентрации белка достаточно быстро начинается формирование характерных центров компактизации на молекуле ДНК (рис. 3, б). Белок предпочитает садиться на ДНК именно в этих точках. В данном случае под компактизацией мы понимаем сворачивание молекулы ДНК на саму себя с образованием более компактной структуры, в отличие от конденсации, т. е. ассоциации отдельных молекул комплекса. Интересно отметить, что на начальной стадии кооперативного взаимодействия центры компактизации расположены вдали друг от друга, и взаимодействие между ними полностью отсутствует. Одновременно с появлением центров компактизации заметно уменьшается количество изломов на ДНК в остальных областях. Поскольку изгиб нити ДНК в комплексе вызван ее взаимодействием с HMGB1, уменьшение изгибов, по нашему мнению, обусловлено перераспределением ранее связавшегося белка вдоль молекулы ДНК. Таким образом, на этой стадии мож-34

групп в составе макромолекул.

Рис. 2. АСМ-изображение свободной ДНК.

но одновременно наблюдать как области ДНК, свободные от белка, так и участки, из которых в дальнейшем формируются прототипы сложных надмолекулярных ДНК-белковых структур.

. .V Ч У _ Ч- . ' .

•:■■■ . -Л: : Л », •.

'У : уГ

,:>: .у

200 м»

Рис. 3. АСМ-изображение комплексов ДНК с белком НМСВ1 при постепенном увеличении его содержания в пробе.

Объяснение в тексте.

Дальнейший рост содержания НМОВ1 в пробе вызывает постепенное увеличение числа центров компактизации. Когда их количество становится настолько большим, что они оказываются в непосредственной близости друг от друга, начинается взаимодействие ДНК-белковых образований друг с другом. К этому моменту на ДНК практически не остается свободных от белка областей, и вся молекула приобретает вид крупнозернистого конгломерата (рис. 3, в), в структуре которого еще отчетливо различимы конденсированные домены. Продолжающееся связывание белка с этими конгломератами приводит к возникновению крупных агрегатов (рис. 3, г), в которых зернистая структура практически не различи-

ма, а поверхность становится менее твердой, и комплексы приобретают вид крупных бесформенных ассоциатов. Их дальнейшее взаимодействие между собой ведет к формированию еще более крупных структур, что проявляется оптически в виде рассеяния и КД таких растворов характеризуется vjz-типом спектра. Таким образом, помимо непосредственного взаимодействия ДНК-связывающих доменов, важную роль в формировании комплексов играют взаимодействия белок-белковой природы.

Совершенно особую картину мы получаем при исследовании тройного комплекса ДНК-Hl-HMGBl (рис. 4, 5). На начальном этапе взаимодействия при малом количестве HI и HMGB1 в комплексе (рис. 4, а) наблюдаются сильные изменения в белковой части спектра, что говорит о существенной роли каждого из белков при взаимодействии. Однако уже при г = 0,25 картина изменяется (рис. 4, б). Происходят сдвиг спектра в длинноволновую область и резкое увеличение интенсивности КД как белковой полосы при 220-235 нм, так и КД ДНК в интервале 270-285 нм. Спектр КД приобретает вид классического \|/-типа. Следует отметить, что при взаимодействии ДНК с гистоном HI и белком HMGB1 по отдельности такой спектр КД не получается даже при достаточно высоком весовом соотношении белок/ДНК.

При исследовании частиц, образующихся при одновременном взаимодействии ДНК с белками HI и HMGB1, методом АСМ наиболее интересным является случай формирования

9, мград. а б

Рис. 4. Спектры КД тройного комплекса ДИК-Ш-ИМвВ 1 при различном весовом соотношении белок/ДНК.

Объяснение в тексте.

комплекса при эквимолярных соотношениях HI и HMGB1. Следует отметить, что это соотношение - особая точка при образовании ДНК-белкового комплекса. Именно в данном случае наблюдалось формирование достаточно необычного по форме комплекса (см. рис. 5). При эквимолярных соотношениях HI и HMGB1 белки заставляют несколько спиралей ДНК переплетаться между собой (см. рис. 5, б). По всей видимости, ДНК-белковым фибриллам энергетически более выгодно образовывать тороидальные структуры, которые наблюдаются на изображении АСМ в виде ярких колец [20].

Рис. 5. АСМ-изображение тройного комплекса ДИК-Hl-HMGBl при эквимолярном соотношении гистона HI и белка HMGB1 1:1.

Сам характер взаимодействия обоих белков с ДНК по отдельности различен. Скорее всего при взаимодействии ДНК с гистоном HI происходит конденсация, т. е. ассоциация отдельных молекул комплекса, что приводит к образованию рыхлых надмолекулярных структур. В случае же белка HMGB1 наблюдается процесс компактизации, т. е. сворачивание полимерных молекул самих на себя, с последующим формированием упорядоченных надмолекулярных ДНК-белковых комплексов. Если же в системе присутствуют оба белка, то наблюдается образование ДНК-белковых фибрилл. Таким образом, добавление белка HMGB1 в систему приводит к появлению упорядоченности молекул комплекса: при этом структура ДНК-белкового комплекса является наиболее упорядоченной при эквимолярных соотношениях HMGB1 и HI.

Заключение. Полученные при комплексном подходе, основанном на использовании взаимно дополняющих друг друга методов, экспериментальные данные показали, что белок HMGB1 в системе ДНК-HMGBl-Hl связывается по малой бороздке ДНК, в то время как гистон HI стимулирует это взаимодействие, экранируя отрицательно заряженные группы сахарофосфатного остова и отрицательно заряженные остатки аспарагиновой и глютамино-вой аминокислот в HMGB1. Методом АСМ показано, что при взаимодействии ДНК с HMGB1 образуются высокоупорядоченные структуры. В системе ДНК-HMGBl-Hl наблюдалось образование структур, подобных фибриллам. Таким образом, действуя совместно, HI и HMGB1 стимулируют сборку высокоупорядоченных ДНК-белковых структур. При этом структурная организация таких комплексов зависит не только от ДНК-белковых взаимодействий, но и от взаимодействий белок-белковой природы.

Summary

Chikhirzhina E. V., Leunenko Z, Wieser //., Kosfyleva E. I., Vorobyev V. /., Cramb D., Amruin M., Chikhirzhin О. V., Polyanichko A. M. The peculiarities of the structural organization of the complexes of DNA with HI and HMGBI proteins.

The binding of linker histone HI together with non-histone chromatin protein HMGBI results in formation of large structurally ordered supramolceular complexes are shown using UV/FT1R absorbtion spectroscopy, electronic and vibrational circular dichroism and atomic force microscopy. Binding DNA in different grooves histone HI and HMGBI protein induce stronger distortions in DNA structure compared to their binary complexes. It is shown that in a narrow interval of protein/DNA ratios around r = 1,5 an abrupt transition to co-operative binding occurs, which results in formation of fibril-like DNA-protcin complexes.

Литература

1. Buslin M, Reeves R. H Proc. Nat. Acad. Sci. 1996. Vol. 54. P. 35-100. 2. Grosser K. D. II Trends Plant Sci. 1998. Vol. 3. P. 260-265. 3. Buslin M. II Mol. Cell Biol. 1999. Vol. 19. P. 5237-5246. 4. Thomas J. О. II Biochcm. Soc. Trans. 2001. Vol. 29. P. 395 -401. 5. Чихиржина E. В., Воробьев В. И. II Цитология. 2002. Т. 44. С. 721-736. 6. Baxcvanis A. D., Landsman D. II Nucl. Asids Res. 1995. Vol. 23. P. 1604-1613. 7. Travers A., Thomas J. О. II Chromatin structure and dynamics: State-of-the-Art/ Eds.: J. Zlatanova, S. H. Lcuba. New York, 2004. P. 103-126. 8. Van Holde K., ZlaianovaJ. II BioEssays. 1994. Vol. 16. P. 59-68. 9. Travers A. II Trends Biochem. Sci. 1999. Vol. 24. P. 4-7. 10. Jerzmanowski A. H Chromatin structure and dynamics: State-of-the-Art/ Eds.: J. Zlatanova, S. h'. Leuba. New York, 2004. P. 75-102. 11 .ZlaianovaJ., van Holde К. II BioEssays. 1998. Vol. 20. P. 584-588. 12. Чихиржина E. В., Поляничко A. M„ Скворцов A. H. и др. // Молекулярная биология. 2002. Т. 36, вып. 3. С. 525-531. 13. Polyanichko А. М., Chikhirzhina Е. V., Skvorisov А. N. et al. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2002. Vol. 19. P. 1053-1062. 14. Поляничко A. M, Чихиржнна E. В.. Андрущенко В.В. и др. // Молекулярная биология. 2004. Т. 38, вып. 4. С. 701-712. 15. Поляничко А. М., Чихиржина Е. В., Костылева Е. И. и др. // Молекулярная биология. 2004. Т. 38, вып. 6. С. 1041-1049. 16. John Е. W. The HMG chromosomal proteins. London, 1982. 17. Tsankov D., Kalisch В., van de Sonde J. H. II Appl. Spectroscopic Rev. 1995. Vol. 49. P. 132-138. 18. ZlaianovaJ., Yaneva J. II DNA Cell Biol. 1991. Vol. 10. P. 239-248. 19. Чихиржина E. В., Костылева E. И.. Ралш E. И. и др. // Цитология. 1998. Т. 40, вып. 10. С. 883-888. 20. Hud N. V., Downing К. Н. II Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. Vol. 98, N 26. P. 14925 -14930.

Статья принята к печати 19 сентября 2006 г.