CC BY
23
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕЕ 16. БИОЛОГИЯ. 2017. T. 72. № 4. С. 253-257
253
МОЛЕКУЛЯPHАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.21
РОЛЬ БЕЛКА NHP6 В ТРАНСКРИПЦИИ НУКЛЕОСОМ IN VITRO
Ф.К. Хсиех1, А.Л. Козлова2*, Н.С. Герасимова2, Е.Ю. Котова3, Т. Формоза4, В.М. Студитский23
1 Department of Molecular Biology, Harvard Medical School, 25 Shattuck St., Boston, MA 02114, USA;
2кафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
3Cancer Epigenetics Program, Fox Chase Cancer Center, Cottman Avenue 333, Philadelphia, PA 19111, USA;
4 University of Utah, School of Medicine, 30 N1900 E, Salt Lake City, Utah, UT 84132, USA
*e-mail: mika.lorens@yandex.ru
Nhp6 — это небольшой белок дрожжей, неспецифично связывающий ДНК. Pанее было показано, что Nhp6 входит в состав нескольких комплексов (в том числе комплекса FACT), присутствует на многих дрожжевых промоторах и транскрибируемых участках генов in vivo и участвует в процессе дестабилизации структуры нуклеосом in vitro. В нашей лаборатории был изучен фактор FACT и показана его роль в трaнскрипции хроматина эукариотической PHК-полимеразой 2 in vitro, однако роль белка Nhp6 в транскрипции ранее не была исследована. В данной работе мы изучили влияние этого белка на транскрипцию нуклеосом эукариотической PHК-полимеразой 2 и показали, что он увеличивает эффективность транскрипции в нескольких положениях на нуклеосомной ДНК, в первую очередь — участка в положении +(11—17) в нуклеосоме. Предложена модель действия Nhp6, предполагающая стабилизацию транзитного отворачивания ДНК от ок-тамера гистонов в процессе транскрипции хроматина.
Ключевые слова: хроматин, нуклеосома, транскрипция, FACT, Nhp6, Spt16, Pob3
Хроматин — это сложный нуклеопротеидный комплекс, структурной единицей которого на первом уровне упаковки является нуклеосома [1], состоящая из октамера белков-гистонов и нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы участвуют в регуляции биологических процессов на ДНК.
Шаперон гистонов FACT (facilitates chromatin transcription) играет важную роль в поддержании и изменении структуры хроматина в ходе различных процессов с участием ДНК — репликации, репарации и транскрипции [2]. Наиболее исследованы комплексы FACT человека (human FACT — hFACT) и дрожжей (yeast FACT — yFACT).
yFACT — гетеротример, состоящий из белков Spt16 (suppressor of TY16), Pob3 (poll binding protein 3) и Nhp6 (non histone protein 6) [3] (рис. 1, А). В нашей лаборатории методом spFRET-микроскопии in vitro был подробно изучен механизм yFACT-зависимого разворачивания (реорганизации) нуклео-сомной ДНК. Данное разворачивание проходит по механизму "все или ничего" — нуклеосомы при взаимодействии с комплексом находятся либо в полностью интактном состоянии, либо в реорга-низованом [4]. Была доказана роль Nhp6 в отворачивании ДНК: присутствие в растворе только субъединиц Spt16 и Pob3 не вызывало реорганизацию нуклеосом [4].
Исследования на клетках дрожжей показали, что yFACT колокализуется с РНК-полимеразой 2 (РНКП2) [5] и необходим во время выполняемой
ей транскрипции для поддержания структуры хроматина [6, 7]. Скорее всего, FACT нужен для транскрибирования генов в районах с упорядоченной структурой хроматина [8]. Исследования in vitro показали, что hFACT облегчает движение PHК-поли-меразы через нуклеосомы [9]. Возможно, FACT конкурирует с ДНК за связывание гистонов во время элонгации транскрипции. Таким образом, исследования in vitro и in vivo подтверждают, что FACT способствует более эффективному сохранению ну-клеосом в процессе транскрипции.
В настоящей работе мы исследовали одну из субъединиц комплекса FACT — Nhp6. Это небольшой белок дрожжей с молекулярной массой 10,81 кДа (93 и 100 а.о. в разных формах), неспецифично связывающий ДНК [10]. Nhp6 связывается с небольшим участком ДНК и образует мультимолекуляр-ные комплексы при взаимодействии с ДНК длиной 149 п.н in vitro [11]. Также было показано, что Nhp6 важен для ослабления ДНК-гистоновых взаимодействий в нуклеосомах [12].
Pоль Nhp6 в транскрипции была продемонстрирована в работах по индукции генов, транскрибирующихся PHКП2, в мутантных по генам nhpóa и nhpób штаммах дрожжей; экспрессия исследуемых генов была подавлена [13]. Кроме этого, Nhp6 облегчает взаимодействие TBP (TATA-box binding protein) с ДНК в присутствии TFIIA (Transcription Factor IIA) [14]. Полногеномный анализ распределения Nhp6 по дрожжевому геному показал, что Nhp6 распо-
Рисунок. Белок Nhp6 облегчает транскрипцию нуклеосом РНКП 2. А — Субъединичная структура белкового комплекса yFACT. Показана доменная структура белков Spt16, Pob3 и HMGB-подобного ДНК-связывающего домена субъединицы Nhp6 в комплексе с ДНК (PDB ID — 1J5N). Б — Взаимодействие Nhp6 с нуклеосомами. Нуклеосомы инкубировали в присутствии указанных концентраций Nhp6 и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в нативных условиях. Слева указаны значения электрофоретической подвижности нуклеосом и ДНК. В — Схема эксперимента: транскрипция нуклеосом эукариоти-ческой РНКП 2 (обозначена на рисунке овалом) в присутствии белка Nhp6 in vitro. Г — Транскрипция нуклеосом эукариотиче-ской РНКП 2 в присутствии белка Nhp6 in vitro. Д — Модель транскрипции в присутствии Nhp6. Показана модель, объясняющая облегчение транскрипции нуклеосом белком Nhp6: РНК-полимераза 2 откручивает ДНК от октамера гистонов, Nhp6 связывает данный участок ДНК, затрудняя обратное связывание ДНК с октамером, и таким образом облегчает транскрипцию нуклеосом
ложен на транскрибируемых участках 104 генов, транкрибируемых РНКП2 [15], но его роль в транскрипции хроматина РНКП2 in vitro не была изучена.
Материалы и методы
Сборка нуклеосом. Получение позиционированных мононуклеосом проводили по протоколам, описанным ранее [16, 17].
Инкубация нуклеосом с белком Nhp6. К нуклео-сомам, содержащим меченую ДНК (10—15 нМ), добавляли Nhp6 (от 0,25 до 2 мкМ в различных экспериментах) и инкубировали 10 мин при 30°С. Инкубация проводилась в транскрипционном буфере ТВ150 (20 мМ Трис-HCl (pH 7,9), 2 мМ MgCl2, 150 мМ KCl, 1 мМ бета-меркаптоэтанол). Связывание белка Nhp6 анализировали с помощью электрофореза в 4%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) (акриламид:бисакриламид — 39:1), проводимом в на-тивных условиях при 4°С (электродный буфер 0,5хТВЕ).
Транскрипция in vitro. РНКП2 дрожжей и гистоны очищали по протоколам, описанным ранее [18, 19]. Элонгационный комплекс с дрожжевой РНКП2 собирали с использованием коротких синтетических ДНК- и РНК-фрагментов и лигировали с ну-клеосомами. Транскрипцию проводили с дополнительным мечением изотопом a-32P РНК-транс-криптов до (—5)-нуклеотида относительно входа в нуклеосому, затем элонгация начиналась при добавлении в раствор недостающих нуклеотидов и избытка ГТФ, не содержащего метки, в буфере, содержащем 150 мМ KCl, при указанных концентрациях Nhp6. Исследуемый диапазон концентраций Nhp6 составлял 0,25—2 мкМ. После прохождения транскрипции РНК анализировали гель-электрофорезом в денатурирующих условиях. В качестве маркера использовали плазмиду pBR332, обработанную эндонуклеазой рестрикции MspI [9].
Результаты и обсуждение
Одна молекула Nhp6 (рис. 1, А) связывается с участком ДНК длиной около 10—15 п.н. [10]; таким образом, с длинными фрагментами ДНК белок может образовывать мультимолекулярные комплексы. Ранее это было подтверждено в экспериментах, проведенных на последовательностях ДНК, обладающих низкой аффинностью к гистоновому окта-меру [11]; необходимо было доказать образование мультимолекулярных комплексов с Nhp6 высокоаффинной ДНК, используемой в наших экспериментах. Были изучены комплексы, образуемые Nhp6 с нуклеосомной ДНК (рис. 1, Б). ДНК-фрагмент для этого эксперимента состоял из нуклеосома-позиционирующей последовательности (НПП) и дополнительного промотора — такая матрица моделировала ДНК, используемую в последующих транскрипционных опытах; таким образом, в этом эксперименте изучалось связывание белка Nhp6
как с участками, связанными с гистонами (НПП), так и со свободными участками ДНК (промоторная область). Нуклеосомы инкубировали в присутствии повышающихся количеств (от 0,25 до 2 мкМ) белка Nhp6. Образование ДНК-белковых комплексов фиксировали по изменению электрофоретической подвижности в нативном ПААГ нуклеосом, содержащих флуоресцентно-меченную ДНК.
При взаимодействии Nhp6 с нуклеосомной ДНК наблюдается формирование мультимолекулярных комплексов, отличающихся по электрофоретиче-ской подвижности в ПААГ в нативных условиях, как было описано ранее для нуклеосом, ДНК которых не содержала НПП [11]. При постепенном повышении концентрации белка от 0,25 до 2 мкМ было выявлено последовательное образование нескольких мультимолекулярных комплексов (рис. 1, Б). Каждый такой комплекс состоит из одной нуклеосомы и одной или нескольких молекул Nhp6. Сравнение эффективности связывания Nhp6 с нуклео-сомами, ДНК которых содержит НПП (рис. 1, Б), с опубликованными ранее данными [11] показало, что наличие НПП не оказывает существенного влияния на связывание Nhp6 с нуклеосомами. Таким образом, наша экспериментальная система может быть использована для анализа роли Nhp6 в транскрипции нуклеосом.
Для изучения влияния Nhp6 на процесс элонгации с помощью эукариотической РНКП2 в хроматине проводили анализ РНК-продуктов, полученных в ходе транскрипции мононуклеосомных матриц РНКП2 в присутствии повышающихся концентраций белка Nhp6 in vitro (рис. 1, В).
По результатам транскрипции in vitro удалось установить, что уже при низкой концентрации Nhp6 (0,25 мкМ) наблюдается уменьшение "пау-зирования" РНКП2 (временных остановок РНКП2 на ДНК-матрице) при элонгации участка +15 ну-клеосомной ДНК. При более высоких концентрациях Nhp6 (1 и 2 мкМ) наблюдается также увеличение эффективности транскрипции участка +45 (рис. 1, Г).
На основе полученных данных нами была предложена возможная модель роли Nhp6 в элонгации (рис. 1, Д). Данный белок, связываясь с ну-клеосомной ДНК, может изменять ее структуру: вызывать сильные изгибы в месте связывания и отгибать ДНК от октамера гистонов. Эти эффекты приводят к облегчению транскрипции в первую очередь при входе в нуклеосому (положение +15, рис. 1, Г, Д), а также при больших концентрациях могут влиять на "паузирование" РНКП2 в ходе элонгации через участок +45. В клетках дрожжей субъединица Nhp6 присутствует в избытке по отношению к остальным субъединицам фактора FACT [10]. Поэтому полученные нами данные позволяют предположить, что субъединица Nhp6 дрожжевого комплекса FACT может участвовать в транскрипции хроматина в клетках дрожжей как в составе комп-
лекса FACT, так, возможно, и как отдельная субъединица, облегчающая транскрипцию хроматина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kornberg R.D., Tomas J.O. Chromatin Structure: Oligomers of the Histones // Science. 1973. Vol. 184. N 4139. P. 865-868.
2. Bondarenko M.T., Maluchenko N.V., Valieva M.E., Gerasimova N.S., Kulaeva O.I., Georgiev P.G., Studitsky V.M. Structure and function of histone chaperone FACT // Mol. Biol. 2015. Vol. 49. N 6. P. 796-809.
3. Formosa T., Eriksson P., Wittmeyer J., Ginn J., Yu.Y., Stillman D.J. Spt16-Pob3 and the HMG protein Nhp6 combine to form the nucleosome-binding factor SPN // EMBO J. 2001. Vol. 20. N 13. P. 3506-3517.
4. Valieva M.E., Armeev G.A., Kudryashova K.S., Gerasimova N.S., Shaytan A.K., Kulaeva O.I., McCullough L.L., Formosa T., Georgiev P.G., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Large-scale ATP-independent nucleosome unfolding by a histone chaperone. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2016. Vol. 23. N 12. P.1111-1116 .
5. Saunders A., Werner J., Andrulis E.D., Nakayama T., Hirose S., ReinbergD., Lis J.T. Tracking FACT and the RNA polymerase II elongation complex through chromatin in vivo // Science. 2003. Vol. 301. N 5636. P. 1094-1096.
6. Mason P.B., Struhl K. The FACT complex travels with elongating RNA polymerase II and is important for the fidelity of transcriptional initiation in vivo // Mol. Cell. Biol. 2003. Vol. 23. N 22. P. 8323-8333.
7. Cheung V., Chua G., Batada N.N., Landry C.R., Mich-nick S.W., Hughes T.R., Winston F. Chromatin- and transcription-related factors repress transcription from within coding regions throughout the Saccharomyces cerevisiae genome // PLoS Biol. 2008. Vol. 6. N 11. P. 277-281.
8. Reinberg D., Sims R.J. De FACTo nucleosome dynamics // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. N 33. P. 23297-23301.
9. Hsieh F.K., Kulaeva O.I., Patel S.S., Dyer P.N, Luger K, Reinberg D., Studitsky V.M. Histone chaperone FACT action during transcription through chromatin by RNA polymerase II // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110. N 19. P. 76547659.
10. Stillman D.J. Nhp6: A small but powerful effector of chromatin structure in Saccaromyces cerevisiae // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1799. N 1-2. Р. 175-180.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-24-00031).
11. Ruone S., Rhoades A.R., Formosa T. Multiple Nhp6 molecules are required to recruit Spt16-Pob3 to form yFACT complexes and to reorganize nucleosomes // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. N 46. P. 45288-45295.
12. Xin H., Takahata S., Blanksma M., McCullough L., Stillman D.J., Formosa T. yFACT induces global accessibility of nucleosomal DNA without H2A-H2B displacement // Mol. Cell. 2009. Vol. 35. N 3. P. 365-376.
13. Yu Y., Eriksson P., Stillman D.J. Architectural transcription factors and the SAGA complex function in parallel pathways to activate transcription // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. N 7. P. 2350-2357.
14. Biswas D., Imbalzano A.N., Eriksson P., Yu Y., Stillman D.J. Role for Nhp6, Gcn5, and the Swi/Snf complex in stimulating formation of the TATA-binding protein-TFIIA-DNA complex // Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 24. N 18. P. 83128321.
15. DowellN.L., Sperling A.S., Mason M.J., Johnson R.C. Chromatin-dependent binding of the S. cerevisiae HMGB protein Nhp6A affects nucleosome dynamics and transcription // Genes. Dev. 2010. Vol. 24. N 18. P. 2031-2042.
16. Pestov N.A., Gerasimova N.S., Kulaeva O.I., Studitsky V.M. Structure of transcribed chromatin is a sensor of DNA damage // Sci. Adv. 2015. Vol. 1. N 6. e1500021.
17. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109-123
18. Kireeva M.L., Walter W., Tchernajenko V., Bondarenko V.A., Kashlev V., Studitsky V.M. .Nucleosome remodeling induced by RNA polymerase II: Loss of the H2A/H2B dimer during transcription // Mol. Cell. 2002. Vol. 9. N 3. P. 541-552.
19. Dyer P.N., Edayathumangalam R.S., White C.L., Bao Y., Chakravarthy S., Muthurajan U.M., Luger K. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA // Methods Enzymol. 2004. Vol. 375. P 23-44.
Поступила в редакцию 06.07.2017 г.
Принята к печати 09.09.2017 г.
MOLECULAR BIOLOGY
ROLE OF NHP6 PROTEIN IN TRANSCRIPTION THROUGH A NUCLEOSOME IN VITRO
F.K. Hsieh1, A.L. Kozlova2 *, N.S. Gerasimova2, E. Kotova3, T. Formosa4, V.M. Studitsky2,3
1 Department of Molecular Biology, Harvard Medical School, 25 Shattuck St., Boston, MA 02114, USA;
2Department of Bioengineering, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234, Russia;
3Cancer Epigenetics Program, Fox Chase Cancer Center, Cottman Avenue 333, Philadelphia, PA 19111, USA;
4 University ofUtah, School ofMedicine, 30 N1900 E, Salt Lake City, Utah, UT 84132, USA
*e-mail: mika.lorens@yandex.ru
Nhp6 is a small yeast protein, which binds DNA nonspecifically. It was shown that Nhp6 is a part of several protein complexes (including FACT complex) and is presented on many yeast promoters and transcribed regions of genes in vivo. It also participates in the process of destabilizing the structure of nucleosomes in vitro. In our laboratory, we studied FACT complex
and showed its role in the transcription of eukaryotic RNA-polymerase 2 in vitro, but the role of the Nhp6 protein in transcription has not been studied previously. In this paper, we describe the effect of Nhp6 protein on transcription through a nucleosome by eukaryotic RNA-polymerase 2 and show that Nhp6 protein increases the transcription efficiency at several positions on the nucleosomal DNA, primarily the transcription at the positions +(11—17) in the nucleosome. We proposed a model of the action of Nhp6 during transcription through chromatin, suggesting the stabilization of DNA transiently uncoiled from the octamer during this process. Keywords: chromatin, nucleosome, transcription, FACT, Nhp6, Spt16, Pob3 Cведения об авторах
Хсиех Фу Кай — PhD, науч. сотр. Медицинского факультета Гарвардского университета. Тел.: +1-617-432-1000; e-mail: hsieh@molbio.mgh.harvard.edu
Козлова Анастасия Львовна — студентка кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91; e-mail: mika.lorens@yandex.ru
Герасимова Надежда Сергеевна — канд. биол. наук, мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-938-22-91; e-mail: shordome@gmail.com
Котова Елена Юрьевна — науч. сотр. кафедры эпигенетики рака Онкологического центра Фокс Чейз. Тел.: +1-215-728-7014, e-mail: elena.kotova@fccc.edu
Формоза Тим — PhD, проф. кафедры биохимии медицинского факультета университета Юты. Тел: +1-801-581-7201; e-mail: tim@biochem.utah.edu
Студитский Василий Михайлович — докт. биол. наук, гл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел. 8-495-938-22-91; e-mail: vasily.studitsky@fccc.edu
