CC BY
220
1
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 21
>- УДК 577.113:612.014.24(048.8) D.Yu. Blokhin DYNAMIC STRUCTURE OF CHROMATIN (REVIEW) N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT The data summarized in this review describe the modern représentations of eukaryotic cells chromatin structure from the DNA primary structure up to the architectural ensemble of DNA with histones and non-histone nuclear proteins. The role of structural proteins of nuclear matrix in maintenance supercoiled conformation of cuasicircular domains of nuclear DNA is discussed. Key words: DNA, chromatin, supercoiled conformation, DNA domain. Д. Ю. Блохин ДИНАМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ В обзоре литературы современные представления о структуре хроматина клеток эукариот проанализированы с точки зрения усложняющихся уровней организации ядерной ДНК — от ее первичной структуры до архитектурного ансамбля ДНК с гистоновыми и негистоновыми ядерными белками. Показана роль структурных белков ядерного матрикса в обеспечении суперспиральной конформации квазициркулярных доменов ДНК хроматина. Ключевые слова: ДНК, хроматин, суперспиральная конформация, домены ДНК. ВВЕДЕНИЕ • структура хроматина консолидирована с цито- Полагают, что одной из основных молекулярных скелетом в единый комплекс; мишеней действия большинства высокоактивных про- • структура хроматина изменяется не в резуль-тивоопухолевых препаратов является молекула тате непосредственного повреждения его компонентов ДНК. Накоплен значительный запас сведений о химиче- ксенобиотиками и их активными метаболитами, ской природе подобных взаимодействий, описаны био- а вследствие реактивных перестроек генетического химические эффекты и морфологические изменения аппарата в ответ на цитотоксический стресс. клеточных ядер, сопровождающие действие химиотера- Для понимания биологических механизмов подоб-певтических противоопухолевых средств. Морфологи- ных клеточных реакций на действие цитотоксических ческие изменения структуры хроматина обнаружены веществ разных химических классов необходимы де-при воздействии на клетки не только очевидно ДНК- тальные представления о структуре и функциях кле-тропных агентов, но и соединений, точка первичного точного ядра эукариотической клетки, освещению ко-взаимодействия которых с внутриклеточными субстра- торых и посвящен настоящий обзор литературы. тами локализована вне клеточного ядра. Митотические яды (алкалоиды барвинка, колхицин), таксаны, липидо- 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ цитостатики и другие соединения, атакующие элемен- И СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ УРОВНИ ты цитоскелета и клеточных мембран, также вызывают ОРГАНИЗАЦИИ ДНК структурные изменения хроматина клеток-мишеней. В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ Логично заключить, что подобные эффекты «не-гено- В третье тысячелетие человечество вступило под тропных» соединений являются следствием одной из флагом полной расшифровки собственного генома, следующих или обеих сразу причин: а 2003 г. стал для мировой научной общественности ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
1 1
22 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
к годом полувекового юбилея открытия Джеймсом Уот- 1.1. Первичная структура ДНК соном и Френсисом Криком двойной спирали ДНК — Как любой полимер, молекула ДНК обладает пер-временем подведения итогов и оценки результатов вичной структурой, образованной уникальной после-этого эпохального для естественных наук события. довательностью чередования 4 видов мономеров: азо-Вот что пишет в посвященном юбилею январском тистых оснований, 2 из которых являются пуринами, номере журнала Nature (2003) М. Кемп [39]: «Нет дру- а 2 — пиримидинами, соединенными гомополимерной гой молекулы в истории науки, которая достигла бы сахарофосфатной цепью. Фосфоэфирные связи после-иконного статуса ДНК... Двойная спираль ДНК не име- довательно соединяют 3’-атом углерода остатка дезок-ет равных в качестве символа биологических наук». сирибозы каждого предыдущего нуклеотида с 5’-ато-Следующая статья того же номера журнала при- мом углерода последующего, создавая непрерывный надлежит П. Болу [14]. Вот его оценка: «Двойная спи- ковалентно-связанный остов молекулы. Последова-ралъ идеализирована в силу ее эстетично элегантной тельность азотистых оснований и является собственно структуры, но не реалъного физического существова- генетической матрицей, на которой при помощи трип-ния ДНК. Болъшая частъ ДНК в клетке сжата летного кода записана вся наследственная информация в сложный клубок, который каким-то образом все- организма. Весьма условно можно провести аналогию таки вовлекается в тщателъный контролъ регуляции между такого типа кодировкой и буквами алфавита, генов... И не надо думатъ, что этот клубок может в определенной очередности образующих слова ифра-бытъ понят на основе идеалъной двойной спирали. зы. Хотя в генетическом словаре всего четыре буквы, Эти нити представляют собой комплексы ДНК с бел- но их оказывается достаточно для шифрования после-ками — хроматин, в которых толъко оченъ короткие довательности 20 различных аминокислот, из которых фрагменты нативной спирали могут временно появ- состоят все будущие белковые молекулы — конечные лятъся. Хотя хромосомы часто приравнивают к ДНК, продукты функционирующих генов. Таким же обране надо забыватъ, что в них белка в два раза болъше, зом закодированы регуляторные участки генома — чем ДНК. И, кроме того, там еще содержится 10% промоторы и энхансеры, старт- и стоп-кодоны и др. РНК, которая синтезируется в процессе транскрип- Стабильность первичной структуры молекулы ции... Создается впечатление, что геном — это от- ДНК позволяет клеткам из поколения в поколение сокрытая книга, готовая для чтения. Однако это не хранять уникальную для каждого организма наслед-так. Книга закрыта, запечатана и запакована» (ци- ственную информацию (генотип). Изменения в после-тировано по [10] в переводе автора). довательности чередующихся азотистых оснований В настоящем обзоре литературы прошлых лет (мутации) могут приводить к возникновению ошибок приведены основные научные находки, позволившие в наследственной информации, различные возможные сформировать современные представления о структу- последствия которых описаны ниже. ре и механизмах функционирования молекулы ДНК Строго говоря, первичная структура ДНК, обладая в составе хроматина эукариотической клетки. значительным консерватизмом, все же не является по-Молекулярной основой хранения, передачи и ис- стоянной. Открытие мобильных диспергированных пользования генетической информации является гигант- генов, транспозонов показало, что отдельные участки ский биополимер — ДНК, функционирующий в клетках молекулы способны перемещаться вдоль цепи в проэукариот в составе хроматина, локализованного в клеточ- цессе нормального функционирования и дифференци-ном ядре. Хроматин представляет собой сложно органи- ровки клеток, меняя при этом первичную структуру зованный супрамолекулярный комплекс ДНК с ядерны- молекулы. Особенно такие перестройки характерны ми белками, гетерогенной ядерной РНК, липидами, гли- для клеток лимфоидной ткани: с ними связана терми-козаминогликанами и др. Тонкая архитектоника этого нальная дифференцировка наивных лимфоцитов, при-комплекса позволяет не только реализовать сверхком- водящая к появлению клонов узко специализирован-пактную упаковку гигантской молекулы ДНК (суммар- ных иммунокомпетентных клеток. Неслучайность ная линейная длина молекулы ДНК человека, упакован- таких участков и дискретность генетической информа-ной в клеточном ядре диаметром 10-15 мкм, составляет ции позволяют в ходе подобных перемещений сохра-около 2 м! [6]), но также обеспечивает упорядоченное нить целостность генома. и регулируемое функционирование генома, управляе- С другой стороны, некоторые вирусы (ретро-, аде-мую активацию и репрессию отдельных генов и групп новирусы и др.) способны встраивать в ДНК-клетки генов, безошибочную репликацию всей молекулы. хозяина дополнительные элементы, а также перетас-В связи с главенствующей ролью ДНК в качестве кивать участки генов или целые гены из одного локу-носителя наследственной информации остальные ком- са молекулы ДНК в другие. Действие ионизирующей поненты хроматина можно рассматривать как важные, радиации, химических канцерогенов и мутагенов, но все-таки вспомогательные его элементы, обеспечи- ошибки в процессе репликации ДНК также приводят вающие пространственное расположение ДНК и регу- к изменениям в первичной структуре молекулы. Такие лирующие избирательное функционирование генов. изменения носят, как правило, случайный характер С этой позиции структурную организацию хроматина и потому изменяют целостность генома и представля-целесообразно рассматривать в виде ряда усложняю- ют собой соматические мутации. Последствия таких щихся уровней организации ДНК. изменений не однозначны. ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
Если мутация возникла в «бессмысленном» участке ДНК, она, как правило, носит безразличный характер. Такой же характер имеют мутации, возникающие в конститутивно репрессированных генах. Понятие конститутивной репрессии тканеспецифично и связано с особенностями клеточной дифференцировки, в связи с чем ген, репрессированный в клетках определенного типа, может оказаться функционально значимым в клетках другого гистогенеза. К примеру, герминальная (унаследованная, т. е. присутствующая во всех клетках данного организма) мутация генов ВЯСЛ1/2 обусловливает чрезвычайно высокий риск раннего развития рака молочной железы или яичника, но никак не проявляется в клетках прочих тканей.
Если мутация затронула функционирующий ген, то ее последствия не могут носить безразличного характера, однако они и в этом случае не однозначны: при изменении последовательности оснований в регуляторных участках гена может наблюдаться как ослабление его экспрессии вплоть до полного отключения (нокаут гена), так и аномальная активация (гипер- или оверэкспрессия) вплоть до приобретения постоянной нерегулируемой активности. Наконец, мутация в «смысловой» части гена, кодирующей определенный белковый продукт (миссенс-мутация), может вызвать появление измененного белка. В свою очередь, измененный белковый продукт по функциональным свойствам может полностью соответствовать белку «дикого» типа: либо иметь сниженную специфическую активность; либо, напротив, гиперактивность; либо, наконец, приобретать иной, не свойственный белку «дикого» типа, вид активности.
Таким образом, в зависимости от совокупности многих факторов соматические мутации могут приводить как к снижению жизнеспособности клетки, остановке ее деления и гибели, так и, напротив, к ее усиленному росту и делению вплоть до опухолевой трансформации.
1.2. Вторичная структура ДНК
Вторичная структура ДНК представлена двойной спиралью, модель которой была открыта более полувека назад будущими Нобелевскими лауреатами (премия присуждена именно за это открытие) Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком [62]. Согласно этой модели молекула нативной ДНК представляет собой две зеркально отраженные (в отношении комплементарных друг другу пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований) антипараллельные (5’-конец одной цепи соседствует с 3’-концом другой) цепи, соединенные друг с другом силами комплементарного взаимодействия, которые обеспечиваются силами Ван-дер-Ваальса, не являются ковалентными, а потому могут быть относительно легко разрушены, что приводит к расхождению обеих нитей — денатурации молекулы ДНК. Этот процесс (локальная денатурация) абсолютно необходим для выполнения молекулой ДНК матричных функций, а также репликации самой молекулы.
В составе 2-нитевой (2-цепочечной) молекулы обе нити ДНК являются правозакрученными спиралями с общей осью: азотистые основания обращены внутрь молекулы, образуя гидрофобную зону, а обе сахарофосфатные цепи расположены периферически (плек-тонемическая спираль). Хорошо известны несколько канонических форм двойной спирали, различающихся геометрическими размерами. Классическая В-форма, модель которой предложена Уотсоном и Криком в 1953 г., имеет следующие характеристики: один виток правозакрученной молекулы содержит 10 пар нуклеотидов, длина его проекции на ось составляет 34 А (ангстрем), диаметр (по атомам фосфора) — 18 А; молекула имеет большую и малую боковые бороздки с поперечником 17 и 11 А соответственно (рис. 1). Такая форма молекулы существует в препаратах, уровень влажности которых близок к физиологическому. При частичном обезвоживании ДНК переходит в А-форму, в которой один виток содержит уже 11 пар оснований, проекция витка на ось составляет 28 А, диаметр уменьшается на1 А, а ширина обеих бороздок сравнивается. С-форма, образующаяся в присутствии солей лития, напротив, является более рыхлой, чем В-форма: виток содержит 9 нуклеотидных пар. Абсолютно уникальна открытая относительно недавно левозакрученная 7-форма ДНК, содержащая 12 нуклеотидов на 1 виток [55]. В пределах канонических форм возможно существование определенных промежуточных вариантов, переходы между которыми осуществляются не кооперативно, в отличие от кооперативных переходов от одной канонической формы к другой.
Осккофмбои
Рис. 1. Три представления двунитевой молекулы ДНК [10]:
а и б — классические изображения двуспиральной ДНК;
в — ДНК как двухцепочечная структура с неопределенными физическими параметрами, но с цепями, комплементарными друг другу;
А, С, в, Т — мономерные звенья полимерной молекулы ДНК;
С-в, Т-А — комплементарные пары оснований, связывающие две цепи
Конформационные переходы на отдельных участках гигантской молекулы ДНК важны для высших уровней организации и функционирования хроматина и будут обсуждаться в соответствующем раз-
деле. Здесь же следует отметить, что наличие двойной спирали в любой из канонических форм возможно не только при участии 2 нитей, но и на отдельном участке 1-нитевой молекулы, однако при условии, что этот участок будет нести палиндромную последовательность, т. е. симметрично отраженную последовательность комплементарных оснований, например «...АТСАО...СТОАТ...». В таком участке 2-ни-тевой молекулы ДНК может образовываться «шпилька» или «крест», представляющие собой симметричный дуплексный отросток, ось которого перпендикулярна основной оси молекулы. Обратимое образование «шпилек», как и конформационные переходы молекулы, играет определенную роль в регулировании активности отдельных генов.
1.3. Структуры ДНК высших порядков организации
В предыдущих разделах кратко описана структура собственно молекулы ДНК вне ее связи с другими компонентами хроматина. Все последующие уровни организации этого биополимера охватывают структуру супрамолекулярного комплекса ДНК.
В составе хроматина молекула ДНК находится во взаимодействии с большим количеством белков (массовое соотношение ДНК:белок в ядрах разных клеток различается, но в среднем близок к соотношению 1:1 — 1:2), которые делят на 2 неодинаковые группы гистоны и негистоновые белки хроматина. Гистоны (белки основного характера, растворимые в кислотах) составляют большую часть (до 80 %) суммарных ядерных белков, негистоновые белки (кислые, нейтральные и некоторые слабо основные) составляют количественно меньшую часть ядерных белков, но объединяют в своей группе значительно большее разнообразие структурных, ферментативных и регуляторных белковых компонентов хроматина.
Структура нуклеогистонового комплекса хорошо изучена и определяется 2 уровнями его организации: нуклеосомным и нуклеомерным [41]. Нуклеосомы представляют собой нуклеопротеидные частицы диаметром 10 нм, состоящие из центральной (коровой) белковой частицы с соленоидоподобной укладкой дву-нитевой молекулы ДНК на ее поверхности. Коровая частица является октамером 4 гистонов (у человека — гистоны Н2а, Н2Ь, Н3 и Н4), по 2 молекулы каждого на 1 частицу. Длина участка ДНК, непосредственно контактирующая с коровой частицей, составляет 140 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствует молекулярной массе (ММ) ок. 100 кДа. ДНК, контактирующая с ко-ровыми частицами, стерически защищена от действия эндонуклеаз. Молекула ДНК образует на поверхности коровой частицы 2 витка, после чего, не обрываясь, переходит на следующую коровую частицу. Длина свободного участка ДНК между соседними коровыми частицами (линкер) оценивается в 30-60 п.н. (1020 нм). Морфологически нуклеосомный уровень организации хроматина выглядит, как «бусинки на нитке» (рис. 2 — заимствовано из [6]).
Нуклеосома
/ \ хроматмиовой фибриллы
\ Нсмодифициро-ванный
с~:нз: о гистон hj
J L
вкл выкл
Моаифициро-панныА гм стон НЗ
? 19 Г Г Г 9?
НЗ N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP. .
4 9І0 14 18 23 2728
9 Г Г Г Г ?
Н4 N-SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQC.it . . I 5 8 12 12 20
Рис.2. Схема организации хроматина и N-конца гистона НЗ человека (а), возможные сайты посттранс-ляционных модификаций гистонов Н3 и Н4 (б) (заимствовано из [6]):
На поверхности нуклеосомы N-конец гистона НЗ, как и концы других гистонов, представлены в виде консервативного домена; на схеме гистона НЗ отмечены места наиболее распространенных посттрансляционных модификаций: ацетилирование (флажок), фосфорилирование (кружок) и метилирование (шестиугольник), вполне возможны и некоторые модификации в глобулярном домене. Обращает на себя внимание пространственная регулярность мест модификаций, звездочка указывает на то, что Lys-9 может быть как ацетилирован, так и метилирован
С линкером ассоциирован гистон Н1, защищающий свободный вненуклеосомный участок ДНК от действия эндонуклеаз и имеющий значение для формирования следующего уровня организации хроматина — нуклеомеров [29; 59], которые являются олигомерами нуклеосом, образующими супербидную (от англ. super beads — большие шары) спираль. Нуклеомерная организация свойственна транскрипционно неактивному хроматину и обеспечивает его высокий уровень ком-пактизации и защиты от нуклеазного расщепления.
В процессе репликации ДНК вся конструкция таких участков хроматина разбирается, ДНК проходит этап репликативного синтеза, после чего фактор сборки хроматина CAF-1 (Chromatin assembly factor — 1) доставляет к вновь синтезированной ДНК димер гис-тонов состава Н3/Н4. На следующем этапе сборка нуклеосом завершается встраиванием в них димеров Н2а/Н2Ь с участием нуклеоплазмина.
В процессе программированной клеточной гибели го ядра реальное количество негистоновых белков
(апоптоза) гистон Н1 расщепляется активированной каспазой-3, обнажая межнуклеосомный линкер ДНК, который немедленно атакуется активированной эндонуклеазой (каспаза- активируемая ДНКаза — CAD, другое название — ДНК-фрагментирующий фактор — DFF), что приводит к гидролизу межнуклеосомных участков и распаду молекулы ДНК на фрагменты, кратные размеру нуклеосомы: моно-, ди-, три-, тетра-нуклеосомы и т.д. — которые выявляются при гелевом электрофорезе в виде дискретных зон с ММ, кратной 180-200 п.н. (характерная для апоптоза «лестница ДНК»).
Присутствие нуклеосом в промоторных участках генов препятствует образованию инициаторного комплекса транскрипции, в состав которого входят РНК-полимераза и факторы транскрипции, и для инициации транскрипции необходимо локальное разрушение нуклеосомной структуры хроматина в окрестностях промотора и регуляторных элементов. При этом конститутивно транскрибируемые гены вовсе не имеют нуклеосомной структуры в промоторной области.
Не вполне ясен механизм, посредством которого поддерживается непрерывное существование участка в виде свободной от нуклеосом последовательности ДНК: либо факторы транскрипции успевают провза-имодействовать с промоторным участком еще до сборки нуклеосом, либо эти факторы связываются с соответствующими участками ДНК, содержащими нуклео-сомы, и дестабилизируют последние. В пользу такого предположения свидетельствует способность коровых гистонов к многочисленным обратимым модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию — которые вызывают конформационные изменения молекул и соответственно изменение белок-бел-ковых взаимодействий. В частности, химическая модификация консервативных доменов гистонов Н3 и Н4 вызывает дестабилизацию корового октамера, который диссоциирует с освобождением 2 димеров Н2а/Н2Ь; димеры же Н3/Н4 сохраняют связь с ДНК, но структурно не препятствуют прохождению репликативного или транскрипционного комплексов [6].
Таким образом, обратимая сборка-разборка нук-леосом является регуляторным элементом функциональной активации генов, а хранение транскрипцион-но неактивного хроматина в форме супербидной спирали хромомеров предотвращает риск нуклеазного переваривания генетического материала.
Значительно менее изучены взаимоотношения ДНК с негистоновыми белками хроматина. В первую очередь, это связано с огромным количеством негисто-новых белков, часть которых обладает видовой и тканевой специфичностью. По данным двухмерного электрофореза, число негистоновых белков ядра превышает 450, включая модифицированные формы [5], однако это количество учитывает только мажорные фракции, доступные визуализации при существующих методах неспецифического окрашивания электрофореграмм. С учетом минорных белковых компонентов клеточно-
хроматина может измеряться тысячами.
До сих пор отсутствует единая классификация не-гистоновых белков, для их классификации используют прочность их связи с хроматином (экстрагируемость), физико-химические (растворимость, изоэлектричес-кая точка, молекулярная масса, подвижность при электрофорезе и др.), функциональные свойства, ферментативную активность.
Часто негистоновые белки классифицируют на основании способа их выделения из препаратов тотального хроматина в растворах различной ионной силы и с содержанием разных диссоциирующих агентов. Так, до 10 % негистоновых белков может быть извлечено из хроматина экстракцией 0,35 М №С1 (глобули-новая фракция хроматина); до 90 % негистоновых белков удаляются обработкой ядер 2,0 М №С1 с 5 М мочевины или 37 %-ным раствором гуанидин-хлорида. Большая часть остаточных после такой экстракции белков может быть отделена додецилсульфатом натрия (808), 2-меркаптоэтанолом и щелочью. Однако и после такой обработки с ДНК остается связанной небольшое количество белка, который не удаляется даже при депротеинизации ДНК фенолом или хлороформом [50]. Следовательно, взаимоотношения ДНК с разными негистоновыми белками неравнозначны, и говорить о нативной структуре супрамолекулярного комплекса хроматина можно только с позиции сохранения интактности тех или иных взаимодействий в конкретных препаратах изолированного хроматина.
В рамках настоящего обзора из всего многообразия негистоновых белков хроматина следует выделить компоненты ядерного матрикса (скелетной фибриллярно-гранулярной структуры ядра) и небольшую группу обычно сопутствующих им белков (компоненты подмембранного фиброзного слоя ядра — ламины, белки ядерных пор и некоторые другие). Именно эти компоненты клеточного ядра образуют пространственную матрицу, на которой происходит регулируемое функционирование молекулы ДНК.
Ядерный матрикс морфологически представляет собой пространственный каркас интерфазного ядра клетки, к которому определенным образом прикреплена молекула ДНК (рис. 3). Анализ сведений из литературы позволяет заключить, что выделенные препараты ядерного матрикса не соответствуют какой-либо мор-фо-функциональной структуре интерфазного ядра, а представляют собой остаточный продукт последовательных экстракций изолированных клеточных ядер неионными детергентами, эндонуклеазами и концентрированными солевыми растворами, т. е. устойчивую к перечисленным обработкам остаточную структуру интерфазного ядра [16]. Несоответствие термина “ядерный матрикс” строго определенному образованию связано, во-первых, с методической сложностью выделения фибриллярно-гранулярной сети в чистом виде (с достаточной интактностью ее структуры), а во-вторых, с изменчивостью самой этой сети в процессе функционирования клетки, что связано с выполнени-
ем ядерным матриксом не только механических функций пространственной организации хроматина, но и с его участием в осуществлении и регулировании генной активности. В процессе жизнедеятельности клетки ядерный матрикс, подобно цитоскелету, выполняет активную роль, что позволяет говорить о его динамичной структуре [15]. Судьба белков ядерного матрикса в митозе окончательно не выяснена: по одним данным, часть иммуногенных белков матрикса переходит в цитоплазму, по другим — состав ядерного матрикса не отличается от состава каркаса (англ. — scaffold) метафазных хромосом [8; 33; 54].
Рис. 3. Трансмиссионная электронная микрофотография препарата интерфазного хроматина [51]: хорошо различимы фибриллы ядерного матрикса и петлевые домены ДНК в конденсированном и деконденси-рованном состоянии
В большинстве случаев препараты ядерного матрикса при анализе одномерным электрофорезом в присутствии 808 содержат 30-40 белковых зон с ММ от 10 до 200 кДа с преобладанием 3 полос в области ММ 60-70 кДа, именуемыми «триплетом» или «ламина-ми», поскольку по молекулярной массе и пептидным картам они сходны с белками фиброзного слоя ядра [3; 43; 44; 57], хотя и отличаются от них иммунологически [26; 30].
В составе ядерного матрикса обнаружены сократимые белки [24; 52], что наделяет его способностью изменять объем в зависимости от концентрации бивалентных катионов [64]. С ядерным матриксом ассоциированы различные ферменты: ДНК-полимераза а,
праймаза, поли-АОР-рибозо-полимераза (PARP), ме-тилазы, топоизомеразы и др., рецепторы стероидных гормонов [58; 63]. Вместе с тем в препаратах ядерного матрикса обычно присутствуют компоненты ядерного фиброзного слоя и поровых комплексов, а также белки промежуточных филаментов цитоскелета [17; 18; 30; 37]. В его составе обнаруживается некоторое количество небелковых компонентов, из которых особое внимание уделяют РНК, которая обнаружена в виде как гетерогенной ядерной РНК, так и особых «малых» РНК, стабилизирующих структуру матрикса [49].
Поскольку все процедуры приготовления препаратов ядерного матрикса включают интенсивную обработку остаточных ядер эндонуклеазами, с конечным продуктом остается связаным лишь незначительное количество ДНК: до 1 % общей клеточной и около 5 % вновь синтезированной ДНК [2]. Однако интерес представляет именно эта небольшая часть остаточной ДНК, т. к. через эти ассоциированные с белком участки в нативном хроматине осуществляется прикрепление ядерной ДНК к элементам ядерного каркаса — так называемые MARs- или SARs- (от англ. — Matrix attachment regions / Scaffold attachment regions) последовательности. Роль таких элементов не ограничивается чисто механическими функциями прикрепления ДНК к ядерному матриксу. MARs/SARs, по-видимому, фланкируют отдельные гены или группы генов, контролируя их избирательную транскрипцию [35]. Синтетические плазмиды, в которых MARs/SARs-последовательности фланкируют трансфицируемый ген, транскрибируются в клетке-хозяине значительно активнее аналогичных плазмид, не несущих последовательностей связывания с ядерным матриксом [53]. Вместе с тем до сих пор не ясно, какими межмолекулярными взаимодействиями обеспечивается прикрепление MARs/SARs к элементам ядерного каркаса.
С препаратами выделенной из клеточных ядер ДНК даже после ее экстремальной депротеинизации (фенол, хлороформ / изоамиловый спирт, протеиназа К) остается связано некоторое количество негистоно-вых белков [11; 12]. Возможно, остаточный белок препаратов ДНК и остаточная ДНК ядерного матрикса являются компонентами одних и тех же «якорных» структур, выполняющих роль точек прикрепления и инициации репликации ДНК.
Сопоставляя структуру активно транскрибируемого хроматина со структурой его функционально не активного аналога (спермии, ядерные эритроциты птиц, рыб и амфибий), а также покоящихся и пролиферирующих клеток (ткань нормальной и регенерирующей после частичной гепатэктомии печени), можно увидеть, что ДНК прикреплена к элементам ядерного матрикса с участием 2 функционально различающихся типов взаимодействия: перманентного, присутствующего как в транскрипционно активном, так и в не активном хроматине, и транзиторного, присущего функционально активируемым группам генов [9; 12; 13; 54]. Участки перманентного взаимодействия с ядерным матриксом фланкируют 5’-конец генов и содер-
жат, кроме сайта связывания с матриксом, последовательности специфического узнавания транскрипционных и регуляторных факторов.
Наличие дискретных участков прикрепления ДНК к фибриллярно-гранулярному остову интерфазного ядра делит геном на функционально обособленные субъединицы — домены — участки линейной молекулы ДНК между соседними сайтами ее перманентного прикрепления к ядерному матриксу. По оценкам разных авторов, размеры доменов в разных клетках эукариот примерно совпадают и составляют 70-150 тыс. п.н., что приблизительно соответствует размеру репликона и втрое — вшестеро превышает средний размер транскриптона [20; 21; 32; 45]. В частично деконденсиро-ванном состоянии домен может морфологически выглядеть как «бусинки на нитке» (нуклеосомное строение) или как фибрилла диаметром 30 нм (супербидная спираль нуклеомеров). Дегистонизация ДНК доменов приводит к появлению петлевых структур типа «розеток», состоящих из центральной частицы диаметром 30-60 нм и отходящих от нее латерально 15-30 малых петель ДНК [11] (рис. 4). Центральная частица «розеток» разрушается при обработке полианионами или проназой, но устойчива к РНКазе. Малые петли розеток имеют размер 3-5 тыс. п.н., что соответствует содержанию ДНК в нуклеомере. Не ясно, принадлежит центральная частица «розеток» ядерному матриксу или она ассоциирована со свободными участками ДНК, но при экстракции хроматина 2,0 М №С1 не наблюдается диссоциации этих структур, если хроматин предварительно инкубировать в присутствии ионов меди.
Рис. 4. Трансмиссионная электронная микрофотография препарата частично депротеинизированной ДНК из тимуса крысы [11]:
Видны «розетки», образованные петлями ДНК, прикрепленными к центральным белковым частицам. Увеличение X 40 000.
Доменно-петлевая супрамолекулярная структурная организация хроматина обеспечивает чрезвычайно компактную упаковку ДНК и одновременно дискретно-регулируемое функционирование генома [34]. Ниже будет показано, что такая организация молекулы ДНК в составе хроматина эукариотической клетки абсолютно необходима для структурного обеспечения ее особой конформации — состояния упругого осевого (торсионного) напряжения, что придает отдельным участкам молекулы (доменам) специфические физические свойства.
2. СУПЕРСПИРАЛЬНАЯ КОНФОРМАЦИЯ КОЛЬЦЕВЫХ МОЛЕКУЛ ДНК
Поскольку при написании настоящего обзора автор ориентировался на читательскую аудиторию врачей и научных сотрудников медико-биологического профиля деятельности, в предыдущей главе изложение физико-химических характеристик двойной спирали ДНК сведено к необходимому минимуму. Однако в настоящей главе описание следующего уровня суп-рамолекулярной организации ДНК без самых минимальных математических расчетов невозможно. Извинением автора перед читателями может служить фраза Альберта Эйнштейна: «Мы стараемся изложить материал так просто, как это только возможно. Но не проще этого».
Интактная ДНК, находящаяся в физиологических условиях вне транскрипционного или репликативного синтеза, в подавляющем большинстве случаев является двунитевой молекулой, причем обе нити биополимера закручены антипараллельно вокруг общей оси, т. е. как бы обвивают друг друга. Иными словами, обе нити сцеплены между собой и не могут быть разделены без раскручивания. Топологической характеристикой (топология — математическое описание пространственного расположения геометрических тел) подобной структуры является порядок зацепления или топологическое число сцеплений, обозначаемый символом Lk (от англ. linking — зацепление). Наглядно значение Lk легко представить, мысленно расправив 1 из 2 нитей на плоскости. Тогда 2-я нить, обвиваясь вокруг 1-й, несколько раз пересечет эту плоскость («проткнет» ее насквозь). Число таких сквозных «проколов» и составляет значение числа топологических сцеплений 2 нитей.
Легко видеть, что для линейной молекулы ДНК число сцеплений равно числу дуплексных витков, т. е.
Lk = N / P, (1)
где N — длина молекулы, выраженная в количестве нуклеотидных пар;
Р — шаг двойной спирали, выраженный в числе нуклеотидных пар, приходящихся на 1 виток.
Понятно, что шаг определяется канонической формой молекулы ДНК. Если в результате изменения внешних условий молекула переходит в другую каноническую форму, то шаг двойной спирали изменяется, а с ним пропорционально изменяется топологическое число сцеплений нитей. Это происходит благодаря тому, что
н
1 1
28 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
к концы дуплекса не закреплены относительно друг дру- теля бромистого этидия с ДНК уменьшает осевое кру- О га и могут свободно вращаться вокруг общей оси. чение последней на 26° на каждую молекулу связанноПринципиально иная ситуация возникает при за- го лиганда [38], т. е. увеличивает шаг спирали Р и со-мыкании обеих нитей в кольцо. Важнейшим свой- ответственно уменьшает величину соотношения ством кольцевых молекул ДНК является топологичес- N/P. В условиях кольцевой замкнутой ДНК, для которая инвариантность числа сцеплений, т. е. невозмож- рой значения Lk и N — величины постоянные, это ность изменения числа сцеплений никакими приводит к изменению числа супервитков. В соответ-деформациями молекулы, если сохраняется непрерыв- ствии с уравнением (2) по мере накопления интеркаля-ность сахаро-фосфатных цепей на всем их протяже- тора в гидрофобной области молекулы ДНК сначала нии. Таким образом, кольцевым замкнутым ДНК изна- снижается плотность отрицательной суперспирализа-чально (в момент лигазного замыкания нитей в коль- ции, молекула переходит в релаксированное состоя-цо) «навязано» некое число сцеплений, причем это ние, а затем, при повышении концентрации интеркаля-число выражается целочисленными значениями. Из- тора, образуются положительные супервитки — моле-менение шага двойной спирали в условиях инвариант- кула принимает оппозитную конформацию. ности числа сцеплений приводит к возникновению су- Подобное изменение суперспиральной плотности первитков, т. е. витков, которые образует в простран- замкнутых кольцевых ДНК происходит при их перехо-стве сама ось дуплекса. Количество супервитков т де от одной канонической формы двойной спирали определяется соотношением: к другой (даже на ограниченном участке молекулы): т = Lk — N / P. (2) изменение (среднего) шага дуплекса при инвариантно-Число супервитков, отнесенное к длине дуплекса сти числа сцеплений изменяет число супервитков т. (числу дуплексных витков двойной спирали), называ- Явление суперспирализации кольцевых замкну-ют плотностью суперспирализации ст: тых ДНК открыл в 60-х гг. прошлого века Джером Вист = т X Р / N = (Lk X P / N) — 1. (3) ноград [60], а математическую разработку этого явле-Из уравнения (2) следует, что величина т может ния выполнил Брок Фуллер [27], который обосновал иметь как положительное (включая нулевое), так и от- связь числа сцеплений молекулы с 2 топологическими рицательное значение. Для всех нативных кольцевых характеристиками: Tw (от англ. twisting — кручение) молекул ДНК вирусов и плазмид характерна отрица- и некоторого параметра, описывающего изгибы оси тельная суперспирализация, при которой топологичес- молекулы в пространстве. Последний назван Wr (от кое число сцеплений меньше дуплексного числа витков. англ. writhe — скрючиваться, корчиться). Соотноше-Наличие супервитков приводит молекулу в со- ние имеет вид: стояние упругого осевого напряжения, поскольку Lk = Tw + Wr. (4) энергетически выгодным является так называемое Уравнение (4) обосновывает существование су-релаксированное состояние, т. е. состояние равен- первитков молекулы ДНК в различных геометричес-ства числа сцеплений дуплексному числу витков. ких конфигурациях. Единственный 1-нитевой разрыв сахаро-фосфатной цепи кольцевой замкнутой молекулы ДНК создает 3. СУПЕРСПИРАЛЬНАЯ ДНК точку свободного вращения одной нити относитель- КЛЕТОЧНОГО ЯДРА ЭУКАРИОТ но другой, что приводит к сбрасыванию избыточной Все описанное в предыдущем разделе относится свободной энергии супервитков и изменению числа к суперспирализации кольцевых замкнутых ДНК ви-сцеплений молекулы. русов и плазмид. Однако ДНК эукариот является ли-Возможность запасать свободную энергию в виде нейным полимером, для которого число сцеплений ни-упругой торсионной энергии супервитков во многом тей не является инвариантным, и, следовательно, су-определяет особые свойства суперспиральной ДНК перспирализация его невозможна. Это соответствует и те биологические эффекты, которые связаны с ее су- действительности, если вести речь об изолированных перспиральной конформацией. В частности, суперспи- из состава хроматина препаратах ДНК: таким тща-рализация приводит к ослаблению дуплексных ком- тельно депротеинизированным молекулам не свой-плементарных взаимодействий обеих нитей (вторич- ственна суперспиральная конформация, поскольку ни-ная структура — см. 1.2.), что обусловливает более ти, составляющие дуплекс, не замкнуты и имеют точ-легкое их разделение — локальную денатурацию, ки свободного вращения. Однако в составе хроматина плавление. С этим связана большая транскрипционная молекула ДНК имеет участки прикрепления к жесткой активность суперспиральных плазмид при трансфек- пространственной сетке ядерного матрикса, причем ции в сравнении с их релаксированными формами [42; связи эти таковы, что наделяют отдельные петлевые 46; 47; 56], а также предпочтительное накопление ин- домены — участки линейной молекулы между 2 со-теркалирующих агентов в суперспирализованных седними сайтами перманентного прикрепления участках молекулы [23; 31]. к ядерному матриксу — свойствами кольцевых зам-В то же время интеркаляция отдельных лигандов кнутых молекул: в точках прикрепления обе нити фик-в дуплекс несколько изменяет взаиморасположение сированы, что исключает их взаимное раскручивание. нуклеотидных пар, что меняет шаг двойной спирали Поскольку истинно замкнутых молекул такие домены [61]. Например, связывание фенантридинового краси- не образуют, их именуют квазизамкнутыми (квазицир- ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 і
1 1
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 29
>- кулярными). Другими словами, кроме уже упоминав- Единственным биологическим назначением топо-шихся в разделе 1.3. функций пространственной изомераз является образование топологических изоме-ориентации отдельных участков молекулы ДНК ров ДНК, для чего топоизомеразы обладают эндонук-и фланкирования сайтов инициации транскрипции леазной и лигазной активностями. По механизму осу-и репликации, ядерный матрикс выполняет роль кон- ществления своей активности топоизомеразы формационных ограничений отдельных петлевых до- эукариот подразделяют на 2 типа. Топоизомераза I (ре-менов и их совокупности, т. е. всего генома в целом. лаксирующий фактор, надрезающе-сшивающий фер-Явление суперспирализации ДНК эукариот пред- мент) способна гидролизовать фосфо-эфирную связь сказал в начале 70-х гг. прошлого столетия П. Кук [19]. сахаро-фосфатной цепи молекулы ДНК с одновремен-Вскоре гипотеза блестяще подтвердилась работами са- ным ковалентным присоединением фермента к 3’-кон-мого Кука и ряда других исследователей [20-23; 48; цу образовавшегося разрыва за счет энергии разорван-51]: суперспиральная ДНК была препаративно выде- ной связи. Такая структура, содержащая белок-ассоци-лена из ряда объектов в условиях, исключающих фер- ированный однонитевый разрыв ДНК, является ментативную и гидродинамическую деградацию мате- интермедиатом топоизомеразной реакции I типа. риала. Более того, если процедуру выделения препара- На стадии этого интермедиата происходит дозирован-тов ядерного матрикса изменить таким образом, чтобы ное или полное сбрасывание супервитков через шар-исключить действие эндонуклеаз (в том числе — эндо- нирную точку вращения, образованную 1 -нитевым генных) и минимизировать влияние гидродинамичес- разрывом ДНК. По достижении термодинамически кого сдвига, из клеток можно выделить препараты ос- выгодного состояния исполняется лигазный этап реак-таточных ядер, сохраняющие их форму, некоторые ции, при котором молекула ДНК в месте разрыва сши-черты морфологии и содержащие всю ядерную ДНК вается за счет энергии гидролизуемой связи ДНК-бе-в виде суперспирализованных доменов [21; 48; 51]. Та- лок. Таким образом, процесс не требует затрат энергии кие препараты получили наименование нуклеоиды — АТР (топоизомеразы I не обладают АТР-азной актив-ядроподобные [21]. Нуклеоиды, выделенные из раз- ностью) и обеспечивается исключительно торсионной ных клеток эукариот, широко использовались в качес- энергией супервитков. При наличии супервитков тве изучаемых объектов в дальнейших исследованиях с участием топоизомеразы I происходит их удаление структуры интерфазного хроматина. Подобно кольце- независимо от знака суперспирали, а в присутствии вым замкнутым ДНК вирусов и плазмид, нуклеоиды полного набора коровых гистонов и нуклеоплазмина эукариот во всех случаях содержат отрицательно су- происходит сборка нуклеосом, которая невозможна перспирализованную ДНК, которая легко поддается без топоизомеразы вследствие возникновения тополо-эластовискозиметрическому титрованию бромистым гических напряжений молекулы ДНК при ее «наматы-этидием [1]. вании» на коровые частицы [40]. Таким образом, сня-Обычно нуклеоиды получают, лизируя целые тие возникающих напряжений под действием топоизо-клетки нейтральными концентрированными раствора- меразы изменяет число сцеплений квазизамкнутого ми хлористого натрия (1-2 М №С1) в присутствии не- домена ДНК на любое целочисленное значение, что ионных детергентов (ЫР40, Тритон Х-100) и высоких сдвигает термодинамическое равновесие в сторону об-концентраций ЕОТА. Часто применяют ингибиторы разования нуклеогистонового комплекса; последую-протеолитических ферментов и РНКаз. Столь интен- щее удаление гистонов без разрыва хотя бы 1-й нити сивная обработка позволяет усомниться в реальности ДНК генерирует супервитки. существования суперспиральной конформации ДНК В отличие от описанного фермента, топоизомера-в живой клетке. Действительно, значительное измене- за II обладает собственной АТР-азной активностью ние ионной силы окружения, экстракция белков могут и способна генерировать супервитки ДНК за счет приводить к конформационным переходам молекулы энергии АТР: фермент связывается сразу с обеими ни-ДНК, а дегистонизация хроматина прямо приводит тями дуплекса, производя, подобно топоизомеразе I, к образованию артефактных супервитков — по 2 на белок-ассоциированные разрывы молекулы ДНК, каждую диссоциировавшую нуклеосому. но разрывает одновременно обе нити в сайтах, сме-Однако именно суперспиральной конформацией щенных относительно друг друга на 4 нуклеотида. Так отдельных доменов ДНК, на наш взгляд, объясняется формируется интермедиат топоизомеразной реакции известный факт значительно более низких температур II типа: белок-ассоциированный косой 2-нитевой раз-плавления ДНК в составе хроматина по сравнению рыв с наличием «липких концов». Сквозь этот разрыв с плавлением очищенных препаратов ДНК. Существо- может быть пропущен соседний локус молекулы ДНК, вание обратимой суперспирализации ДНК в эукарио- после чего разрыв воссоединяется, а связь фермента тической клетке подтверждается также фактом сущес- с молекулой ДНК гидролизуется. Если реакция проте-твования особого класса ферментов — топоизоме- кает без участия АТР, то ее результатом, подобно топо-раз — и их жизненной необходимостью для изомеразе I, является только релаксация молекулы за функционирования любого эукариотического организ- счет свободной энергии супервитков. Если же затрачи-ма. Ингибиторы топоизомераз являются сильнейшими вается энергия АТР, то результатом топоизомеразной клеточными ядами, ряд из которых давно и успешно реакции II типа будет генерирование дополнительных используется в онкологической практике [36]. супервитков за счет энергозависимого изменения кон- —(
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
1 1
30 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
к формации фермента. В любом случае топологическое ширение бреши с выщеплением поврежденного осно-число сцеплений молекулы ДНК изменяется на вели- вания, и последующий внеплановый синтез репариру-чину, кратную 2. емой нити ДНК для заполнения образованного на Таким образом, в клетке эукариот функционирует первом этапе однонитевого участка молекулы вновь ферментативный механизм активного регулирования синтезированным фрагментом. Таким образом, фор-суперспиральной конформации ДНК. Аналогичный мирование разрыва нити ДНК при алкилировании ос-процесс в прокариотических клетках бактерий обслу- нований является активным процессом клеточного отживается топоизомеразной активностью гираз, специ- вета, направленным на устранение повреждения, фические ингибиторы которых (налидиксовая кислота, но протекающим с временным образованием еще фторхинолоны — оксофлоксацин, пефлоксацин) явля- большего повреждения. ются мощными антибактериальными лекарствами ши- Если химической модификации подверглись сразу рокого спектра действия. Очевидно, посредством меха- два основания, локализованные в разных нитях ДНК, низма регулируемой суперспирализации ДНК в преде- но в непосредственной близости друг от друга (доста-лах отдельных доменов обеспечивается управление точно вероятное событие при действии бифункцио-процессами транскрипции и репликации — важней- нальных алкилирующих агентов), то эксцизионные шими функциями генетического аппарата [25; 40; 56; 65]. бреши, формируемые репаративной системой в обеих Подавление активности топоизомераз ингибиторами нитях, могут перекрываться, что приводит к возникно-этого фермента (эпиподофиллотоксины — этопозид, вению двунитевого разрыва молекулы ДНК — намно-тенипозид; антрациклиновые антибиотики; митоксант- го более драматичному повреждению, часто не подда-рон; m-AMSA; камптотецин, бисбензимид и др.) со- ющемуся дальнейшей репарации. провождается остановкой пролиферации клетки и уг- Не поддающееся репарации повреждение ДНК нетением транскрипционной активности хроматина. Те грозит наследственным закреплением возникшей муже последствия вызывает ионизирующее излучение, тации, если клетка продолжит репликативный цикл. индуцирующее появление однонитевых разрывов в мо- Периодический контроль за состоянием собственного лекуле ДНК: 2-спиральный домен ДНК, имеющий хотя генома осуществляется в так называемых сверочных бы один 1-нитевой разрыв, перестает быть квазицирку- точках (англ. check-points) клеточного цикла. Извест-лярным, его избыточная энергия суперспирализации ны по крайней мере 4 сверочные точки, в которых про-сбрасывается через образовавшуюся шарнирную точку исходит анализ правильной последовательности собы-вращения, в результате чего затрудняется локальная де- тий репликативного цикла. 3 из них (при переходе из натурация и инициация транскрипции и репликации. фазы G1 в фазу S; собственно в S-фазе; при переходе Как уже упоминалось выше, управление плотнос- G2 в М) связаны с контролем отсутствия повреждений тью суперспирализации доменов ДНК хроматина в молекуле ДНК (G1-S и S), адекватности (S) и полно-может осуществляться по крайней мере 3 регулирую- ты (G2-M) ее репликации. 4-я предназначена для про-щими механизмами: обратимое образование и конден- верки ахроматинового веретена деления (Spindle-сация нуклеосом; локальные конформационные пере- assembly check-point, метафаза митоза). Именно в этих ходы в доменах ДНК, особенно B-Z-переходы [28]; из- точках может быть осуществлен обратимый или необ-менение суперспиральной плотности при образовании ратимый арест пролиферации — типичный результат «шпилек» и крестообразных структур в палиндромных применения цитостатических и цитотоксических хи-последовательностях. Однако минимально необходи- мических соединений, предшествующий активации мым условием существования суперспиральной кон- программы клеточной гибели. формации ДНК является квазизамкнутость ее струк- Ключевым компонентом первых 3 точек является турных доменов. Это положение является принципи- белковый продукт гена ТР53 (прежнее название — альным для использования структурной дискретности Р53) — сравнительно коротко живущий белок, способ-генома с целью избирательного регулирования его ный к многочисленным посттрансляционным модифи-функций. кациям (имеет несколько сайтов фосфорилирования и ацетилирования, модификация которых регулирует 4. СИСТЕМНАЯ РЕАКЦИЯ КЛЕТКИ его полифункциональность), который часто образно НА ЛОКАЛЬНОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ именуют «стражем генома». Например, активируясь СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА при возникновении повреждений ДНК в фазе G1 вслед-Первичными мишенями многих противоопухоле- ствие фосфорилирования специфическими киназами вых цитотоксических соединений являются собствен- АТМ и CHK1/2, белок р53 трансактивирует респонсив-но молекула ДНК или ферменты, обслуживающие ные (регулируемые им) гены, в частности, сигнальных процессы транскрипции и репликации. белков p21WAF1 и GADD45 (от англ. Growth Arrest and Химическая модификация азотистых оснований DNA Damage-induced), компонентов сигнальных путей ДНК (алкилирующие агенты, комплексные соедине- апоптоза (CD95/Fas/Apo-1, FasL, TRAIL, Bax, Bcl-X, ния металлов) влечет за собой активацию эксцизион- 14-3-3, PUMA и др.) и белка Mdm2, контролирующего ной репарации, входе которой производится эндонук- активность самого р53. Активация сигнального пути леазный разрыв нити ДНК на некотором удалении от р53-р21WAF'1-pRb вызывает остановку клеточного цик-сайта повреждения, дальнейшее экзонуклеазное рас- ла в сверочной точке G1-S [7]. ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 I
1 1
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 31
>- Арест клеточной пролиферации в сверочной точке ных опухолей человека несет инактивирующие мута-сопровождается попыткой репарации обнаруженного ции гена ТР53, но их клетки реагируют на примене-повреждения молекулы ДНК. Если эта попытка оказа- ние цитотоксических соединений по той же схеме: ос-лась удачной и корректную структуру ДНК удалось вос- тановка клеточного цикла в одной из его сверочных становить, арест отменяется, и клетка продолжает цикл точек (причем в различных при применении цитоток-деления. Если дефект не ликвидирован, вследствие на- синов разного механизма действия), попытка репара-копления «стрессовой» формы фосфорилированного ции повреждений, активация программы клеточной и ацетилированного белка р53 происходит либо необра- гибели. Следовательно, должна существовать допол-тимый арест пролиферации, либо активируется про- нительная (или дублирующая?) система генетическо-грамма апоптоза — последовательного саморазруше- го контроля. Недавно обнаружены два гена, белковые ния клетки. продукты которых обладают значительной степенью На молекулярном уровне отмена ареста проли- гомологии с белком р53. Это сходство отражено в на-ферации связана с протеасомной деградацией акти- звании новых генов — р63 ир73. Гомология структу-вированного белка р53 после его убиквитинирования ры сопровождается некоторым подобием функций белком Мёш2, выполняющим роль специфической этих белков: белки р63 и р73 способны активировать убиквитин-протеинлигазы (фермента Е3) белка р53. некоторые (но не все) из р53-респонсивных генов [7]. Процесс убиквитинирования белков, подлежащих по- Однако, в отличие от повсеместно экспрессируемого следующей деградации в протеасомах — специфичес- гена ТР53, геныр63 ир73 экспрессированы в клетках ких органеллах клетки, является универсальным меха- лишь некоторых тканей взрослых и в эмбриональных низмом ликвидации поврежденных или ставших не- тканях, в связи с чем не могут конститутивно выпол-нужными белковых молекул, в которых малый белок нять функцию «стражей генома». убиквитин играет роль «печати смерти» для обречен- Сегодня окончательно не установлено, каким обра-ной молекулы. зом клетка воспринимает информацию как о наличии Молекулярный механизм активации программы повреждений ДНК, так и о полноте ее восстановления апоптоза при наличии не репарированных поврежде- в процессе репарации, однако не последнюю роль в та-ний ДНК до сих пор не ясен, но именно индукция ком распознавании играет суперспиральная конформа-апоптоза опухолевых клеток лежит в основе циторе- ция петлевых доменов — состояние упругого осевого дуктивного действия специфической противоопухо- напряжения, необходимое для инициации транскрип-левой радио- и химиотерапии онкологических заболе- ции и репликации. При наличии нитевых разрывов мо-ваний, а репрессия программы смерти ведет к разви- лекулы такое состояние становится невозможным тию множественной лекарственной устойчивости вследствие наличия точки вращения одной нити моле-клеток злокачественных опухолей [4]. Таким образом, кулы вокруг другой. Релаксация домена вызывает бло-ДНК-тропные лекарственные препараты и ингибито- кирование инициации ДНК- и РНК-полимеразной реак-ры топоизомераз проявляют цитотоксическую актив- ции. Таким образом, пространственная архитектоника ность, используя программу генетического самоконт- хроматина является одним из регуляторных факторов роля клеток-мишеней. Активация программы клеточ- управляемого функционирования клеточного генома. ной гибели при воздействии «не-генотропных» лекарственных препаратов происходит по иным моле- Резюмируя изложение, следует выделить основ-кулярным механизмам. ные моменты: Хотя описанный процесс генетического самоконт- • в составе хроматина эукариотических клеток роля активно эксплуатируется клетками для репарации ДНК организована в систему дискретных петель-доме-вызванных лекарственной терапией генетических по- нов, перманентно прикрепленных к элементам ядерно-вреждений, эволюционно он возник задолго до появле- го каркаса; ния химиотерапии и предназначен для ликвидации воз- • точки перманентного прикрепления ДНК никающих соматических мутаций. Некоторые мутации к ядерному матриксу локализованы в сайтах, фланки-гена ТР53 приводят к синтезу дефектного белкового рующих 5’-концевые участки генов или групп генов, продукта, не способного к выполнению своих функций, содержат сайты связывания с регуляторными фактора-либо к полной остановке его синтеза. Последствия та- ми транскрипции; ких мутаций — дестабилизация генома вследствие на- • природа связи ДНК с ядерным матриксом та-копления и клонального закрепления соматических му- кова, что отдельные петлевые домены являются струк-таций, в связи с чем принято говорить о «мутаторном» турными аналогами кольцевых замкнутых молекул (склонном к накоплению мутаций) фенотипе таких кле- ДНК вирусов и плазмид, т. е. домены ДНК имеют кон-ток [7]. Инактивирующие мутации гена ТР53 нередко формационные ограничения, обеспечивающие их ква-сопровождают опухолевый рост: около половины всех зициркулярную структуру; клинически наблюдаемых злокачественных опухолей • транскрипционная активация и репрессия от-человека ассоциированы с такими мутациями. дельных генов и/или групп генов осуществляется дис-Однако система контроля за состоянием собствен- кретно, путем контролируемых конформационных из-ного генома по-видимому не ограничивается функци- менений супрамолекулярного комплекса в пределах ей белка р53. Действительно, половина исследован- отдельных доменов ДНК. —(
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
1 1
32 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
к Автор посвящает настоящую статью памяти свое- 17. Berezney R., Coffey D.S. Identification of a го учителя, коллеги и друга Виктора Александровича nuclear protein matrix // Biochem. Biophys. Res. Comms. Стручкова. — 1974. — Vol. 60. — P. 1410-1417. 18. Boulikas T., HancockR. The laminae protein is in ЛИТЕРАТУРА ultimate contact with the DNA in nuclear skeletons // Biol. 1. Блохин Д.Ю., Стручков В.А. Капиллярная эла- Cell. — 1982. — Vol. 45, № 2. — Sp. Iss. — P.106. стовискозиметрия нуклеоидов эукариот // Биополиме- 19. Cook P.R. Hypotesis of differentiation and the ры и клетка. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 203-211. inheritance of gene superstructure // Nature. — 1973. — 2. Блохин Д.Ю., Стручков В.А. Белковый состав Vol. 245. — P. 23-25. ядерного матрикса изменяется под влиянием липазы // 20. CookP.R., BrazellI.A. Supercoils in human DNA Биополимеры и клетка. — 1989. — 5, № 6. — С. 73-77. // J. Cell Sci. — 1975. — Vol. 19, №2. — P. 261-279. 3. Блохин Д.Ю., Стручков В.А. Белковый состав 21. Cook P.R., Brazell I.A. Conformational con-ядерного матрикса в клетках различных тканей живот- straints in nuclear DNA// J. Cell. Sci. — 1976. — Vol. 22, ных // Биополимеры и клетка. — 1989. — 5, № 1. — С. № 2. — P. 287-302. 41-45. 22. Cook P.R., Brazell I.A., Jost E. Characterization 4. Блохин Д.Ю. Фенотип множественной лекар- of nuclear structures containing superhelical DNA // ственной устойчивости опухолевых клеток, обуслов- J. Cell Sci. — 1976. — Vol. 22, № 2. — P. 303-324. ленный нарушением программы клеточной гибели // 23. CookP.R., Brazell I.A. Spectrofluorometric meas-Вестн. РАМН. — 2004. — № 12. — С. 16-20. urements of the binding of ethidium to superhelical DNA// 5. Караванов А.А., Афанасьев В.Н. Негистоно- Eur. J. Biochem. — 1978. — Vol. 84, № 2. — P. 465-477. вые белки хроматина // Мол. Биол. — 1983. — Т. 17, 24. Douvas A.S., Harrington C.A., Bonner J. Major № 2. — С. 213-233. non-histone proteins of rat chromatin: preliminary identi- 6. Карпов В.Л. ДНК, хроматин, гистоновый код fication of myosin, actin and tropomyosin // Proc. Natl. // Вестник РАН. — 2003. — Т. 73, №6. — С. 506-513. Acad. Sci. USA. — 1975. — Vol. 72, № 10. — P. 7. Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мута- 3902-3906. торные гены. — В кн.: «Канцерогенез» / Под ред. 25. DrogeP. Protein-induced supercoiling of DNA: a Д.Г. Заридзе. — М.: Медицина, 2004. — С. 125-158. tool to regulate DNA transactions in vivo? // BioEssays. 8. Наседкина ТВ., Слезингер С.И. Изменения — 1993. — Vol. 16. — P. 91-99. в структуре нуклеогистоновых фибрилл хромосомы 26. Fields A.P., Kaufman S.H., Shaper J.H.Isolation, при удалении бивалентных катионов и гистона HI // chemical characterization and immune-localization of an Цитология. — 1983. — Т. 25, № 9. — С. 1054-1058. acidic non-histone protein to the nucleolus of rat liver 9. Разин С.В., Чернохвостов В.В., Рудин А.В. nuclei // 8-th Int. Nucle(ol)ar Workshop, Banyuls, 1983. и др. Белки, особо прочно связанные с ДНК в участках — P.30. ее прикрепления к матриксу интерфазного ядра // Докл. 27. Fuller F.B. Decomposition of the linking number АН СССР. — 1982. — Т. 263, № 4. — С. 1019-1021. of a closed ribbon: a problem from molecular biology // 10. Свердлов Е.Д. ДНК в клетке: от молекулярной Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1978. — Vol. 75, № 8. — иконы к проблеме "что есть жизнь?" // Вестник РАН. P. 3557-3561. — 2003. — Т. 73, № 6. — С. 497-505. 28. Gagna C.E., Lambert W.C., Kuo H.-R., 11. Стручков В.А., Стражевская Н.Б., Блохин Д.Ю. Farnsworth P.N. Localization of B-DNA and Z-DNA in Роль дисульфидных мостиков остаточного белка в terminally differentiating fiber cells in adult lens // организации хромосомальной ДНК // Биофизика. — J. Histochem. Cytochem. — 1997. — Vol. 45, №11. — P. 1995. — Т. 40, № 2. — С. 296-316. 1511-1521. 12. Сьяксте Н.И., Блохин Д.Ю. Белковый состав 29. Georgiev G.P., Nedospasov S.A., Bakaev V.V. комплексов ДНК-матрикс с "прочным" и "слабым" типом Supranucleosomal levels of chromatin organization. — “The связи, выделенных из клеток асцитной карциномы Эрлиха cell nucleus” / H.Busch ed., NY, Acad. Press, 1978. — P. 3-34. // Биохимия. — 1989. — Т. 54, № 7. — С. 1217-1223. 30. Gerace L., Blum A., Blobel G. Immunochemical 13. Яровая О.В., Разин С.В. Два типа участков localization of the major polypeptides of the nuclear pore прикрепления ДНК к ядерному скелету в клетках complex-lamina fractions. Interphase and mitotic distribu-асцитной карциномы Эрлиха // Мол. Биол. — 1983. — tion // J. Cell Biol. — 1978. — Vol. 79, № 2. — P. Т. 17, № 2. — С. 303-313. 546-566. 14. Ball P. Portrait of a molecule // Nature. — 2003. 31. Gruzdev A.D., Shurdov M.A. Topological state of — Vol. 421. — P. 421-422. DNA in polytene chromosomes // Biochim. Biophys. Acta. 15. Berezney R. Dynamic properties of the nuclear — 1992. — Vol. 1131. — P. 35-40. matrix // “The cell nucleus” / H.Busch ed., NY: Acad. 32. Hartwig M. The size of independently superPress., 1979. — 7. — P. 413-456. coiled domains in nuclear DNA from normal human and 16. Berezney R., Buchholtz L.A. Isolation and charac- leukemic lymphoblasts // Biochim. Biophys. Acta. — terization of rat liver nuclear matrices containing rat liver 1982. — Vol. 698, № 2. — P. 214-217. high molecular weight DNA // Biochemistry. — 1981. — 33. Honge L.D., Mancini P., Davis F.M., HeywoodP. Vol. 20, № 17. — P. 4995-5002. Nuclear matrix of HeLa S3 cells. Polypeptide composition ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 I
1
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 33
>- during adenovirus infection and in phases of the cell cycle 50. Muller M., Spiess E., Werner D. Fragmentation of // J. Cell Biol. — 1977. — Vol. 72, № 1. — P. 194-208. “nuclear matrix” on a mica target // Eur. J. Cell. Biol. — 34. Igo-Kemenes T., Horz W., ZachauH.G. Chromatin 1983. — Vol. 31. — P. 158-166. // Ann. Rev. Biochem. — 1982. — Vol. 51. — P. 89-121. 51. Mullinger A.M., Johnson R.T. The organization 35. Jupe E.R., Sinden R.R., Cartwright I.L. of supercoiled DNA from human chromosomes // J. Cell Specialized chromatin structure domain boundary ele- Sci. — 1979. — Vol. 38. — P. 369-389. ments flanking a Drosophila heat shock gene locus are 52. Nakayasu H., Ueda K. Association of actin with under torsional strain in vivo // Biochemistry. — 1995. — the nuclear matrix from bovine lymphocytes // Exp. Cell Vol. 34. — P. 2628-2633. Res. — 1983. — Vol. 143, № 1. — P. 55-62. 36. Kaufmann S.H. Induction of endonucleolytic 53. Nowak W., Gawlowska M., Jarmolowski A., DNA cleaved in human acute myelogenous leukemia cells Augustyniak J. Effect of nuclear matrix attachment regions by etoposide, camptothecin and other cytotoxic anticancer on transgene expression in tobacco plants // Acta Biochim. drugs: a cautionary note // Cancer Res. — 1989. — Vol. Polonica. — 2001. — Vol. 4, № 3. — P. 637-646. 49. — P. 5870-5878. 54. Razin S.V., Chernokhvostov V.V., Roodin A.V. et 37. Kaufmann S.H., Coffey D.S., Shaper J.H. al. Proteins tightly bound to DNA in the regions of DNA Considerations on the isolation of rat liver nuclear matrix, attachment to the skeletal structures of interphase nuclei nuclear envelope and pore complex-lamina // Exp. Cell and metaphase chromosomes // Cell. — 1981. — Vol. 27, Res. — 1981. — Vol. 132, № 1. — P. 105-123. № 1. — P. 65-74. 38. Keller W. Determination of the number of super- 55. Rich A., Nordheim A., Wang A.H.-J. The chem-helical turns in simian virus 40 DNA by gel electrophore- istry and biology of left-handed Z-DNA // Ann. Rev. sis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1975. — Vol. 72, Biochem. — 1984. — Vol. 53. — P. 791-846. № 12. — P. 4876-4880. 56. Sekiguchi J.M., Swank R.A., Kmiek E.B. 39. Kemp M. The Mona Lisa of modem science // Changes in DNA topology can modulate in vitro transcrip-Nature. — 2003. — Vol. 421. — P. 419-420. tion of sertain RNAP III genes // Mol. Cell. Biochem. — 40. Kimura K., Hirano T. ATP-dependent positive 1989. — Vol. 85. — P. 123-133. supercoiling ofDNA by 13S condensing; a biochemical 57. Shelton K.R., Guthrie V.N., Cochran D.L. On the implication for chromosome condensation // Cell. — variation of the major nuclear envelope (lamina) polypep-1997. — Vol. 90. — P. 625-634. tides // Biochem. Biophys. Res. Comms. — 1980. — Vol. 41. Kornberg R.D. Structure of chromatin // Ann. 93, № 3. — P. 867-872. Rev. Biochem. — 1977. — Vol. 46. — P. 931-954. 58. Smith H., Berezney R. DNA-polymerase-б is 42. Kramer P.R., Sinden R.R. Measurement of unre- tightly bound to the nuclear matrix of actively replicating strained negative supercoiling and topological domain size liver // Biochem. Biophys. Res. Comms. — 1980. — Vol. in living human cells // Biochemistry. — 1997. — Vol. 18. 97, № 4. — P. 1541-1547. — P. 3151-3158. 59. Tatchell K., Van Holde K.E. Compact oligomers 43. Krohne G., Franke W. W., Scheer U.The major and nucleosome phasing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — polypeptides of the nuclear pore complex // Exp. Cell Res. 1978. — Vol. 75, № 8. — P. 3583-3587. — 1978. — Vol. 116, № 1. — P. 85-102. 60. Vinograd J., Lebovitz J., Watson R. Early and late 44. Kuzmina S., Buldayeva T., Troitskaya L., Zbarsky helix-coil transition in closed circular DNA. The number I.Characterization and fractionation of rat liver nuclear of superhelical turns in polyoma DNA // J. Mol. Biol. — matrix // Eur. J. Cell Biol. — 1981. — Vol. 25, № 2. — P. 1968. — Vol. 33, № 1. — P. 173-197. 225-232. 61. Waring M. Binding of drugs to supercoiled circu- 45. Lima-de-Faria A. The relation between chromo- lar DNA: evidence for and against intercalation // Progr. meres, replicons, operons, transcription units, genes virus Mol. Subcell. Biol. / Springer-Verlag-Berlin, Heidelberg, and palindromes // Hereditas. — 1975. — Vol. 81. — P. New York, 1971. — № 2. — P. 216-315. 249-284. 62. Watson J.D., Crick F.H.C. A structure for 46. Liu L.F., Wang J.C. Supercoiling of the DNA Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. — 1953. — Vol. 171. template during transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. — P. 737-738. USA. — 1987. — Vol. 84. — P. 1353-1358. 63. Wunderlich F., Giese G. The nuclear matrix: 47. Ljungman M., Hanawalt P.C. Presence of nega- modulator of membrane fluidity? / In:”International Cell tive torsional tension in the promoter region of the tran- Biology 1980-1981”/ H.G.Schweiger ed., Springer-scriptionally poised DHFR gene in vivo // Nucl. Acids Verlag-Berlin, Heidelberg, 1981. — P. 205-213. Res. — 1995. — Vol. 23. — P. 1782-1789. 64. Wunderlich F., Herlan G. A reversibely contrac- 48. McCready S.J., Akrigg A., CookP.R. Electron- tile nuclear matrix. Its isolation, structure and composition microscopy of intact nuclear DNA from human cells // J. // J. Cell Biol. — 1977. — Vol. 73, № 2. — P. 271-278. cell Sci. — 1979. — Vol. 39, № 1. — P. 53-62. 65. Yuing C., Gorski J. DNA topology regulates rat 49. Miller T.E., Huang C. Y., Pogo A. O. Rat liver prolactine gene transcription // Mol. Cell. Endocrinol. — nuclear skeleton and ribonucleoprotein complexes con- 1994. — Vol. 99. — P. 183-192. taining hnRNA // J. Cell Biol. — 1978. — Vol. 76, № 4. — P. 675-691. Поступила 09.06.2005. ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
