CC BY
13Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 27 (66). 2014. № 2. С. 73-79.
УДК 577.112:612
ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМЫ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА И ПРОЦЕССОВ НИТРОЗИЛИРОВАНИЯ В ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ
АНЕМИИ
ЁлкинаН.М.1., Коношенко С.В.2
1 Крымский факультет Запорожского национального университета, Симферополь, Республика
Крым, Российская Федерация
2Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, Республика
Крым, Российская Федерация
E-mail: nataleiolkina@gmail com
Показано, что в эритроцитах больных железодефицитной анемией осуществляются изменения в системе синтеза оксида азота, ведущие к преобладанию неокислительного, аргиназного метаболизма над окислительным метаболизмом L-аргинина и к повышению уровня нитрат-анионов. Вместе с этим, прослеживается увеличение содержания в эритроцитах высокомолекулярных продуктов нитрозилирования и снижение содержания низкомолекулярных нитрозотиолов.
Ключевые слова: эритроциты, система синтеза оксида азота, NO-синтазы, NO-анионы, аргиназа, низкомолекулярные и высокомолекулярные нитрозотиолы, железодефицитная анемия.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что многие заболевания характеризуются развитием окислительного стресса в результате нарушения прооксидантно-антиоксидантного равновесия и усиленного протекания свободно-радикальных реакций с участием активных форм кислорода [1-3].
Вместе с этим, за последние годы накопилось достаточно много данных, свидетельствующих о тесной взаимосвязи продукции свободных радикалов кислорода и оксида азота [4]. Имеются данные о том, что оксид азота (NO) является одним из универсальных регуляторов физиологических функций организма с достаточно широким спектром биологического действия [5]. Так, известно, что в оптимальных концентрациях NO улучшает эндотелиальную функцию периферических сосудов, положительно влияет на активность отдельных протеинкиназ, способен ингибировать каспазы, угнетать индукцию апоптоза [6, 7]. Однако, синтез оксида азота в повышенных концентрациях, превышающих допустимый стационарный уровень, может быть причиной развития нитрозативного стресса, обусловленного образованием активных форм азота, прежде всего, пероксинитрита и продукта его деградации диоксида азота [4].
Одним из маркёров нитрозативного стресса рассматривается образование низкомолекулярных и высокомолекулярных нитрозотиолов, в частности, продуктов нитрозилирования протеинов [4].
Ранее было показано, что при железодефицитной анемии в эритроцитах усиливаются реакции перекисного окисления липидов и метгемоглобинообразование [8]. Учитывая это и то, что при ряде заболеваний в патологический процесс вовлекаются эритроциты [8, 9], представляло интерес изучить отдельные показатели системы синтеза оксида азота и процессов нитрозилирования в эритроцитах больных железодефицитной анемией, что и составило цель настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили эритроциты практически здоровых людей (25 доноров станции переливания крови) и больных железодефицитной анемией (20 человек, средний возраст 48,0 лет). В каждой обследованной группе соотношение мужчин и женщин было приблизительно одинаковым. Кровь больных брали на базе Крымского онкологического центра при поступлении в стационар, перед началом лечения.
Гемолиз эритроцитов осуществляли в равном объеме дистиллированной воды, взяв за основу метод Драбкина [10]. Состояние системы синтеза оксида азота оценивали, изучая показатели гемолизатов, характеризующие интенсивность неокислительного (аргиназного) и окислительного (NO-синтазного) метаболизма L-аргинина. Интенсивность неокислительного метаболизма L-аргинина оценивали, определяя активность аргиназы [11]. Интенсивность окислительного превращения аргинина, сопровождающегося синтезом оксида азота de novo, оценивали, изучая активность изоэнзимов NO-синтаз - кальций-зависимой, конститутивной (cNOS) и кальций-независимой, индуцибельной (iNOS) синтазы [12].
Процентную долю активности cNOS (% cNOS) относительно суммарной активности NO-синтаз определяли по формуле:
% cNOS = cNOS ■ 100% / суммарная активность NOS.
Наряду с этим, в гемолизатах эритроцитов определяли содержание стабильных
метаболитов оксида азота - нитрит-анионов ( NO - ) и нитрат-анионов ( NO3 ) [13].
Процессы нитрозилирования оценивали, определяя содержание низкомолекулярных и высокомолекулярных нитрозотиолов [14].
Использовали спектрофотометрические методы биохимического анализа.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как показали результаты исследований, в эритроцитах больных железодефицитной анемией существенно снижается интенсивность конститутивного синтеза оксида азота. Активность кальций-зависимой, конститутивной синтазы оксида азота была на 62,0% меньше по сравнению с контрольной группой доноров (таблица). Интенсивность индуцибельного синтеза оксида азота была значительно больше. Активность кальций-независимой NO-синтазы увеличивалась на 86,0% по сравнению с контрольной группой. Доля
физиологического конститутивного синтеза оксида азота в эритроцитах практически здоровых людей составляла, в среднем, 66% от суммарного синтеза оксида азота, тогда как у больных железодефицитной анемией наблюдалось выраженное снижение данного показателя - до 28,0%.
Поскольку субстратом для КО-синтаз является Ь-аргинин представляло интерес дать оценку неокислительного метаболизма этой аминокислоты, превращающейся под действием энзима аргиназы до мочевины и орнитина.
При изучении активности аргиназы было установлено, что в эритроцитах больных железодефицитной анемией данный показатель возрастал в 3,6 раза по сравнению с контрольной группой. Этот факт является свидетельством активизации неокислительного, аргиназного метаболизма, который конкурирует с окислительным КО-синтазным метаболизмом Ь-аргинина.
Соотношение неокислительного и окислительного метаболизма Ь-аргинина (А^/К08) достоверно увеличивалось в эритроцитах больных: в 4,0 раза по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о преобладании неокислительного метаболизма Ь-аргинина над окислительным, который ведет к образованию оксида азота.
Изучение пулов стабильных метаболитов оксида азота показало, что их содержание в эритроцитах больных претерпевает некоторые изменения. Так,
содержание нитрат-анионов (N0-) возростало на 37% по сравнению с
контрольной группой, тогда как содержание нитрит-анионов (N0-) практически не менялось. Эти данные могут свидетельствовать об активизации процессов окисления оксида азота и ограничении использования N0- - анионов в
метаболических процессах.
Изучение содержания в эритроцитах низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов нитрозилирования показало, что у больных железодефицитной анемией наблюдается достаточно выраженное увеличение уровня высокомолекулярных нитрозотиолов (ВМНТ): в 3,0 раза по сравнению с контрольной группой.
Содержание низкомолекулярных нитрозотиолов (НМНТ), в отличие от ВМНТ, снижалось (на 26,5% по сравнению с контрольной группой).
Поскольку одним из основных представителей низкомолекулярных нитрозотиолов является нитрозоглутатион [4], можно предположить, что при железодефицитной анемии в эритроцитах реализуется механизм высвобождения глутатиона из процессов нитрозилирования для более активного его использования в восстановительных реакциях.
Вместе с этим, существенное увеличение содержания в гемолизатах эритроцитов больных высокомолекулярных нитрозотиолов свидетельствует об активном протекании процессов, ведущих к образованию продуктов нитрозилирования протеинов, главным образом, гемоглобина, на долю которого приходится основное содержание в эритроцитах.
Учитывая, что оксид азота способен конкурировать с кислородом за связь с Бе2+ гемовой группы, можно было бы оценивать нитрозилирование гемоглобина по гему
как один из механизмов регуляции его сродства к кислороду, образования оксигенированной формы.
Таблица
Показатели системы синтеза оксида азота и процессов нитрозилирования
в эритроцитах при железодефицитной анемии (ЖДА) (процентная доля относительно показателя контрольной группы ); M±m
Показатели Обследованные группы
Контрольная группа Больные ЖДА
cNOS 100± 15,0 38,0 ± 5,5**
iNOS 100 ± 16,4 186,2 ± 24,6**
% cNOS 66,3 ± 6,4 28,1 ± 2,9**
Аргиназа 100 ± 8,0 360,0 ± 55,0**
Arg/NOS 100 ± 17,0 410,0 ± 65,3**
NO- 100 ± 18,0 94,2 ± 8,0**
NO- 100 ± 16,0 137,0 ± 13,2**
НМНТ 100 ± 11,3 73,5 ± 9,6**
ВМНТ 100 ± 13,5 302,0 ± 28,0**
* - контроль - 100%; - достоверность отличия показателя относительно контрольной группы (р<0,05).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при железодефицитной анемии в эритроцитах осуществляются метаболические перестройки, связанные с системой синтеза оксида азота и ведущие к преобладанию интенсивности неокислительного, аргиназного метаболизма над интенсивностью окислительного, КО-синтазного метаболизма Ь-аргинина.
Изменения в системе синтеза оксида азота и в образовании низкомолекулярных и высокомолекулярных нитрозотиолов в эритроцитах больных железодефицитной анемией могут иметь определенное значение, влияя на генерирование активных форм азота и уровень свободного глутатиона, а также на функциональное состояние эритроцитарных протеинов, участвующих в процессах нитрозилирования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. В эритроцитах больных железодефицитной анемией осуществляются изменения в системе синтеза оксида азота, ведущие к преобладанию неокислительного, аргиназного метаболизма над окислительным, КО-синтазным метаболизмом Ь-аргинина, а также к повышению уровня N0- -анионов.
2. При железодефицитной анемии в эритроцитах изменяется соотношение низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов нитрозилирования: существенное увеличение содержания высокомолекулярных нитрозитиолов
сочетается с некоторым уменьшением содержания низкомолекулярных нитрозотиолов.
3. Изменения в системе синтеза оксида азота в эритроцитах при железодефицитной анемии могут иметь определенное значение, оказывая влияние на генерирование активных форм азота и поддержку уровня свободного глутатиона.
Список литературы
1. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е.Е. Дубинина, А.В. Пустыгина // Укр. бiохiм. журн. - 2008. - Т. 80, № 6. - С. 5-18.
2. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков // Усп. совр. биол. - 1997. - Т. 117, № 2. - С. 155-169.
3. Меньщиков Е.Б. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньщиков, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин // Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
4. Сагач В.Ф. Пригшчення оксидативного та штрозативного стресу як мехашзм кардю- i вазо протекторно! дп екдистерону за умов експериментального цукрового дiабету I типу / В.Ф. Сагач, Ю.П. Коркач, А.В. Коцюруба, О.Д. Присяжна // Фiзiол. журн. - 2008. - Т. 54, № 5. - С. 46-54.
5. Акопова О.В. Оксид азоту пригшчуе вщкриття мiтохондрiальноl пори i збшьшуе кальщеву емшсть м^охондрш in vivo / О.В. Акопова, А.В. Коцюруба, Ю.П. Ткаченко, В.Ф. Сагач // Фiзiол. журн. -2005. - Т. 51, № 3. - С. 3-11.
6. Ping P. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric-oxide-induced and ischemia-induced preconditioning / P. Ping, H. Takano, J. Zhang et al // Circulat. Res. - 1999. - V. 84. - P. 587-604.
7. Li J. Nitric oxide suppresses apoptosis via interrupting caspase activation and mitochondrial dysfunction in cultured hepatocytes / J. Li, C.A. Bombeck, S. Yang, Y.M. Kim, T.R. Billiar // J. Biol. Chem. - 1999. -V. 274. - P. 17325-17333.
8. Ёлкина Н.М. Энзиматическая активность эритроцитов человека при ишемической болезни сердца в условиях развития окислительного стресса / Н.М. Ёлкина, С.В. Коношенко, И. Шашуа // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. - Серия: Биология, химия. - 2011. - Т. 24 (63), № 2. - С. 124-128.
9. Новицкий В.В. Белковый спектр мембран эритроцитов у больных раком легкого и с опухолями головы и шеи / В.В. Новицкий, В.Е. Гольберг, М.В. Колосова и др. // Бюл. эксперим. биол. и медиц. -1999. - Прил. 1. - С. 18-20.
10. Drabkin D. A simplified technique for large scale crystallization myoglobin and haemoglobin in the crystalline / D. Drabkin // Arch. biochem. - 1949. - V. 21. - P. 224-226.
11. Шугалей В.С. Содержание мочевины и активность аргиназы в органах крыс при акклиматизации к холоду / В.С. Шугалей, А.С. Козина // Физиол. журн. СССР. - 1977, № 8. - С. 1199-1202.
12. Chin S.Y. Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG Il-infused hypertensive rats / S.Y. Chin, K.N. Pandey, S.J. Shi et al // Amer. J. Physiol. - 1999. - V. 277, N 5. -P. 797-804.
13. Green L.L. Analysis of nitrate, nitrite and [N^J-nitrate in biological fluids / L.L. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski et al // Anal. Biochem. - 1982. - V. 126, N 1. - P. 131-138.
14. Gerdal D. Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc / D. Gerdel, A.J. Cederbaum // Biochemistry. - 1996. - V. 35, N 50. -P. 16186-16194.
15. Villa Bianca R. Sphingosine 1-phosphate induced endothelial nitric-oxide synthase activation through phosphorylation in human corpus cavernosum / R. Bianca Villa, R. Sorrentino, C. Imbimbo et al // J. Pharmacol. Exp. Therap. - 2006. - V. 316, N 2. - P. 703-708.
Йолкша Н.М. Особливост системи синтезу оксиду азоту i проце«в нiтрозилювання в еритроцитах за защзодефщитнш анемИ / Н.М. Йолкша, С.В. Коношенко // Вчеш записки Тавршського нацiонального унiверситету îm. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, хiмiя". - 2014. -Т. 27 (66), № 2. - С. 73-79.
Показано що в еритроцитах хворих на за^зодефщитну анемто вщбуваються змiни у системi синтезу оксиду азоту, що веде до переваги неокисного, арпназного метаболiзму над окисним метаболiзмом L-аргiнiну i до збшьшення рiвня нiтрат-анiонiв.
Разом iз тим, спостерiгаeться збiльшення вмiсту в еритроцитах високомолекулярних продук™ нiтрозилювання i зниження вмюту низькомолекулярних нiтрозотiолiв.
Ключовi слова: еритроцити, система синтезу оксиду азоту, NO-синтази, NO-анюни, аргiназа, низькомолекулярш i високомолекулярнi нiтрозотiоли, залiзодефiцитна анемiя.
PECULIARITIES OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS SYSTEM AND PROCESSES OF NITROSYLATION IN ERYTHROCYTES UNDER IRON- DEFICIENCY
ANEMIA
Yolkina N.M.1, Konoshenko S. V.2
1Crimea faculty of Zaporogie National University, Simferopol, Crimea Republic, Russia 2Tavrida National V.I. Vernadsky University, Simferopol, Crimea Republic, Russia E-mail: nataleiolkina@gmail.com
Elucidation of the molecular basis of various diseases and pathological states of human organism is one of the most significant problems of medicine and biology [1-3]. It is known, that the ways of production of free radicals of oxygen and nitric oxide are closely binded [4]. The synthesis of nitric oxide over standard level may causes nitrosative stress, that is binded with active forms of nitric oxide, for example, peroxinitrite and nitric dioxide [4]. The formation of nitrosothiols is one of the markers of nitrosative stress also [4, 5]. Given that under some diseases erythrocytes are involved in pathological process [6, 7], the aim of the present work was to study the indexes of the system of nitric oxide synthesis and nitrosylation in erythrocytes of patients with iron-deficiency anemia. The materials for the study were the erythrocytes of healthy subjects (control group) and patients with iron-deficiency anemia (20 patients, middle age - 48 years). The blood was taken in Crimean Oncological Centre before treatment for an illness. The erythrocytes were hemolisated by distilled water. In hemolisates of erythrocytes was determined the
content of NO-anions (NO- and NO-) [8], low-molecular and high-molecular products
of nitrosylation [9] and the activity of arginase [10], cNOS and iNOS [11]. For studing all indexes the spectrofotometric methods of biochemical analysis were used. It has been shown, that in erythrocytes of patients with iron-deficiency anemia the system of nitric oxide synthesis is changed. The metabolism of L-arginine by arginase prevailes over oxidative metabolism with NO-synthesis (was 300% higher as compared with control group). The activity of Ca2+-dependent NO-synthase was lowered (62,0 % less as compared with control group). The activity of Ca2+-independent nitric oxide synthase was
rised (86,0% higher as compared with control group). The accumulation ofNO- -anions in erythrocytes of patients was on the level of control group. The content of NO- was
more as compared with control group (37,0%, accordingly). The level of low-molecular products of nitrosylation was 26,5% less as compared with control group. It is known that nitrosoglutatione is one of the main low-molecular products of nitrosylation [4]. The lowering of the content of low-molecular products in erythrocytes of patients with iron-deficiency anemia may be as index of releasing of glutatione from processes of nitrosylation for it more active utilization in reductative reactions.
At the same time, the content of high-molecular products of nitrosylation was rised (200,0% higher as compared with control group). So far as the high-molecular products are, in the main, nitrosylated proteins, these changes in erythrocytes of patients with iron-deficiency anemia may have certain influence on structural-functional state of erythrocytes proteins, in particular, of haemoglobin. It is known, that nitric oxide may be connected with haem iron and to prevent oxygenation of haemoglobin. The changes that are observed in the system of nitric oxide synthesis in erythrocytes of patients with iron-deficiency anemia may have influence on generation of nitric active forms and the level of reductated glutathione also.
Thus, under iron-deficiency anemia the metabolic changes are realized in erythrocytes, the development of nitrosative stress is accompanied by realization of some compensative reactions.
Keywords: erythrocytes, system of nitric oxide synthesis, arginase, NO-synthases, NO-anions, low-molecular and high-molecular products of nitrosylation, iron-deficiency anemia.
References
1. Dubinina E.E., Pustigina A.V., Oxidative modification of proteins, it importance in pathological states, Ukr. biochem. J., 80, 6, 5 (2008).
2. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Oxidative stress under inflammation, Impr. mod. biol., 117, 2, 155 (1997).
3. Menshikov E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Oxidative stress: pathological states and diseases, 284 p. (ARTA, Novosibirsk, 2008).
4. Sagach V.F., Korkach U.P., Kotsuruba A.V., Prysyazhna O.D., The inhibition of oxidative stresses by ecdysterone as the mechanism of the cardio- and vasoprotective action at type I diabetes, Physiol. J., 54, 5, 46 (2008).
5. Akopova O.V., Kotsuruba A.V., Tkachenko U.P., Sagach V.F., Nitric oxide suppresses permeability, transition pore opening and enhances calcium uptake in mitochondria in vivo, Physiol. J., 51, 3, 3 (2005).
6. Yolkina N.M., Konoshenko S.V., Shashua I., Enzym activity of human erythrocytes under ischemic heart desease, Scientific Notes Taurida National V.I. Vernadsky University, 24 (63), 2, 124 (2011).
7. Novitski V.V., Goldberg V.E., Kolosova M.V., Protein spector of erythrocyte membranes of patients with lung cancer and tumours of head and neck, Bul. experim. biol. and med., suppl. 1, 18 (1999).
8. Green L.L., Wagner D.A., Glogowski J., Analysis of nitrate, nitrite and [N^J-nitrate in biological fluids, Anal. Biochem., 126, 1, 131 (1982).
9. Gerdal D., Cederbaum A.J., Inhibition of the catalitic activity of alkoholdegydrogenase by NO is associated with S-nitrosylation and the release of zinc, Biochemistry, 35, 50, 16186 (1996).
10. Shugaley V.S., Kozina A.S., Content of urea and arginase activity in rats organs under acclimatization for cold, USSR Physiol. J., 8, 1199 (1977).
1. Chin S.Y., Pandey K.N., Shi S.J., Increased activity and expression of Ca2+ - depended NOS in renal cortex of ANG II-infused hypertensive rats, Amer. J. Physiol., 277, 5, 797 (1999).
Поступила в редакцию 12.04.2014 г.
