CC BY
98
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013
УДК 61591 С. Ю. МЕДВЕДЕВА
И. Г. ДАНИЛОВА И. Ф. ГЕТТЕ В. Г. СЕНЦОВ
Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН, г. Екатеринбург
Уральская государственная медицинская академия, г. Екатеринбург
ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ
ПРОЦЕССОВ В ПЕЧЕНИ
ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЯДОВ
РАЗЛИЧНОЙ ТРОПНОСТИ
НА ФОНЕ МОДУЛЯЦИИ
АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ
В эксперименте на животных дана сравнительная характеристика регенераторных процессов в печени при действии двух ядов — четыреххлористого углерода и полигексаметиленгуанидин гидрохлорида на фоне модуляции активности макрофагов. Установлено, что компенсаторные механизмы восстановления структуры печени при действии четыреххлористого углерода на фоне лечения осуществляются вследствие увеличения интенсивности процессов как клеточной, так и внутриклеточной регенерации. При действии полигексаметиленгуанидин гидрохлорида структура печени восстанавливается за счет механизмов клеточной гиперплазии. Ключевые слова: токсическое повреждение, гепатоцит, альтерация, воспаление, макрофаг.
Отравление четыреххлористым углеродом (СС14) по биохимическим показателям и морфологической характеристике близко к острым повреждениям печени различной этиологии, наблюдаемым у человека. Характер поражения печени в этом случае зависит от количества и концентрации вводимого СС14. Токсический гепатит, вызванный употреблением спиртсодержащих жидкостей, в состав которых входит полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ), протекает крайне тяжело, при этом отмечается высокая летальность пациентов [1—3]. Механизм действия ПГМГ не до конца выяснен.
Гепатотоксические вещества, оказывая специфическое токсическое воздействие на печень, одновременно в значительной степени поражают внутриклеточные элементы почек. Кроме того, в этот процесс вовлекаются легкие, сердце, кроветворная и другие системы организма. В связи с этим для успешного лечения химической травмы необходимы разнонаправленные мероприятия: детоксикация, коррекция системы гемостаза, профилактика инфекции, поддержание сердечно-сосудистой деятельности, стимуляция иммунной системы [4].
С одной стороны, клетки иммунной системы, или макрофаги, участвуют в детоксикации организма, поскольку содержат такие ферменты, как цитохром Р450, оксидазы, неспецифические гидролазы и ме-тилазы. С другой стороны, резидентные макрофаги органов и тканей образуют первичный барьер защиты организма от инфицирования и действия аутоан-
тигенов, образующихся при токсическом повреждении тканей. Микробицидная функция макрофагов формируется за счет реализации механизмов, происходящих в самой клетке: синтеза провоспалитель-ных цитокинов, эйкозаноидов, дефензинов, оксида азота и активных форм кислорода. Фагоцитируя фрагменты некротических клеток и полимеры, макрофаги очищают очаг воспаления для регенерации, создавая тем самым необходимые условия для восстановительного роста тканей. Кроме того, макрофаги самостоятельно усиливают регенерацию, поскольку вырабатывают факторы роста, а также биологические активные вещества, стимулирующие митогенетические процессы в тканях.
Цель исследования — разработка нового подхода к восстановлению печени при химической травме путем воздействия на макрофаги и систему иммунологической защиты организма в целом.
Материал и методы исследования. Эксперимент проведен на 50 самцах белых беспородных крыс массой 200 — 300 г в соответствии с рекомендациями международных этических комитетов по гуманному обращению с лабораторными животными. Для создания экспериментальной модели использовали водный раствор ПГМГ и масляный раствор СС14. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/100 г массы тела. В связи с тем что летальность от одноразового введения ПГМГ была около 70 %, то препарат вводили дробно (по 17 мг/100 г) в течение суток. Животных разделили на пять групп: в I груп-
Влияние токсического действия четыреххлористого углерода на показатели клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов (М ± т)
Показатель Группа
контроль II ССІ4, 3-и сут III CC^ + ММ, 3-и сут IV CCl4, 7-е сут V CC^ + ММ, 7-е сут
Митотический индекс, %0 0,5 ± 0,33 43,7 ± 0,23* 55,1 ± 0,23* + 28,6 ± 0,12* + 23,0 ± 0,15* +
К167-позитивные клетки 14,3 ± 1,5 47,6 ± 10,9* 23,4 ± 9,8 14,3 ± 2,6 + 5,2 ± 1,3 +
Двухъядерные клетки, % 15,4 ± 1,43 51,8 ± 0,34* 69,2 ± 0,20* + 51,5 ± 0,15* 43,3 ± 0,47* +
Индекс альтерации, % 21,8 ± 1,54 333,2 ± 27,62* 253,5 ± 0,86 421,5 ± 0,15* + 447,3 ± 0,48* +
Примечание, здесь и далее. I группа - интактные крысы; II группа - крысы, получавшие СС14, 3-и сутки наблюдения;
III группа - крысы, получавшие СС14, + модуляция макрофагов (ММ), 3-и сутки наблюдения;
IV группа - крысы, получавшие СС14, 7-е сутки наблюдения; V группа - крысы, получавшие СС14, + модуляция макрофагов, 7-е сутки наблюдения. * - р < 0,05 в сравнении с интактными животными; + - р < 0,05 в сравнении с параметрами 3-х суток.
Таблица 2
Влияние токсического действия полигексаметиленгуанидин гидрохлорида на показатели клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов (М ± т)
Показатель Группа
контроль II ПГМГ, 3-и сут III ПГМГ + ММ, 3-и сут IV ПГМГ, 7-е сут V ПГМГ + ММ, 7-е сут
Митотический индекс, % 0,5 ± 0,33 39,7 ± 0,22* 38,3 ± 0,18* 40,3 ± 0,16* 45,60,14* +
К167-позитивные клетки 14,3 ± 1,5 5,9 ± 2,5* 66,3 ± 46,8 32,0 ± 9,2* + 96,7 ± 9,0*
Двухъядерные клетки, % 15,4 ± 1,43 96,9 ± 0,33* 65,1 ± 0,14* 76,8 ± 0,18* + 61,2 ± 0,24*
Индекс альтерации, % 21,8 ± 1,54 77,3 ± 0,62* 89,5 ± 0,12* 315,5 ± 0,44* + 356,6 ± 0,40* +
пу вошли интактные крысы, во II — крысы, отравленные CCl4, в III — крысы, отравленные ПГМГ, в IY — крысы, отравленные совместным введением CC14 и 3-аминофталгидразида, и в Y группу — крысы, отравленные совместным введением ПГМГ и 3-аминофталгидразида. 3-аминофталгидразид — это иммуномодулятор, способный стимулировать функционально-метаболическую активность макрофагов (внутримышечно по 2 мг/кг). Животных выводили из эксперимента на 3-и и 7-е сутки.
Образцы ткани печени и почек для гистологического исследования подготавливали на автоматическом процессоре Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пирофуксином по Ван-Гизону и Вейгерту. Структурное исследование проводили на микроскопе Leica DM 2500, изображения анализировали в программе «ВидеоТесТ-Морфология 5.0» Морфометрически определяли индекс альтерации, митотический индекс и количество двухъядерных клеток.
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование печени осуществляли с использованием Autostai-ner DAKO на формалин-фиксированных, цинк-фик-сированных и парафиновых срезах с предварительной термической обработкой срезов в Pascal DAKO. Вначале применяли моноклональные антитела purified mouse antihuman Ki67, antirat CD3 clone G 4.18, CD45 clone OX-1 CD45 RA, clone OX-33, которые в разведении 1:30 инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре, а затем вторичные антитела biotin goat antimouse (multiple adsorption) в разведении 1:50. Антигенреактивные клетки выявляли при помощи тест-системы NovolinkTM Polymer Detection System (Novocastra Lab., Ltd), контрастируя их хромогенным субстратом (3,3-диаминобензи-дин в буферном растворе). DAB-позитивные клетки идентифицировали по коричневому гранулярному окрашиванию цитоплазмы клеток. Проводили нега-
тивный и изотипический контроль, оценивая в срезах количество клеток с различной интенсивностью положительной ИГХ-реакции.
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программного пакета Microsoft Excel 7.0 для Windows 95. Определяли средние арифметические значения в группах и ошибки средних арифметических. Результаты анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа, считая различия между группами достоверными при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. При введении CCl4 на 3-и сутки развивались признаки острого токсического гепатита, сопровождавшиеся выраженным экссудативным воспалением, интенсивность которого снижалась к 7-м суткам эксперимента [5 — 7]. Иную морфологическую картину обнаруживали на фоне модуляции активности макрофагов 3-амино-фталгидразидом — минимальную степень повреждения паренхимы печени на оба срока после введения токсиканта. При этом сохранялись нарушения со стороны сосудов системы микроциркуляции в виде полнокровия центральных вен и вен портальных трактов, перипортально скапливались лимфоциты и единичные макрофаги, полиморфноядерные лейкоциты были единичны. По периферии печеночных долек определяли очаговые некрозы гепатоцитов без перифокальной клеточной реакции.
Через трое суток после введения ПГМГ в печени выявляли нарушения со стороны сосудов микроцир-куляторного русла в виде диффузного полнокровия синусоидальных капилляров, центральных вен и вен портальных трактов с формированием сладжа. В части вен портальных трактов обнаруживали признаки тромбообразования.
На фоне модуляции активности макрофагов к 3-м суткам эксперимента сохранялись очаговые нарушения со стороны системы микроциркуляции. В паренхиме органа, просветах синусоидов и
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (118) 2013 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
перипортально присутствовали круглоклеточные инфильтраты, представленные преимущественно малыми и средними лимфоцитами и макрофагами. Клетки Купфера были с признаками функциональной активности.
К 7-м суткам нарастали деструктивные процессы в печени со слабовыраженной воспалительной реакцией. На фоне модуляции активности макрофагов степень деструкции гепатоцитов была минимальна, однако в паренхиме органа обнаруживали очаговые скопления лимфоцитов и макрофагов.
Морфометрически установлено, что через трое суток после введения СС14 на фоне высокого индекса альтерации и модуляции активности макрофагов у животных более интенсивно протекают процессы как клеточной, так и внутриклеточной регенерации гепатоцитов. Митотический индекс, количество двухъядерных клеток в ткани печени и количество Ю67-позитивиых клеток возрастают по сравнению с нелечеными животными. Через неделю эти показатели снижаются, значительно превышая аналогичные параметры интактных крыс (табл. 1).
Митотический индекс после введения ПГМГ на фоне модуляции активности макрофагов был достоверно выше контрольных значений только на 7-е сутки после введения токсиканта. Экспрессия маркера Ю67 гепатоцитами при лечении возрастала как на 3-и, так и на 7-е сутки эксперимента, что доказывает потенциальную готовность клеток печени к делению. Количество двухъядерных клеток увеличилось по сравнению с интактными животными. Индекс альтерации значительно увеличился к 7-м суткам эксперимента (табл. 2).
Выводы
1. Стимуляция макрофагальной активности 3-аминофталгидразидом усиливает регенераторные процессы в печени вне зависимости от типа токсиканта.
2. В печени при введении четыреххлористого углерода и на фоне модуляции макрофагов снижается тяжесть воспаления, меняется характер деструктивных процессов в гепатоцитах, активируются механизмы как клеточной, так и внутриклеточной регенерации, что особенно выражено на третьи сутки эксперимента.
3. Уменьшение структурных повреждений при интоксикации полигексаметиленгуанидин гидрохлорида в условиях иммуномодуляции протекает с усилением механизмов клеточной регенерации; показатели внутриклеточной регенерации изменяются незначительно.
Библиографический список
ции и внедрения современных диагностических и лечебных технологий в практической токсикологической помощи пострадавшим от острых химических воздействий. — Екатеринбург, 2008. - С. 103-105.
2. Особенности клинической картины и лечения острых отравлений суррогатами алкоголя / В. Э. Вальтер [и др.] // Проблемы стандартизации и внедрения современных диагностических и лечебных технологий в практической токсикологической помощи пострадавшим от острых химических воздействий. — Екатеринбург, 2008. — С. 88-90.
3. Новикова, О. В. Острые отравления полигексаметиленгуанидин гидрохлоридом. Есть ли отдаленные последствия? /
О. В. Новикова // Проблемы стандартизации и внедрения современных диагностических и лечебных технологий в практической токсикологической помощи пострадавшим от острых химических воздействий. — Екатеринбург, 2008. — С. 115 — 116.
4. Элленхорн, М. Дж. Медицинская токсикология: диагностика и лечение отравлений у человека / М. Дж. Элленхорн. — М. : Медицина, 2003. — С. 183— 185.
5. Влияние макрофагального звена иммунной системы на морфо-функциональное состояние печени на ранних этапах формирования токсического гепатита у крыс / В. Г. Сенцов [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2009. — № 2. — С. 300 — 302.
6. Роль макрофагов в патогенезе токсического гепатита у крыс / В. Г. Сенцов [и др.] // Уральский медицинский журнал. — 2010. — № 9. — С. 127—131.
7. Активация синусоидальных клеток как фактор пролиферации гепатоцитов при диффузном и локальном повреждении печени / Б. Г. Юшков [и др.] // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2012. — № 9. — С. 33 — 36.
МЕДВЕДЕВА Светлана Юрьевна, кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН.
ДАНИЛОВА Ирина Георгиевна, доктор биологических наук, доцент, заведующая лабораторией морфологии и биохимии Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН.
ГЕТТЕ Ирина Фёдоровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Института иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН. СЕНЦОВ Валентин Геннадьевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ, заведующий кафедрой токсикологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки Уральской государственной медицинской академии.
Адрес для переписки: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.
1. Бонитенко, Е. Ю. Влияние полигексаметиленгуанидин гидрохлорида на токсичность этилового спирта / Е. Ю. Бонитенко, А. Н. Петров, М. К. Шевчук // Проблемы стандартиза-
Статья поступила в редакцию 04.04.2013 г.
© С. Ю. Медведева, И. Г. Данилова, И. Ф. Гетте, В. Г. Сенцов
