CC BY
108
УДК 569.323.4:616.36-002.1
И.О. Убашеев, К.С. Лоншакова, И.М. Бальхаев, Е.И. Убашеева
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЛАВОНОИДОВ ФИТОСРЕДСТВА «ДИГ-ДА-ШИ-ТАН» У БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ОСТРОМ ССЦ-ГЕПАТИТЕ
Бурятский государственный университет (Улан-Удэ) Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ )
В работе установлено, что применение лекарственного средства тибетской медицины «диг-да-ши-тан» обусловливает более ускоренное, чем. в контроле, восстановление уровней содержания. ДНК, гликогена, уровней активности, ферментов в гепатоцитах, снижение жировой инфильтрации, в печени, стимуляцию клеточной и. внутриклеточной регенерации органа на фоне торможения перекисного окисления липидов в мембранных структурах.
Ключевые слова: диг-да-ши-тан, гепатите, печень
HEPATOTREAD MECHANISM OF FLAVONOiDS OF PHYTOREMEDY «DiG-DA-SHi-TAN» ACTING IN WHITE RATS AT ACUTE CCL4-HEPATITE
I.O. Ubasheev, K.S. Lonshakova, I.M. Balhaev, E.I. Ubaseeva Buryat State University, Ulan-Ude Institute of general and experimental Biology, Ulan-Ude
It was established, that use of Tibet medicine remedy «dig-da-shi-tan» causes faster, than in control group recovery of content levels of DNA, glycogen, levels of ferments activity in hepatocytes, decrease of the fat infiltration in liver, stimulation, of cellular and intracellular regeneration, of organ the same as inhibition, of lipid, peroxidation, in membrane structures.
Key words: dig-da-shi-tan, hepatite, liver
В работе установлено, что применение лекарственного средства тибетской медицины «диг-да-ши-тан» обусловливает более ускоренное, чем в контроле, восстановление уровней содержания ДНК, гликогена, уровней активности ферментов в гепатоцитах, снижение жировой инфильтрации в печени, стимуляцию клеточной и внутриклеточной регенерации органа на фоне торможения перекисного окисления липидов в мембранных структурах.
Полученные данные свидетельствуют о том, что применение «диг-да-ши-тан» предотвращало выраженные деструктивные изменения гепатоцитов за счет ингибирующего влияния антиоксидантов, содержащихся в испытуемом средстве, на пере-кисное окисление липидов мембран и стабилизацию последних, что обусловливало усиление нуклеинового обмена, ускорение митоза, появление гипертрофированных и двуядерных клеток, т.е. интенсификацию клеточной и внутриклеточной регенерации. К этому, в основном, сводятся гепа-топротекторные механизмы влияния испытуемого лекарственного средства.
При анализе описаний болезней печени, методов и средств их лечения в тибетских письменных источниках обращает на себя внимание широкое применение горечавки бородатой — Gentiana Bar-bata Бше! (по тибетски «диг-да»).
Существует 4 различных варианта прописей «диг-да-ши-тан» («горечавка — 4»), рекомендуемые в тибетской медицине для лечения болезней печени.
Прописи с горечавкой бородатой применялись в зависимости от динамики симптомов и синдромов
воспаления печени. В рецептуре замена одних компонентов другими проводилась по принципу системности и этажности в лечении, а также в зависимости от индивидуальных свойств каждого компонента.
При «холодных» болезнях печени (хронических гепатитах) назначался препарат по прописи № 1, состоящий из цветков горечавки бородатой, травы зубчатки красной, плодов эмблики лекарственной, корней софоры желтоватой.
Нам представлялось интересным экспериментальное изучение лекарственного средства по прописи № 1, ее модифицированного варианта, где эмблика лекарственная была заменена на яблоню ягодную (чжу-ру-ра). Замену индийского сырья на местное в практике лам Монголии и Забайкалья установили еще А.Ф. Гаммерман и Б.В. Семичев [2]. В целях выяснения достоверности указанной замены рядом авторов было проведено экспериментальное изучение фармакологических свойств яблони ягодной, исходя из сведений о «чжу-ру-ра» из трактатов тибетской медицины [1, 3]. Авторами установлено, что средство из яблони ягодной обладает противовоспалительной, желчегонной и мочегонной активностью.
Также были изучены фармакологические свойства других компонентов прописи № 1. Средство из горечавки бородатой показало положительный эффект на функциональное состояние печени при остром гепатите [12—14]. Установлено, что лекарственное средство из горечавки бородатой, содержащее полифенольный комплекс, обладает противовоспалительной и стимулирующей регенерацию печени активностью.
Третий компонент прописи — это зубчатка красная. Препарат из нее обладает мембраностабилизирующим действием [8]. Сухой экстракт зубчатки красной почти не уступает по эффективности аллохолу [9].
Софора желтоватая — четвертый компонент исследуемой прописи. Она может с успехом быть заменена на софору японскую. По сведениям из литературы она обладает свойством повышать артериальное давление, суживать сосуды, а также оказывать некоторое наркотическое действие [4].
Таким образом, в четырех прописях «диг-да-ши-тан» горечавка бородатая является основным компонентом, назначаемым при различных клинических формах, симтомокомплексах поражений печени, в частности, гепатоцитов.
Цель выполненной работы сводилась к оценке механизмов гепатозащитного влияния «диг-да-ши-тан» из арсенала тибетской медицины при остром токсическом повреждении печени белых крыс четыреххлористым углеродом.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Острый токсический гепатит у белых крыс вызывали путем введения четыреххлористого углерода (CCLJ в виде 50%-ного масляного раствора в объеме 0,4 мл/100 г массы животного, трехкратно через день, подкожно. Печень декапитированных животных подвергали исследованию на 7, 14, 21 сутки с начала эксперимента. Испытуемое лекарственное средство «диг-да-ши-тан» вводили в течение 14 дней внутрижелудочно в дозе 0,3 г/кг массы крысы. В качестве препарата сравнения животным вводили аллохол в дозе 80мг/кг. Животным контрольной группы вводили только раствор CCL4.
Всего в опытах использовано 80 белых беспородных крыс массой 170 — 200 г.
Учитывая, что при патологиях органов гепа-тобилиарной системы имеют место нарушения окислительно-восстановительных процессов, активности ферментных систем и целый ряд нарушений обмена веществ, использован набор методик, позволяющих определить характер и степень изменений в организме животных под влиянием природных средств. О фармакотерапев-тической активности последних судили по степени активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) [5], активности щелочной фосфатазы (унифицированный метод Вассея, Лоури, Брока с использованием набора реактивов Био — Ла — Тест (Чехословакия), по концентрации холестерина (метод Илька) и бе-талипопротеидов (метод Бурштейна и Самай), содержанию общего белка (биуретовая реакция), количеству общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови (метод Йендрашека) и показателю тимоловой пробы — метод Хуэрго и Поппер с использованием набора реактивов Био
— Ла — Тест (Чехословакия).
Для взятия гистоматериала белых крыс умертвляли декапитацией. Кусочки печени фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина.
Депарафинированные гистологические срезы органа толщиной 6 — 8 мкм для оценки общей морфологической картины и для исследования митотической активности гепатоцитов и подсчета двуядерных и гипертрофированных печеночных клеток окрашивали по общепринятой методике гематоксилин-эозином [7].
Подсчет гепатоцитов осуществляли под иммерсионным увеличением.
В свежезамороженных срезах печени, полученных на микротокриостате МК — 25, определяли количество гликогена ШИК-реакцией, нейтральных жиров — суданом черным «Б», активность сукци-натдегидрогеназы (СДГ-азы) и лактатдегидрогена-зы (ЛДГ-азы) — по Нахласу, активность щелочной и кислой фосфатаз — по Гомори [10].
Микроскопирование и микрофотографирование гистологических, гистохимических препаратов осуществляли на немецком микроскопе «Motic» со встроенной видеокамерой и с помощью ряда прикладных компьютерных программ.
Цифровые данные, полученные в опытах, обрабатывали по параметрическому критерию (t) Стьюдента—Фишера [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
При введении испытуемого средства белым крысам с острым токсическим гепатитом на 7 сутки наблюдений в отличие от контроля только в единичных случаях выявлены в печени крыс некротические очажки. В очажках клеточной инфильтрации по ходу сосудов можно было видеть значительное количество макрофагальных элементов. В гепатоцитах обнаружена мелко- и реже среднекапельная жировая дистрофия, в то время как у контрольных животных жировая инфильтрация в виде крупных капель жира охватывает большую часть дольки печени.
Данные исследования митотической активности гепатоцитов и подсчета двуядерных и гипертрофированных клеток печени приведены в таблице 1.
Наибольший пик митотической активности отмечен в печени крыс, получавших «диг-да-ши-тан», на 3 и 7 сутки эксперимента. В последующие сроки митотический индекс значительно снижался и к концу исследований (28 сутки) составлял 4,4 % изначального показателя в этой группе белых крыс.
Об активности регенераторных процессов в печени крыс, получавших «диг-да-ши-тан», мы судили по появлению крупных темноокрашенных клеток с гиперхромными ядрами и увеличению числа двуядерных гепатоцитов (табл. 2). Из результатов, приведенных в таблице 2, видно, что регенерация гепатоцитов в печени подопытных животных происходит как за счет увеличения числа двуядерных клеток, так и за счет гипертрофированных гепатоцитов. При введении «диг-да-ши-тан» регенераторные процессы в печени крыс протекали быстрее, чем в печени контрольных животных и при введении препарата сравнения аллохола, что подтверждало повышение числа
Таблица 1
Показатели митотической активности гепатоцитов крыс (%) при остром токсическом гепатите на фоне фармакотерапии «диг-да-ши-тан» (М ± т)
№ п/п Условия опыта Срок исследования, сутки
3 7 14 21 28
1 СС14 (контроль), п = 7 0,25 ± 0,04 0,2 ± 0,01 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,002 0,4 ± 0,001
2 СС14 + аллохол, п = 7 2,0 ± 0,02* 1,0 ± 0,03* 1,0 ± 0,02* 0,6 ± 0,002 0,4 ± 0,002
3 СС14 + «диг-да-ши-тан», п = 7 4,5 ± 0,01* 3,3 ± 0,04* 1,7 ± 0,04* 0,5 ± 0,02 0,2 ± 0,002*
Примечание: * - значения достоверны в сравнении с контролем при Р< 0,05; п - количество животных в группе.
Таблица 2
Показатели регенерации в печени белых крыс при остром гепатите (М ± т) при введении «диг-да-ши-тан»
Количество двуядерных клеток Число гипертрофированных клеток
№ Условие опыта Срок исследования, сутки
7 14 21 28 7 14 21 28
1 СС14 (контроль), п = 7 8,6 ± 0,82 20,3 ± 1,22* 19,0 ± 0,94 16,3 ± 1,22 8,6 ± 0,62* 19,3 ± 1,21 22,0 ± 2,11* 25,6 ± 0,75
2 СС14 + аллохол, п = 7 16,6 ± 1,31* 17,6 ± 1,11* 17,0 ± 1,12 24,0 ± 1,23* 35,6 ± 2,34* 34,3 ± 2,12* 45,3 ± 1,21* 56,5 ± 2,44*
3 СС14 + «диг-да-ши-тан», п = 7 34,0 ± 1,52* 42,0 ± 1,73* 38,0 ± 2,42* 29,3 ± 1,31* 54,3 ± 5,55* 48,3 ± 3,61* 65,0 ± 2,92* 74,0 ± 2,91*
Примечание: * - значения достоверны в сравнении с контролем при Р< 0,05; п - количество животных в группе.
двуядерных и гипертрофированных клеток во все сроки исследования.
На 14 сутки исследований в печени крыс, получавших изучаемое средство, сохранялись еще гемо-динамические нарушения, однако дистрофические изменения в гепатоцитах были выражены в меньшей степени, чем в печени контрольных животных в эти сроки. Явления мелкокапельной жировой инфильтрации в печени крыс, получавших «диг-да-ши-тан», сохранялись только непосредственно вокруг центральных вен. В более поздние сроки (21 сутки) дистрофические изменения в печени наблюдались в виде очажков. Имели место клеточные инфильтраты лимфоидно-гистиоцитарного типа, располагавшиеся, в основном, по ходу сосудов.
В этот период уже можно было видеть признаки репаративной регенерации. Об этом свидетельствовали часто встречающиеся по периферии долек фигуры митоза, гипертрофированные гепатоциты с крупными, богатыми хроматином ядрами, а также двуядерные клетки, в которых отмечено более высокий по сравнению с контролем уровень содержания РНК и ДНК. Уровень содержания гликогена варьировал в зависимости от сроков после введений «диг-да-ши-тан». Так, в первые сроки исследований (7 сутки) гликоген присутствовал по периферии долек в виде мелких гранул. В дальнейшем (14, 21 сутки) концентрация гликогена в гепатоцитах, как правило, возрастала, и к концу эксперимента он заполнял большую часть дольки.
Активность восстановительных ферментов (СДГ- и ЛДГ-азы) в печени животных в случаях введений диг-да-ши-тан на 7 сутки исследований была выше, чем таковая в контроле. Подобная картина сохранялась и на 14 сутки, а к концу 21 суток изучения активность вышеуказанных ферментов
в печени животных, принимавших исследуемое растительное средство, соответствовала норме.
О функциональном состоянии печени подопытных животных при токсическом повреждении ее и последующем введении тибетского растительного средства свидетельствовали нарушения пигментного и белкового обменов, а также изменения активности аминотрансфераз. Так, содержания общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови крыс с экспериментальным гепатитом на
7 сутки исследований составляли соответственно 1,4 ± 0,01; 0,8 ± 0,03 и 0,6 ± 0,02 мг/%, в то время как у интактных животных эти же показатели равнялись соответственно 0,4 ± 0,03; 0,2 ± 0,01 и 0,2 ± 0,01 мг/% (табл. 3). Различие во всех случаях было достоверным (Р < 0,05).
На 14 сутки исследований у животных, получавших изучаемое средство, отмечено снижение всех фракций билирубина до нормальных величин (Р < 0,05). На 21 сутки наблюдений у животных во всех группах количество фракций билирубина доходило до исходных величин.
Активность ферментов АСТ и АЛТ на 7 сутки наблюдений повышалась: соответственно до 2,36 ± 0,08 мкмоль и 2,61 ± 0,03 мкмоль, что было достоверно выше интактного контроля (Р < 0,01). Спустя 14 суток наблюдений отмечена тенденция к нормализации активности АСТ и АЛТ у крыс, получавших испытуемое средство. В данном случае активность АСТ и АЛТ составляла соответственно 0,68 ± 0,02 и 1,42 ± 0,04 мкмоль, а у контрольных крыс активность этих ферментов была равна соответственно 1,1 ± 0,05 и 1,95 ± 0,01 мкмоль (Р < 0,05). На 21 сутки наблюдений у животных на фоне введений «диг-да-ши-тан» активность трансаминаз нормализовалась, в то время как у контрольных
Таблица 3
Изменение биохимических показателей под влиянием тибетского препарата «диг-да-ши-тан» при
экспериментальном гепатите у крыс (М ± т)
Показатель 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки
Контроль, n = 7 «Диг-да-ши-тан», n = 7 Контроль, n = 7 «Диг-да-ши-тан», n = 7 Контроль, n = 7 «Диг-да-ши-тан», n = 7
АЛТ, мкмоль 3,20 ± 0,02 2,36 ± 0,08* 1,1 ± 0,03 0,68 ± 0,02* 1,20 ± 0,02 0,68 ± 0,02*
АСТ, мкмоль 2,90 ± 0,14 2,61 ± 0,03* 1,95 ± 0,14 1,42 ± 0,04* 1,25 ± 0,01 0,90 ± 0,04*
Общий билирубин, мг% 1,56 ± 0,02 0,86 ± 0,01* 1,40 ± 0,01 0,72 ± 0,02* 1,53 ± 0,04 0,61 ± 0,05*
Тимоловая проба, уел. ед. 5,50 ± 0,32 3,95 ± 0,05* 5,5 ± 0,22 3,5 ± 0,04* 4,1 ± 0,08 1,1 ± 0,02*
Примечание; * - различия достоверны в сравнении с контролем при Р< 0,05; п - количество животных в группе.
крыс активность указанных ферментов превышала в 4 раза нормальные величины этих показателей (табл. 3).
У подопытных животных, подвергнутых интоксикации СС14, нарушалась сулемовая проба. В частности, на 7 сутки наблюдений количество сулемы, ушедшее на титрование, снижалось до
0,6 мл при норме 1,4 мл. На 14 сутки исследований крыс, получавших «диг-да-ши-тан», уровень сулемовой пробы приближался к норме. У контрольных животных сулемовая проба оставалась резко положительной (0,8 мл). Спустя 21 сутки с начала опытов у крыс после введений изучаемого средства сулемовая проба нормализовалась, в то время как у контрольных животных она оставалась еще положительной (0,9 мл).
Тимоловая проба у крыс с экспериментальным острым гепатитом на 7 сутки наблюдений была равна 5,5 ед. при норме 3 ед. На 14 сутки исследований у подопытных животных во всех группах тимоловая проба оставалась резко положительной. На 21 сутки у крыс на фоне введений «диг-да-ши-тан» тимоловая проба приближалась к нормальным величинам (табл. 3).
На основании экспериментальных данных следует заключить, что с самого начала опытов можно было отметить разницу в морфологической картине и функциональных показателях печени контрольных крыс и животных, получавших испытуемое средство. В печени последних в меньшей степени, чем в контроле, были выражены дистрофические изменения и в большей степени проявлялись морфологические критерии регенерации, изменения воспалительно-пролиферативного характера, а также быстрее нормализовались гистохимические показатели, показатели белковоосадочных проб и пигментного обмена, активность аминотрансфераз.
При анализе полученных данных немаловажным являлась сравнительная оценка активности изучаемых ферментов и изменений белкового, нуклеинового, углеводного и жирового обменов в печени подопытных крыс. Как было указано ранее, уровни активности СДГ- и ЛДГ-азы, АСТ, а также уровни содержания ДНК, РНК и гликогена в печени животных, получавших испытуемое средство, были выше, чем в контроле. Кроме того, в случаях
введений животным его быстрее нормализовались сулемовая и тимоловая пробы, характеризующие состояние белкового обмена.
Активация окислительно-восстановительных процессов при воздействии «диг-да-ши-тан», по-видимому, являлась одним из основных механизмов, который приводил к нормализации нарушенных обменов веществ (белкового, углеводного, жирового, пигментного). Важным моментом в восстановительных процессах в печени на фоне введений животным испытуемого средства, вероятно, являлась нормализация синтеза белков и нуклеиновых кислот, от состояния которых зависит активность процессов репаративной регенерации в поврежденном органе.
Анализ источниковедческих сведений о различных вариантах прописей «горечавка — 4», применявшихся в тибетской медицине при заболевании печени, показывает, что назначались они в зависимости от наличия конкретных симптомов при поражениях печени с учетом индивидуальных свойств каждого компонента прописи.
Результаты экспериментального изучения испытуемого средства по прописи № 1 «горечавка — 4» на модели токсического гепатита подтверждают данные, полученные из источников тибетской медицины. В опытах на животных замечено, что лекарственное средство «диг-да-ши-тан» по прописи № 1 оказывает стимулирующее влияние на восстановительные процессы в печени при ее токсическом повреждении. Выявленный фар-макотерапевтический эффект можно объяснить комплексом гепатотропных биологически активных веществ, в первую очередь флавоноидов, полисахаридов и др., содержащихся в отдельных растениях изучаемого средства, ибо вещества из группы флавоноидов обладают широким спектром биологического действия [6, 8]. Важным в механизме действия «диг-да-ши-тан» следует считать ингибирование перекисного окисления липидов (ПОЛ) и отсюда — его мембраностабилизирующий эффект, обусловливающий гепатозащитное влияние при токсическом повреждении печени.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаммерман А.Ф. Словарь тибето-латино-русских названий лекарственного сырья, приме-
няемого в тибетской медицине / А.Ф. Гаммерман, Б.В. Семичов. — Улан-Удэ, 1963. — 180 с.
2. Даргаева Т.Д. Исследование яблони ягодной, произрастающей в Бурятии / Т.Д. Даргаева, Г.Г. Николаева, С.М. Николаев // Изучение препаратов природного и синтетического происхождения. — Томск, 1978. - С. 16-17.
3. «Дзейцхар-Мигчжан» — памятник тибетской медицины / С.М. Баторова [и др.]. — Новосибирск, 1985. — 88 с.
4. Ибрагимов Ф.И. Основные лекарственные растения китайской медицины / Ф.И. Ибрагимов,
B.С. Ибрагимова. — М., 1960. — 411 с.
5. Колб В.Г. Справочник по клинической хирургии / В.Г. Колб, В.С. Камышников. — Минск, 1982. — 226 с.
6. Колла В.Э. Перспективы поиска стимуляторов регенерации среди растительных препаратов, содержащих биофлавоноиды / В.Э. Колла, Г.Д. Билич // Фармакологическая регуляция регенераторных процессов в эксперименте и клинике: Межвузовский сборник ГГУ. — Горький, 1978. —
C. 3—10.
7. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А. Меркулов. — М., 1969. — 423 с.
8. Николаев С.М. Экспериментальная фармакотерапия антиоксидантами повреждений печени / С.М. Николаев // Фармакология и токсикология.
- 1983. - № 1. - С. 79-81.
9. Николаев С.М. О желчегонной активности Odontitesserotina (Lam) Dum. / С.М. Николаев, Р.Б. Гармаев // Раст. ресурсы. - 1982. - Т. 2, Вып. 1.
- С. 91-93.
10. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс. - М., 1962. - 962 с.
11. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии / Н.А. Плохинский. - М., 1980. - 281 с.
12. Убашеев И.О. Природные лекарственные средства при повреждениях органов и тканей / И.О. Убашеев. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 1998. - 224 с.
13. Убашеев И.О. Природные лекарственные средства при повреждениях органов и тканей: Автореф. дис. ... докт. биол. наук / И.О. Убашеев.
- Улан-Удэ, 1998. - 47 с.
14. Убашеев И.О. Экспериментальноморфологические исследования печени белых крыс, леченных препаратом из горечавки бородатой при остром токсическом гепатите / И.О. Убаше-ев, К.С. Лоншакова, Г.В. Болдаруева // Фармакол. и токсикол. - 1984. - № 3. - С. 123-124.
Сведения об авторах:
И.О. Убашеев. Бурятский государственный университет, г. Улан-Удэ, ул. Октябрьская 36, А тел. (3012) 44-82-55
