CC BY
56
УДК 616.24-006.6-071:577.21.08
1-2А.И. Дмитриева, 1-2В.А.Серебрякова, 2И.А.Кузнецова, 'С.С.Ракитин, 1Л.А.Кудяков, 2-3В.В.Новицкий,
'Л.В.Пикалова, 2К.И.Янкович, 1О.В.Печенова, 1-2К.В.Рачковский, 1С.В. Комарова
ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ
ГЕНОВ BAX G248A И BCL-2 C938A У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО
С РАЗНЫМИ КЛИНИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА
1 "Томский областной онкологический диспансер"(КДЛ ОГА УЗ "ТООД")
2ГБОУ ВПО СибГМУМЗ РФ
3НИ ТГУ
Адрес для переписки: Дмитриева Алла Ивановна
634050, г. Томск, проспект Ленина 115, КДЛ ОГАУЗ "ТООД", тел. (раб.): 8(3822) 909-500, 909-508, факс
8(3822) 515-208, тел. (сот.): +79095451577
E-mail: alladmitrieva@mail. ru, nauka-tomonco@mail. ru
Реферат
Изучено распределение полиморфных вариантов генов Bax G248A и Bcl-2 C938A при раке легкого в зависимости от гистологического типа опухоли (мелкоклеточный/ немелкоклеточный рак легкого) и распространенности опухолевого процесса (с очагами/без очагов метастазирования). Образцы ДНК, выделенной из опухолевой ткани легкого 93 больных раком легкого стандартными методами, были протипированы по полиморфизмам G248A и C938A генов Bax и Bcl-2 путем ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием соответствующих пар олигонуклеотидных праймеров и зондов. Аллель G, генотип GG полиморфного участка G248A гена Bax, аллель А, генотипы АА и СА полиморфного варианта C938A гена Bcl-2 статистически ассоциированы с развитием рака легкого. Гомозиготный генотип GG и аллель G полиморфного участка G248A гена Bax положительно ассоциированы с метастазированием и развитием опухоли немелкоклеточного типа.
Гомозиготный генотип АА полиморфного участка C938A гена Bcl-2 предрасполагает, а генотип АА полиморфизма G248A гена Bax, напротив, обладает протективным эффектом в отношении развития немелкокле-точного рака легкого.
Ключевые слова: Bax G248A, Bcl-2 C938A, полиморфизм, гены-регуляторы, рак легкого.
12 12 2 1 1 2 3
' Dmitrieva A.I., ' Serebryakova V.A., Kuznetsova I.A., Rakitin S.S., Kudyakov L.A., - Novitsky V.V., 1Pikalova L. V., 2Yankovich K.I., 1Pechenova O. V., 1-2Rachkovsky K. V., 1Komarova S. V. DISTRIBUTIONPECULARITIES OF POLYMORPHIC VARIANTS
OF BAXG248AAND BCL-2 C938A GENESAMONG PATIENS WITH LUNG CANCER AND DIFERENT CLINICAL FEATURES OF THE TUMOR PROCESS
1Tomsk Regional Oncological Dispensary (CDLOSAHI TROD) 2MF RF SBEIOFHPE SibSMU
2ni tgu
Abstact
Distribution of polymorphic variants of BaxG248A and Bcl-2 C938 Agenes among patients with lung cancer depending on histological type of the tumor (non small/small cell lung carcinoma) and its dissemination (with/without metastases) were studied. DNA samples extracted from 93 patients' lung tumor tissue using standard methods were typed for G248AandC938A polymorphisms of genesBaxand Bcl-2 using the real-timecularitye PCRwith fluorescent hybridization detection with application of corresponding pairs of oligonucleotide primers and probes. The G allele, GG genotype of the G248A polymorphic area of the Baxgene, the A allele, AA and CA genotypes of the C938A polymorphic variant of the Bcl-2gene were statistically associated with lung cancer development. Homozygous GG genotype and the G allele of the G248A polymorphic area of the Bax gene were positively associated with the metastatic disease and non small cell cancer development. HomozygousAAgenotypeof the C938A polymorphic area of the Bcl-2 gene predisposes to the non small cell cancer development as opposed to the AA genotype of the G248Apolymorphismof the Bax gene which is protective.
Key words: BaxG248A, Bcl-2 C938A, polymorphism, gene-regulator, lung cancer.
Введение
Высокие показатели заболеваемости раком легкого, сложность ранней диагностики, низкая
эффективность терапии и значительные показатели летальности указывают на необходимость активных комплексных исследований по различным направлениям онкологии, в частности - по изучению
молекулярно-генетических механизмов развития этого заболевания.
Наличие множества вариантов генов и, как следствие, белковых продуктов с различной кон-формацией и ферментативной активностью, формирует индивидуальную восприимчивость организма к действию канцерогенных факторов [1-3]. В качестве факторов генетической предрасположенности к онкозаболеваниям интенсивно исследуются полиморфизмы генов Bcl-2 и Bax. Особый интерес к полиморфизмам С938А гена Bcl-2 и G248A гена Bax обусловлен их близким расположением (на расстоянии 100 пар оснований) от участка ДНК, с которым связывается белок р53 (p53-response element), играющий центральную роль в поддержании стабильности генома и предотвращении удвоения поврежденной ДНК [4; 5].
Ген Bcl-2 картирован на хромосоме 18q21.3 и состоит из 3 экзонов и 2 промоторов [6- 8]. Известно несколько однонуклеотидных полиморфизмов гена Bcl-2: G43A во 2 экзоне, A21G в 1 экзоне, С938А во 2 промоторе [8-11]. Полиморфизмы Bcl-2, изменяющие функцию белка и/или экспрессию гена, могут оказывать воздействие на неустойчивое равновесие механизмов, которые регулируют апоп-тоз [8; 12]. Известно, что аллель А полиморфизма С938А гена Bcl-2 связан с увеличением экспрессии Bcl-2 [11; 13], а генотип АА коррелирует с увеличенным риском развития и неблагоприятным течением рака различных локализаций - молочной железы, пищевода, простаты [8; 9; 14]. Однако данные об ассоциации между риском развития рака легкого и полиморфизмом С938А гена Bcl-2 в литературе не встречаются.
Ген Bax расположен на хромосоме 19q13.3 [4; 15]. Белковый продукт этого гена, являющийся членом семейства Bcl-2, способен формировать bax-bax димеры, усиливающие действие активаторов апоптоза. В работах зарубежных авторов показано, что полиморфизм G248A гена Bax, локализованный в промоторном регионе, приводит к снижению экспрессии этого гена [4]. Исследованиями D.K. Yu (2010) et al. установлена ассоциация А-аллеля полиморфизма G248A гена Bax с уменьшением риска развития рака легкого в китайской популяции. Тем не менее, полученные учеными данные нельзя экстраполировать на индивидуумов европеоидного происхождения.
Отсутствие данных о роли полиморфизмов G248A гена Bax и C938A гена Bcl-2 в развитии рака легкого определяет актуальность изучения полиморфных вариантов указанных генов при данном заболевании.
Особый интерес представляет изучение взаимосвязи полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла с риском развития и особенностями клинико-морфологического проявления рака легкого, что позволит оценить индивидуальную предрасположенность к заболеванию с целью своевременной профилактики, выбора тактики терапии и прогнозирования отдаленных результатов лечения.
Цель исследования: изучить распределение полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла Bax G248A и Bcl-2 C938A при раке легкого в зависимости от гистологического типа опухоли и распространенности опухолевого процесса.
Материалы и методы
Работа проведена на образцах операционного материала (гистологически верифицированные участки опухолевой ткани) 93 пациентов (84 мужчины и 9 женщин, средний возраст 56,3±9,6 года) с диагнозом "рак легкого". Группу сравнения составили 230 здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, без онкологической патологии, хронических воспалительных процессов, аутоиммунных, наследственных и психических заболеваний. Учитывая генетическую гетерогенность по Bax и Bcl-2 в различных популяциях, в исследование были включены индивидуумы только европеоидного происхождения. Исследование проводили в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ от 24.12.93 г. № 2288) под контролем этического комитета ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.
Для оценки распределения полиморфных вариантов исследуемых генов в зависимости от распространенности опухолевого процесса все больные раком легкого были разделены на две группы в зависимости от наличия или отсутствия очагов ме-тастазирования в соответствии с классификацией злокачественных новообразований по системе TNM (2007). Первую группу (n=33) составили пациенты без очагов метастазирования (Ti-4N0Mo), вторую группу (n=60) - пациенты с метастатическими поражениями регионарных лимфатических узлов (Tj-4N0-2M0-i). Группу больных раком легкого без метастазов составили пациенты со II (21,3%) и III (57,8%) стадиями злокачественного процесса. Пациенты с метастазами имели в основном III (51,6%) и IV (37,9%) стадии заболевания.
В соответствии с результатами гистологического исследования операционного материала (выполненного в патологоанатомическом отделении ОГАУЗ "ТООД") больные были разделены на две группы: с мелкоклеточным (n=22) и немелкокле-точным (n=71) раком легкого. Группу пациентов с немелкоклеточным раком легкого составили больные с плоскоклеточным раком легкого разной степени дифференцировки, железистым раком легкого и аденокарциномами.
Выделение геномной ДНК из операционного материала проводили с использованием коммерческого набора "FF-PET DNA kit" (Qiagen, Германия) после предварительной депарафинизации образцов.
Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови выполняли с использованием стандартного метода осаждения ДНК на сорбенте (набор "ДНК-сорб-АМ", ФГУН "ЦНИИЭ" Роспотребнадзора, г. Москва). Лейкоциты получали в результате гомо-
генизации сгустка крови и многократной промывки автоклавированной дистиллированной водой в стерильных условиях.
Образцы ДНК больных раком легкого и здоровых доноров были протипированы по полиморфизмам G248A и C938A генов Bax и Bcl-2 соответственно. Типирование проводили путем ПЦР с гиб-ридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием соответствующих пар олигонуклеотидных праймеров и зондов [16; 17].
Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий х2 Пирсона (при значении абсолютных частот больше 10) и критерий Фишера (при значении абсолютных частот меньше 5).
Для оценки ассоциации между определенным генотипами и риском развития заболевания производили подсчет отношения шансов (OR, указан с 95%-ным доверительным интервалом, CI).
Результаты и обсуждение
Распределение полиморфных вариантов генов Bax G248A и Bcl-2 C938A у больных раком легкого Проведенное исследование показало, что у больных раком легкого гомозиготный вариант GG полиморфного участка G248A гена Вах встречается в 72,04 % случаев, что достоверно выше, чем у здоровых (43,91%) лиц. Риск развития рака легкого при носительстве указанного генотипа возрастает в 3,3 раза (CW. 1,95-5,55).
Частота встречаемости аллеля G у больных раком легкого составила 83,33 %, что превышало соответствующий показатель у здоровых (65,00%)индивидуумов. При этом риск развития рака легкого у здоровых доноров с аллелотипом G увеличивается в 2,7 раза (CI95%1,75-4,14) .
Анализ полиморфного участка C938A гена Bcl-2 позволил установить статистически значимое увеличение частоты встречаемости АА- и АС-генотипов в группе больных раком легкого (37,63 и 46,24 %) относительно соответствующих показателей в группе контроля (24,35 и 44,35%). Обращала на себя внимание положительная ассоциация указанных генотипов с риском развития рака легкого: для гомозиготного варианта АА риск увеличивался в 1,88 (CI95% 1,12-3,14), а для генотипа СА - в 1,08 (CI95% 0,67-1,75) раза.
Частота встречаемости аллеля А у больных раком легкого составила 60,75%, что достоверно превышало аналогичные значения у здоро-вых(46,52%) лиц. Риск развития рака легкого для носителей А-аллеля составил 1,78 (CI95% 1,26-2,52).
Распределение полиморфных вариантов генов Bax G248A и Bcl-2 C938A у больных раком легкого в зависимости от распространенности опухолевого процесса
Известно, что метастазирование злокачественных опухолей является важнейшим параметром
злокачественности опухолевого процесса, определяющим течение и прогноз заболевания.
В связи с этим особый интерес, на наш взгляд, представляет определение частоты гомозиготных носителей аллеля G полиморфного варианта G248A гена Вах, а также генотипов и аллелей полиморфного участка C938A гена Bcl-2 среди больных раком легкого с регионарными метастазами.
Проведенное исследование показало, что у больных раком легкого с метастазами частота гомозигот по аллелю G полиморфного участка G248A гена Вах достоверно превышала соответствующие показатели у пациентов без метастазов (85,00 и 48,48%, соответственно.
Сравнение частот вариантных аллелей G и А полиморфизма G248A гена Bax в группах больных с метастазами и без таковых констатировало увеличение риска развития рака легкого с метастазами для здоровых носителей аллеля G в среднем в 5 раз (CI95% 2,24-11,76), при носительстве генотипа GG -в 6 раз (CW. 2,25-16,11).
Анализ распределения генотипов и частоты аллелей полиморфного участка C938A гена Bcl-2 у больных раком легкого с метастазами и без таковых не позволил установить статистически значимых отличий между исследуемыми показателями.
Распределение полиморфных вариантов генов Bax G248A и Bcl-2 C938A у больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли Сравнительное генотипирование больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли показало, что частота встречаемости гомозиготного генотипа GG полиморфного участка G248A гена Bax у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (76,06%) достоверно превышала таковую у здоровых лиц (43,91%).
Обращало на себя внимание трехкратное увеличение количества гомозигот по минорному аллелю А у здоровых доноров по сравнению с аналогичными показателями у пациентов с опухолями немелкоклеточного типа (13,91 и 5,63 %, соответственно), что свидетельствует о протективном эффекте аллеля А полиморфного варианта G248A гена Bax в отношении развития рака легкого.
В группе больных немелкоклеточным раком легкого частота G-аллеля полиморфного участка G248A гена Bax достоверно превышала таковую в группе контроля (85,21 и 65,00% соответственно. При сравнении частоты распределения полиморфного варианта G248A гена Вах у больных мелкоклеточным раком легкого и у здоровых доноров, а также у больных раком легкого с разными гистологическими типами опухоли значимых отличий установлено не было.
Анализ полиморфного участка C938A гена Bcl-2 позволил установить, что у больных немел-коклеточным раком легкого гомозиготный вариант АА указанного полиморфизма встречается в 40,85 % случаев, что достоверно выше, чем у здоровых доноров (24,35%).
Обращало на себя внимание двукратное (С195% 1,22-3,76) увеличение риска развития рака легкого с немелкоклеточным гистотипом у здоровых лиц с АА-генотипом полиморфного участка С938А гена Вс1-2.
Частота встречаемости аллеля А в группе больных раком легкого с немелкоклеточным типом была выше, чем в группе контроля. Риск развития онкологического заболевания легких с данным гистологическим типом у здоровых носителей А-аллеля возрастал в 1,8 раза (С195% 1,24-2,67).
Сравнение исследуемых генотипов и аллело-типов полиморфного участка С938А гена Вс1-2 у пациентов с мелкоклеточным типом рака легкого и здоровых доноров не позволило установить статистически значимых отличий.
Литература
Выводы
Аллель G, генотип GG полиморфного участка G248A гена Бах, а также аллель А, генотипы АА и СА полиморфного варианта С938А гена Бс1-2 статистически ассоциированы с развитием рака легкого.
С метастазированием и развитием опухоли легкого немелкоклеточного типа положительно ассоциированы гомозиготный генотип GG и аллель G полиморфного участка G248A гена Бах.
Гомозиготный генотип АА полиморфного участка С938А гена Бс1-2 предрасполагает, а генотип АА полиморфизма G248A гена Бах, напротив, обладает протективным эффектом в отношении развития немелкоклеточного рака легкого.
1. Забежинский М. А. Принципы первичной профилактики рака // Практическая онкология. - 2011. - Т. 12, № 2. - С. 57-61.
2. Значение конституционных полиморфизмов гена р53 у больных неходжкинскими злокачественными лим-
i омами / Поспелова Т.И., Воевода М. И., Воропаева Е. Н., Белявская В. А., Ковынев И. Б., Березина О. В. // юллетень сибирской медицины. - 2008. - Т. 7, № 3. - С. 56-62.
3. Копнин Б. П. Современные представления о механизмах злокачественного роста // Х Российский онкологический конгресс: материалы конгресса. - Москва, 2006. - С. 102-105.
4. Functional Bax polymorphism associated with lung cancer susceptibility / Yu D. K., Guo Y. L., Tan W., Lin D. X. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 2010. - Vol. 32, № 5. - P. 324-327.
5. The G(-248)A polymorphism in the promoter region of the Bax gene does not correlate with prognostic markers or overall survival in chronic lymphocytic leukemia / Skogsberg S., Tobin G., Kröber A., Kienle D., Thunberg U., Aleskog A., Karlsson K., Laurell A., Merup M., Vilpo J., Sundström C., Roos G., Jernberg-Wiklund H., Döhner H., Nilsson K., Stilgenbauer S., Rosenquist R. // Leukemia. - 2006. - Vol. 20. - P. 77-81.
6. Прогностическое значение экспрессии ингибитора апоптоза BCL-2 при почечно-клеточном раке / Чердын-цева Т. М., Бобров И. П., Климачев В. В., Брюханов В. М., Лазарев А. Ф., Гервальд В. Я., Обухова Л. Е., Барсукова Н. И. // Фундаментальные исследования. - 2012. - №8-1. - С. 169-173.
7. A polymorphism (rs1801018, Thr7Thr) of Bcl2 is Associated with Papillary Thyroid Cancer in Korean Population / Eun Y. G., Hong I. K., Kim S. K., Park H-K., Kwon S., Chung D. H., Kwon K. H. // Clin. Exp. Otorhinolaryngol. -2011. - Vol. 4, № 3. - P. 149-154.
8. Regulatory BCL2 promoter polymorphism (-938C>A) is associated with adverse outcome in patients with prostate carcinoma / Bachmann H. S., Heukamp L. C., Schmitz K. J., Hilburn C. F., Kahl P., Buettner R., Nückel H., Eisenhardt A., Rübben H., Schmid K. W., Siffert W., Eggert A., Schramm A., Schulte J. H. // Int. J. Cancer. - 2011. -Vol. 129, № 10. - P. 2390-2399.
Bcl-2 (-938C>A) polymorphism is associated with breast cancer susceptibility / Zhang N., Li X., Tao K., Jiang L., Ma T., Yan S., Yuan C., Moran M. S., Liang F., Haffty B. G., Yang Q. // BMC. Med. Genet. - 2011. - Vol. 12. -P. 48-51.
Bcl2 genetic variants are associated with acute kidney injury in septic shock / Frank A. J., Sheu C-C., Zhao Y., Chen F., Su L., Gong M. N., Bajwa E., Thompson B. T., Christiani D. C. // Crit. Care. Med. - 2012. - Vol. 40, № 7. - P. 2116-2123.
The Bcl-2 promoter (-938C>A) polymorphism does not predict clinical outcome in chronic lymphocytic leukemia / Kaderi M. A., Norberg M., Murray F. Merup M., Sundström C., Roos G., Aleskog A., Karlsson K., Axelsson T., Tobin G., Rosenquist R. // Leukemia. - 2008. - Vol. 22, № 2. - P. 339-343.
Association of the CC genotype of the regulatory BCL2 promoter polymorphism (-938C>A) with better 2-year survival in patients with glioblastoma multiforme / Hindy N. E., Bachm H. S., Lambe N., Adamzik M., Nückel H., Worm K., Zhu Y., Sure U., Siffert W, Sandalcioglu I. E. // J. Neurosurg. - 2011. - Vol. 114, № 6. - P. 1631-1639. Prognostic assessment of single-nucleotide polymorphisms (GNB3 825C>T, BCL2 -938C>A, MCL1 -386C>G) in extrahepatic cholangiocarcinoma / Fingas C. D., Katsounas A., Kahraman A., Siffert W., Jochum C., Gerken G., Nückel H., Canbay A. // Cancer. Invest. - 2010. - Vol. 28, № 5. - P. 472-478.
Low expression of Bax predicts poor prognosis in patients with locally advanced esophageal cancer treated with definitive chemoradiotherapy / Kang S. Y., Han J. H., Lee K. J., Choi J. H., Park J. I., Kim H. I., Lee H. W., Jang J. H., Park J. S., Kim H. C., Kang S., Oh Y. T., Chun M., Kim J. H., Sheen S. S., Lim H. Y. // Clin. Cancer. Res. -2007. - Vol. 13, № 14. - P. 4146-4153.
15. Bax gene G(-248)A promoter polymorphism and chronic lymphocytic leukemia: lack of association with incidence, disease stage and progression-free survival / Nückel H., Frey U. H., Sellmann L., Bau M.; Dürig J., Dührsen U., Siffert W. // Leukemia. - 2006. - Vol. 20. - P. 724-726.
Полиморфизм генов-регуляторов клеточного цикла р53 и р21™ cip1 при раке легкого / Кузнецова И. А., Дмитриева А. И., Ракитин С. С., Новицкий В. В. // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - № 3. - С. 4750.
Polymorphism of cell cycle regulating genes Bcl-2 (-938CDA), Bax (-248GDA) and p27 (-326TDG) and the risk of lung cancer / Kuznetsova I. A., Yankovich K. I., Rakitin S. S., Dmitrieva A. I. // International Journal of Bio-medicine. - 2012. - № 2, (3). - р. 197-200.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
16.
17.
1
