Особенности проведения программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациентов с ВИЧ-инфекцией

Корчагин А.О.

во второй группе — 50,4 %, в третьей — 4,9 %. Регулярно занимаются спортом в первой группе 6,8 %, во второй — 33,1 %, в третьей — 65,1 % (p < 0,05). Важность подготовки к беременности в первой группе оценивают в 10 баллов 38,2 %, во второй группе — 41,1 %, в третьей — 14 %. В 5 баллов — 17 % в первой группе, 6,8 % — во второй, 23,3 % — в третьей группе (p < 0,05).

В первой группе 78,7 % респондентов считают, что обследование у гинеколога, отказ от вредных привычек и прием витаминов входят в подготовку к беременности у женщин, во второй группе — 69 %, в третьей группе — 37,1 % (p < 0,05). Считают, что подготовка вообще не требуется в первой группе — 21,3 %, во второй группе — 31 %, в третьей группе — 62,9 %. В первой группе 27,3 % респондентов считают, что обследование урологом, отказ от вредных привычек и прием витаминов входят в прегравидарную подготовку у мужчин, во второй группе — 49 %, в третьей группе — 14,6 %. Остальные участники анкетирования считают, что подготовка не требуется (p< 0,05). Посещают врача акушера-гинеколога

1 раз в год в первой группе 51,3 % девушек, во второй группе — 16,5 %, в третьей группе — 9,4 %. По мере необходимости обращаются к гинекологу в первой группе — 41,9 %, во второй группе — 80,5 %, в третьей группе — 85,7 % (p > 0,05). Хотели бы получить дополнительную информацию о подготовки к беременности 75 % в первой группе, во второй группе — 84,6 %, в третьей — 71,7 % (p > 0,05).

Выводы

Среди студентов разных факультетов чаще всего задумываются о планировании беременности в ближайшее время девушки и юноши педиатрического факультета — 48,6 %. Необходимость прегравидарной подготовки положительно оценивают в среднем около 40 % молодежи. Большинство студентов медико-профилактического и стоматологического факультетов полагают, что готовиться к наступлению беременности не нужно. Студенты всех факультетов УГМУ желают получить дополнительную информацию о прегравидарной подготовке.

ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОГРАММ

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ВИЧ-ИНФЕкцИЕй © А.О. корчагин, врач

Самарский государственный медицинский университет, ЗАО «Медицинская компания ИДК», г. Самара, Россия

актуальность проблемы

По информации ГБУЗ «Самарский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями» в Самарской области на 01.10.2015 зарегистрировано 41 414 человек, живущих с ВИЧ, что составляет 1289,1 на 100 тыс. населения. Это в 2,6 раза выше среднего показателя в Российской Федерации. Значительная часть (71 %) выявленных в 2015 г. ВИЧ-позитивных пациентов в Самарской области находится в репродуктивном возрасте (21- 40 лет). Растет обращаемость в центры проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с целью снижения риска инфицирования партнера в дискордантных парах (где инфицирован один партнер) и получения здорового (без ВИЧ) потомства. В связи с высокой заболеваемостью населения ВИЧ-инфекцией возникает необходимость в создании условий для реализации качественных программ ЭКО как оптимального способа безопасного зачатия.

Цель исследования: повышение эффективности и безопасности методик оплодотворения в циклах ЭКО у пациентов с ВИЧ инфекцией.

материалы и методы исследования

Были обследованы 38 дискордантных пар, в которых ВИЧ-инфицирован только мужчина, с целью реализации репродуктивной функции с собственными гаметами. Из 38 мужчин с ВИЧ-инфекцией субклиническая (3-я стадия) диагностирована в 6 случаях, что составляет 16 %, стадия вторичных заболеваний (4А, 4Б, 4В), фаза ремиссии — в 15 случаях, что составляет 39 %, фаза прогрессирования — в 1 случае, что составляет 2 %. Среди обследованных 16 мужчин (42 %) при обращении за репродуктивной помощью не имели заключения инфекциониста и направлены в СПИД-центр для уточнения диагноза и определения сроков проведения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Мужчинам с ВИЧ-инфекцией в субклинической стадии и стадии вторичных заболеваний, фазы ремиссии были проведены обследование перед ВРТ и подготовка к отмывке спермы согласно рекомендациям 107н приказа МЗ РФ от 2012 г. Мужчины с ВИЧ-инфекцией в стадии вторичных заболеваний, фазы прогрессирования были направлены к инфекционисту для проведения лечения.

Результаты исследования

В 6 случаях уровень РНК ВИЧ в крови не определялся. У 16 мужчин РНК ВИЧ в крови определялся. Однако им не была показана антиретрови-русная терапия (АРВТ), решение о проведении ВРТ принималось консилиумом врачей. В 22 случаях мужчины были направлены на обследование в СПИД-центр. За весь период проведено 22 процедуры отмывки сперматозоидов с определением вирусной нагрузки. В 21 случае получен результат «ниже предела обнаружения», что означает менее 20 МЕ/мл (11,6 копий/мл) РНК ВИЧ. Сразу после получения результата биоматериал был заморожен. В 1 случае анализ показал результат «более 150 копий/мл», что означает положительный, образец спермы утилизировали.

С размороженными отмытыми сперматозоидами всего проведено 27 циклов ВРТ. Перенос эмбрионов в «свежем» протоколе с оплодотворением методом ИКСИ был проведен 17 пациентам, 10 — в криопротоколе (перенос размороженного эмбриона). В 5 случаях программа ВРТ не завер-

шена переносом эмбрионов в связи с отсутствием оплодотворения единственного ооцита и остановкой развития эмбрионов. Четыре женщины из 5 имели низкий овариальный резерв (АМГ менее 0,6 пмоль/л). Получено 7 одноплодных беременностей. Первая пара уже стала счастливыми родителями. У 8 пар хранятся замороженные эмбрионы.

Выводы

Оказание эффективной и безопасной репродуктивной помощи пациентам с ВИЧ-инфекцией с соблюдением всех требований регламентирующих документов возможно при условии четкого взаимодействия персонала центра ВРТ и центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями.

Отмывка эякулята с определением вирусной нагрузки для проведения ВРТ является необходимой и эффективной мерой безопасности при оказании репродуктивной помощи дискордант-ным парам, в которых ВИЧ-инфицирован только мужчина.

исходы ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ у ЖЕНЩИН

с уровнем антимюллерова гормона ниже 1 нг/мл

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, педиатрический факультет, кафедра акушерства и гинекологии, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Овариальный резерв — способность яичников отвечать на овариальную стимуляцию ростом полноценных фолликулов. Сохраненный овариальный резерв является основным показателем, обеспечивающим эффективность лечения бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения, в том числе с использованием интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ЭКО/ИКСИ). На сегодняшний день определение овариального резерва путем измерения АМГ (антимюллеров гормон) в сыворотке крови женщины является наиболее клинически значимым. Нормальный уровень АМГ в настоящее время колеблется от 1,0 до 10,5 нг/ мл. Проведение процедуры ЭКО у женщины с АМГ ниже 1 нг/мл часто сопровождается плохим ответом на овариальную стимуляцию, а следовательно, низкой частотой наступления беременности.

Цель исследования: изучение клинических характеристик и исходов ЭКО у женщин с уровнем АМГ ниже 1 нг/мл и сравнение с пациентками, у которых уровень АМГ был выше 1,0 нг/мл.

Материалы и методы исследования

В исследование вошло 114 женщин, планирующих лечение бесплодия с помощью процедуры

ЭКО/ИКСИ. Все исследуемые были разделены на две группы. В первую (основную) группу вошло 57 пациенток, у которых уровень АМГ был ниже 1 нг/мл. Во вторую (контрольную) группу — 57 пациенток с уровнем АМГ выше 1 нг/мл. В качестве овариальной стимуляции в первой группе применялись протоколы с агонистами у 49,6 %, с антагонистами — у 15,2 %, ЭКО в естественном цикле — 35,2 % пациенток. Во второй группе использовались протоколы с агонистами у 53,5 % пациенток, с антагонистами — у 46,5 %.

Результаты исследования

В ходе исследования были получены следующие данные: средний возраст пациенток в первой группе составил 39,0 ± 4,5 года, во второй группе — 35,3 ± 4,7 (p< 0,001). Частота наступления клинической беременности в основной группе — 28,3 %, в группе контроля — 58,3 % (p=0,002). Отсутствие ответа на овариальную стимуляцию в первой группе составило 10,5 %, а во второй — 0 % (p = 0,03).

Выяснилось, что пациентки в первой группе были старше и частота наступления беременности в 2 раза ниже, чем во второй группе, различия статистически значимые.

У большинства женщин обеих групп в анамнезе имелись сопутствующие гинекологические патологии. Первая группа: резекции яичников по поводу синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) и эндометриоидных кист яичников — 26 %, тубэк-томия — 21 %, наружный генитальный эндоме-триоз — 18 %, миома матки — 15 %, полип эндометрия — 14 %, мужской фактор — 6 %.

Вторая группа: наружный генитальный эндо-метриоз — 27 %, СПКЯ — 20 %, трубный фактор — 21 %, резекция кисты яичника — 18 %, эктопия шейки матки — 11 %, мужской фактор — 3 %.

Таким образом, самый низкий уровень АМГ, при котором удалось добиться наступления беременности, составил 0,1 нг/мл, максимальный возраст беременной с уровнем АМГ ниже 1,0 нг/мл — 44 года.

Выводы

Несмотря на то что пациентки со сниженным овариальным резервом являются серьезной проблемой в клинике лечения бесплодия, у них возможно получить удовлетворительную частоту наступления клинической беременности.

возможность применения стволовых клеток костномозгового происхождения С целью лечения синдрома ашермана в эксперименте

1 Санкт-Петербургский государственный университет, медицинский факультет, г. Санкт-Петербург, Россия;

2 Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

В настоящее время проводятся обширные исследования по разработке технологий использования стволовых клеток для лечения различных заболеваний и поиску новых источников этих клеток. Наиболее доступными и легко культивируемыми in vitro являются мезенхимные стволовые клетки. На сегодняшний день такие клетки были выделены кроме костного мозга из жировой ткани, пуповинной крови, амниотической жидкости и ткани эндометрия. Мезенхимные стволовые клетки могут дифференцироваться в хрящевую, мышечную, сухожильную и жировую ткани, а также в клетки эктодермального происхождения. Также мезенхимные стволовые клетки обладают ценными терапевтическими свойствами, такими как высокая миграционная способность, секреция биологически активных молекул, иммуномодули-рующее действие.

В репродуктивной медицине одним из основных направлений использования стволовых клеток является получение эндометрия, способного обеспечивать наступление и поддержание беременности, что особенно актуально в случае недостаточного его развития при таких патологиях, как синдром Ашермана и дистрофия эндометрия. Синдром Ашермана — состояние, характеризующееся формированием внутриматочных адгезий в результате различных вмешательств, таких как кюретаж полости матки, миомэктомия, гисте-рорезектоскопия, лапароскопическая метропла-стика или кесарево сечение. Наиболее частой причиной формирования сращений является кю-ретаж, проводимый во время беременности и послеродового периода в связи с неполным абортом, остатками плодных оболочек в полости матки

и послеродовыми кровотечениями. Данная патология может проявляться разнообразными клиническими симптомами, наиболее частыми из которых являются: нарушения менструального цикла (по типу а- или гипоменореи или дисменореи в зависимости от локализации и выраженности сращений), хронические тазовые боли, бесплодие и невынашивание беременности. Ведущим патогенетическим звеном синдрома Ашермана является формирование аваскулярной фиброид-ной соединительной ткани, сопровождающееся истончением или отсутствием железистого слоя. Гистероскопическое удаление сращений считается главным способом лечения данной патологии, целью которого является восстановление структуры полости матки. Однако часто такая тактика не приводит к стойкому эффекту, что проявляется повторным образованием внутриматочных адге-зий. Для формирования структурно и функционально здорового эндометрия на данный момент считается перспективным использование стволовых клеток.

Цель работы: разработка способа коррекции внутриматочной адгезии с использованием стволовых клеток костномозгового происхождения в экспериментальной модели.

материалы и методы исследования

Работа выполнена на крысах-самках линии Вистар массой 200-250 г из вивария НИИ цитологии РАН с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества. Были выделены три группы: 1-я группа — 13 крыс, которым производилось повреждение эндометрия путем введения 0,3 мл 96 %-го этанола с экспозицией 3 минуты; 2-я группа — 13 крыс,

которым проводилось повреждение эндометрия тем же способом, а затем через 24 и 72 часа внутривенно вводились костномозговые стволовые клетки, полученные из бедренной кости крыс с аналогичными массо-ростовыми показателями; контрольная группа — 26 крыс, у которых не производилось оперативное вмешательство. Через 3 эстральных цикла после оперативного вмешательства самок спаривали с одновозраст-ными самцами и наблюдали за течением беременности, оценивали количество и состояние плодов на 18-й день гестации.

Результаты исследования

В контрольной группе беременность наступила у 90 % животных, среднее количество плодов было 10,1 ± 0,6; масса плодов на 18-й день гестации составила 0,65 ± 0,17 г. В 1-й группе эти показатели

составили соответственно: 30 %; 4,5 ± 1,2 детеныша массой 0,45 ± 0,14 г; во 2-й группе — 42 %; 6,3 ± 0,9 детеныша массой 0,45 ± 0,23 г соответственно (p > 0,05). Таким образом, в группе животных, получавших терапию с использованием костномозговых стволовых клеток, наблюдалось увеличение как фертильности в целом, так и количества плодов в каждом отдельном случае.

Выводы

Стволовые клетки обладают ценными терапевтическими свойствами, в связи с чем применяются в различных областях медицины. В репродуктивной медицине необходимо проводить дальнейшую разработку способов коррекции различных нарушений, в том числе связанных с повреждением эндометрия, с использованием стволовых клеток.

ПРИМЕНЕНИЕ СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА В ЛЕЧЕНИИ БЕСПЛОДИЯ

у женщин со «слабым» ответом яичников на Стимуляцию гонадотропинами в программах экстракорпорального оплодотворения

Санкт-Петербургский государственный университет, медицинский факультет, кафедра акушерства, гинекологии и репродуктологии, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

До настоящего времени «слабый» ответ яичников на стимуляцию препаратами гонадотропных гормонов в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остается нерешенной проблемой. Это зачастую приводит пары с бесплодием к отказу от дальнейшего лечения или определяет их выбор в пользу применения донорских ооцитов. Основная часть пациентов, демонстрирующих «слабый» ответ на стимуляцию овуляции в циклах ЭКО, — это пациенты со сниженным овариаль-ным резервом. Еще одним фактором, снижающим эффективность лечения этой категории больных, является старший репродуктивный возраст. В литературе есть данные о том, что при «слабом» ответе яичников на стимуляцию овуляции использование соматотропного гормона способно увеличить успех программы ЭКО. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этому вопросу, в клинической практике нет единого мнения об использовании соматотропного гормона в программах вспомогательных репродуктивных технологий.

Цель исследования: изучить эффективность применения соматотропного гормона в лечении бесплодия у женщин со «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО.

Материалы и методы исследования

Были проанализированы результаты 58 циклов ЭКО или ЭКО/ИКСИ у женщин со «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами. Прогностический анализ «слабого» ответа яичников на стимуляцию гонадотропинами производился на основании болонских критериев при соблюдении двух из нижеперечисленных условий:

1) наличие в анамнезе у пациентки одного цикла стимуляции суперовуляции со «слабым» ответом яичников, о котором свидетельствовал факт получения в предшествующих программах ЭКО < 3 ооцит-кумулюсных комплексов (без оценки зрелости ооцитов) при ежедневной дозе рекомбинантного фолликулостимулирую-щего гормона не менее 150 МЕ;

2) возраст женщины 40 лет и старше, а также такие факторы риска «слабого» ответа на стимуляцию суперовуляции, как укорочение менструального цикла, эндометриоидные кисты яичников, оперативные вмешательства на яичниках в анамнезе;

3) концентрация антимюллерова гормона в сыворотке крови менее 0,5 нг/мл независимо от дня менструального цикла и/или наличие в обоих яичниках менее 5-7 антральных фолликулов диаметром менее 10 мм на 2-3-й день спонтанного менструального цикла.

Два эпизода «слабого» ответа яичников на стимуляцию суперовуляции в предыдущих протоколах ЭКО также являлись критерием включения в данное исследование.

В основную группу вошли 22 женщины, которым проводилась контролируемая стимуляция суперовуляции рекомбинантными и/или мочевыми гонадотропинами в программе ЭКО в сочетании с рекомбинантным гормоном роста и применением антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона. Гормон роста использовали ежедневно в вечерние часы с первого дня стимуляции суперовуляции в дозе 4 МЕ подкожно до введения триггера овуляции. Были сформированы две группы сравнения пациенток, стимуляция суперовуляции у которых проводилась по аналогичной схеме без использования гормона роста. В первую группу сравнения вошли 14 женщин с прогнозируемым «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропина-ми. Во вторую группу сравнения были включены результаты 22 прошлых циклов стимуляции пациентов основной группы.

Результаты исследования

При анализе показателей исходного гормонального статуса пациенток установлено, что концентрация в сыворотке крови фолликуло-стимулирующего гормона на 2-3-й день спонтанного менструального цикла в основной группе (11,86 ± 0,84 МЕ/л) была достоверно выше по сравнению с первой (7,62 ± 0,79 МЕ/л) и второй (7,5 ± 0,56 МЕ/л) группами сравнения (р < 0,01). Средняя стартовая и суммарная дозы гонадотропинов при этом достоверно не различались во всех анализируемых группах. Длительность стимуляции у пациентов основной группы (8,32 ± 0,36 дня) была достоверно меньше (р < 0,01) по сравнению со второй группой срав-

нения (10,09 ± 0,37 дня) и достоверно не различалась по сравнению с первой группой сравнения (9,14 ± 0,45 дня). У двух пациенток второй группы сравнения ранее отсутствовал ответ на стимуляцию овуляции, тогда как при использовании рекомбинантного гормона роста были получены эмбрионы, перенос которых в полость матки привел к наступлению беременности. Среднее количество полученных ооцитов и жизнеспособных эмбрионов на 3-й день развития достоверно не различались во всех анализируемых группах. Доля морфологически качественных эмбрионов в день переноса в основной группе была достоверно выше (р < 0,05) по сравнению с первой и второй группами сравнения. В результате проведения программы ЭКО беременность наступила только у пациентов основной группы. Частота наступления беременности на перенос составила 15 %.

выводы

Использование соматотропного гормона у женщин групп риска по «слабому» ответу на стимуляцию овуляции в циклах ЭКО повышает чувствительность яичников в ответ на экзогенное влияние гонадотропинов. Применение гормона роста не оказывает влияния на количество получаемых ооцитов, однако его использование в протоколах ЭКО приводит к увеличению числа морфологически качественных эмбрионов и, следовательно, повышает перспективы наступления беременности. Для определения целесообразности применения соматотропного гормона в протоколах ЭКО у женщин со «слабым» ответом на стимуляцию суперовуляции необходимо проведение дальнейших исследований, поскольку в данной работе освещена лишь небольшая выборка пациентов.

акупунктура как адъювантная терапия для пациенток в циклах экстракорпорального оплодотворения

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, кафедра неврологии, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные технологические достижения последних 20 лет, вероятность «успеха» одной попытки лечения бесплодия с использованием программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) остается неизменной, составляя в среднем 28-34 % (CDC, 2011; ESHRE, 2014) на перенос эмбрионов (ПЭ) в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В этой связи в современной репродуктологии

ведется активный поиск новых безопасных методов (лабораторные техники, фармакологическая терапия), направленных на увеличение процента наступления беременности в программах ВРТ. На сегодняшний день одним из наиболее популярных видов адъювантной альтернативной терапии, использующейся для лечения бесплодных пар, является акупунктура (Domar et al., 2012). Тем не менее данные об эффективности этого метода для улучшения результатов ЭКО остаются неод-

нозначными, а схемы применения — вариабельными, что обусловливает необходимость систематического анализа сведений об использовании акупунктуры в репродуктологии.

Цель исследования: проанализировать эффективность применения акупунктуры в программах ВРТ на основании данных статей за последние 20 лет.

материалы и методы исследования

Выполнен поиск статей в базах данных PubMed, Embase, Web of knowledge (Science) с 1996 по февраль 2016 г. по ключевым словам (Medical subject headings): акупунктура (acupuncture, moxibustion and electroacupuncture) и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (ICSI), ЭКО, ВРТ (ICSI, IVF, in vitro fertilization, assisted reproduction). В результате поиска обнаружено 116 статей, которые были подвергнуты систематическому анализу. На первом этапе были исключены исследования, представленные не на английском языке, не включающие анализ пациенток в циклах ВРТ, заметки к редактору, а также статьи, которые не были доступны в полнотекстовом виде. На втором этапе в обзор были включены только рандомизированные контролируемые исследования (РКИ), метаанализы литературы и систематические обзоры.

Результаты исследования

Анализ данных литературы по эффективности использования акупунктуры в программах ВРТ выявил 21 РКИ и 6 систематических обзоров и метаанализов. Методы в представленных исследованиях включали: иглорефлексотерапию, лазеропунктуру, электропунктуру и плацебо. Во всех работах акупунктурные точки варьировали, но их выбор базировался на основных принципах традиционной китайской медицины. В 70 % работ проводилась только акупунктура тела, в то же время в некоторых из них также использовалась акупунктура уха. Наиболее часто использовался протокол, предложенный W.E. Paulus et al. (2002).

В результате систематического анализа выделено 3 основные схемы использования акупунктуры в циклах ЭКО (ЭКО/ICSI): 1) 25 минут перед ПЭ в полость матки; 2) в фолликулярную фазу цикла и 25 минут до и после ПЭ; 3) 30 минут после ПЭ и в фазу имплантации.

В 70 % РКИ, в которых акупунктура использовалась только в день ПЭ, не было отмечено статистически значимых различий по частоте наступления клинической беременности по сравнению с группой «плацебо» или контрольной группой (без адъювантной терапии). Применение акупунктуры в лютеиновую фазу и за 30 минут до ПЭ, по данным 56 % проанализированных работ, оказывало положительный эффект на вероятность наступления беременности после цикла ЭКО (ЭКО/ ICSI). В подавляющем числе работ (80 %) было продемонстрировано значимое увеличение частоты наступления клинической беременности при использовании акупунктуры по «длинной» схеме: на 1-й и 7-й день контролируемой стимуляции яичников, в день до трансвагинальной пункции фолликулов и на следующий день после ПЭ в полость матки.

Ни в одном исследовании не было описано побочного эффекта от применения акупунктуры. Рядом авторов было высказано предположение о том, что длительный курс акупунктуры имеет большую эффективность для наступления беременности после ЭКО (ЭКО/ICSI). Также выявлена тенденция к увеличению эффективности применения акупунктуры в центрах ВРТ с более низкими средними показателями частоты наступления беременности в циклах ЭКО (ЭКО/ICSI).

выводы

Акупунктура может использоваться в качестве адъювантной терапии для пациенток в программах ВРТ. Тем не менее очевидна необходимость проведения дальнейших исследований по изучению эффективности ее применения, регламентации длительности и режима использования.

эффективность методов биопсии яичка (обнаружение сперматозоидов) у мужчин с азооспермией

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Бесплодие диагностируется у 10-15 % супружеских пар, при этом примерно в половине наблюдений оно обусловлено нарушениями репродуктивной функции со стороны мужчины, а в 20 % — патологией обоих супругов. Распространенность азоо-

спермии в популяции всех мужчин составляет примерно 1 %, среди бесплодных мужчин — 10-15 %. Особого внимания заслуживает азооспермия, обусловленная генетическими и эндокринными факторами, которые определяют тактику лечения этой категории пациентов.

Цели работы: на основании обзорных и оригинальных статей отечественных и зарубежных авторов проанализировать эффективность методов биопсии яичка (TESA, TESE, micro-TESE) по обнаружению сперматозоидов у больных азооспермией.

Материалы и методы исследования

Проанализированы сведения, представленные в обзорных и оригинальных статьях зарубежных и отечественных авторов, посвященных эффективности различных методов биопсии яичка при азооспермии и факторам, влияющим на нее.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Результаты исследования

Установлены значимые различия в частоте обнаружения сперматозоидов между группами пациентов с необструктивной (секреторной) азооспермией (НОА) и обструктивной (экскреторной) азооспермией (ОА). У пациентов с НОА средняя частота обнаружения сперматозоидов при TESE составляет 45 %, при micro-TESE — 63 %, а при ОА сперматозоиды обычно удается получить практически во всех случаях. Также определены факторы, приводящие к НОА и снижающие вероятность обнаружения сперматозоидов при биопсии яичка. Среди них основными являются генетические и эндокринные. Ведущие генетические факторы — мутации в локусах AZF (a, b, c) длин-

ного плеча Y-хромосомы и изменения кариотипа. При микроделеции AZFa и AZFb вероятность обнаружения сперматозоидов равна 0 %, а при AZFc биопсия яичка может быть успешна в 50-70 % случаев, однако вероятность нахождения сперматозоидов уменьшается с возрастом. При немозаичной (классической) форме синдрома Клайнфельтера вероятность получения сперматозоидов в случае использования техники micro-TESE варьирует от 56 до 69 %, а у больных мозаичной формой синдрома Клайнфельтера — не превышает 10 %. В случае гипергонадотропного гипогонадизма вероятность обнаружения сперматозоидов при биопсии яичка низкая; при гипогонадотропном гипогонадизме вероятность возрастает в случае предварительного проведения стимулирующей терапии с использованием аналогов гонадотроп-ных гормонов.

выводы

1. Вероятность обнаружения сперматозоидов зависит от вида биопсии яичка, наличия у больных азооспермией неблагоприятных генетических и эндокринных факторов — мутации локуса AZF, синдрома Клайнфельтера, гипогонадизма.

2. Выбор метода биопсии и прогнозирование его эффективности должны быть проведены с учетом вышеуказанных факторов.

эффективность гистероскопии и пайпель-биопсии эндометрия при подготовке к программе экстракорпорального оплодотворения у пациенток с повторными неудачами имплантации

Санкт-Петербургский государственный университет, медицинский факультет, кафедра акушерства, гинекологии и репродуктологии, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Нарушение рецептивности эндометрия, связанное с патологией полости матки, обусловливает около одной трети всех случаев неудач имплантации. В связи с этим при подготовке к программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с повторными неудачами имплантации проводится морфологическое исследование эндометрия. С целью минимизации травматического воздействия на слизистую оболочку матки для получения образца эндометрия используются малоинвазивные процедуры, такие как гистероскопия и аспирационная биопсия эндометрия пайпель-зондом.

Целью данного исследования является сравнительная оценка эффективности применения гистероскопии и пайпель-биопсии эндометрия при

подготовке к программе ЭКО у пациенток с повторными неудачами имплантации.

Материалы и методы исследования

В исследование включено 129 пациенток с повторными неудачами имплантации в анамнезе, планирующих лечение бесплодия с применением методов ЭКО (ЭКО/ICSI) или переноса криокон-сервированных эмбрионов в полость матки (ПЭ) в отделении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта». Основную группу составили 63 женщины, которым перед программой ЭКО/ПЭ проводилась диагностическая гистероскопия, группу сравнения составили 66 пациенток, которым проводилась пайпель-биопсия эндометрия. Пациентки обеих

групп были сравнимы по возрасту, ключевому фактору бесплодия и использованной программе ВРТ. Эффективность программ ВРТ оценивалась как частота наступления клинической беременности на проведенный перенос эмбрионов, частота имплантации оценивалась как отношение числа плодных яиц с живым эмбрионом к количеству перенесенных эмбрионов. Статистическую значимость различий рассчитывали с использованием /-критерия и критерия Манна-Уитни (U). Различия считались статистически значимыми при р < 0,05 (95 %-й уровень значимости). Оценку связи переменных осуществляли с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r) с расчетом значимости его значений по /-критерию.

Результаты исследования

Эффективность программ ВРТ у пациенток основной группы, которым в рамках прегравидар-ной подготовки проводилась гистероскопия, составила 49,21 %, частота имплантации — 28,45 %. У пациенток группы сравнения эффективность программ ВРТ была 28,79 % (U = 114,0; р < 0,01), частота имплантации — 19,66 % (р = 0,12). Имеющиеся межгрупповые различия в частоте наступления беременности были существенны как после программ ЭКО, так и после циклов с переносом в полость матки криоконсервиро-ванных эмбрионов. В основной группе эффективность программы ЭКО составила 50 %, частота имплантации — 30,0 %, в группе сравнения эффективность ЭКО была 32,56 % (р = 0,1), частота имплантации — 21,52 % (р = 0,21). У пациенток после гистероскопии эффективность цикла с переносом криоконсервированных эмбрионов составила 47,39 % с частотой имплантации 26,47 %, у пациенток после пайпель-биопсии эндометрия показатели эффективности программы ПЭ составили 21,74 % (р = 0,083) и 14,63 % (р = 0,21) соответственно. Корреляционный анализ показал, что проведение гистероскопии в рамках подготовки к программам ВРТ у пациенток с повторными неудачами имплантации имеет достоверную положительную связь с частотой наступления беременности (r=0,21, p=0,019).

Гистероскопия, используемая с целью достижения эффекта контролируемого повреждения эндометрия в цикле, предшествующем программе ВРТ, показала большую эффективность в сравнении с пайпель-биопсией. Из 10 пациенток, вступивших в программу ВРТ в следующем после гистероскопии менструальном цикле, беременность наступила у 5 (50 %) пациенток, тогда как из 17 пациенток, у которых в цикле непосредственно перед программой ВРТ проводилась пайпель-биопсия эндометрия, беременность была диагностирована лишь у 5 (29,41 %). Эффект контролируемого повреждения эндометрия сохранялся на протяжении трех месяцев после проведения гистероскопии (эффективность программ ЭКО/ПЭ через три месяца после гистероскопии составляла 50 %, снижаясь до 43,33 % к 6-му месяцу).

Выполнение биопсии эндометрия под контролем гистероскопии повышает диагностические возможности морфологического исследования ткани эндометрия. Среди включенных в исследование пациенток, сравнимых по клинико-анамнестиче-ским характеристикам и не имеющих клинических и сонографических признаков внутриматочной патологии, морфологические изменения эндометрия чаще выявлялись у женщин после проведения гистероскопии. В ходе комплексного морфологического исследования эндометрия у пациенток основной группы в 58,73 % случаев выявлен хронический эндометрит, в 22,22 % — полипы эндометрия, в 14,29 % — гиперплазия эндометрия. В образцах, полученных путем аспирации пайпель-зондом, перечисленные нозологические формы обнаружены лишь в 45,45 % (U = 105,0; р < 0,01), 12,12 % (U = 24,0; р < 0,01) и 6,06 % (U= 10,0; р=0,002) случаев соответственно.

Выводы

Полученные данные свидетельствуют о том, что включение гистероскопии в план обследования пациенток с повторными неудачами имплантации не только обеспечивает полноценную диагностику состояния полости матки, но и положительно влияет на исходы последующей программы ВРТ.

эктопическая беременность после экстракорпорального оплодотворения: ретроспективный анализ шести лет работы отделения вспомогательных репродуктивных технологий

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы продуктивных технологий (ВРТ) относится экто-

К одним из осложнений лечения бесплодия пическая беременность (ЭБ), частота выявления с использованием методов вспомогательных ре- которой составляет 1,4-5,4 % и превышает тако-

вую в общей популяции (2 %). Данные о патогенезе эктопической имплантации эмбриона после вспомогательного переноса (ПЭ) в полость матки представлены в единичных исследованиях. Также до настоящего времени не установлены факторы, определяющие риск развития внематочной беременности у пациенток после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Цель исследования: выявить факторы риска возникновения эктопический беременности после лечения бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения.

Материалы и методы исследования

В ретроспективное когортное исследование были включены 1194 пациентки, достигшие беременности после ПЭ в программах ЭКО, проведенных на отделении ВРТ ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта» с февраля 2010 по январь 2016 г. Наличие клинической беременности определяли при визуализации плодного яйца в полости матки по данным сонографии; диагностику внематочной беременности проводили при сочетании ультразвукового и последующего эндоскопического исследований. Факторы риска возникновения ЭБ после ЭКО выявляли на основании данных анализа историй болезней с использованием метода уни-вариабельной логистической регрессии; результаты представляли в виде отношения шансов (OR) и его 95 %-го доверительного интервала (CI).

Результаты исследования

За 6 лет работы отделения ВРТ был зарегистрирован 21 случай внематочной беременности. Частота выявления ЭБ в расчете на клиническую

беременность составила 1,76 % (21/1173). Возраст пациенток, длительность бесплодия, количество беременностей (в том числе эктопических) и операций на органах малого таза в анамнезе, индекс массы тела, курение, сопутствующие соматические и гинекологические (эндометриоз, миома матки, синдром поликистозных яичников) заболевания не были ассоциированы с развитием ЭБ. Бесплодие трубно-перитонеального генеза было диагностировано значимо чаще у пациенток с ЭБ после ЭКО, OR = 3,37 (95 % CI 1,39-8,2), p = 0,007. Риск развития внематочной беременности увеличивался в 4 раза при выявлении билатеральной патологии маточных труб по данным гистеро-сальпингографии и/или лапароскопии (OR = 4,04, 95 % CI 1,56-10,49, p = 0,005). Также факторами риска являлись перенесенная хламидийная инфекция и аппендэктомия в анамнезе (OR = 3,74, 95 % CI 1,07-13,13, р = 0,007 для обоих). Не было установлено взаимосвязи между основными показателями стимуляции яичников, эмбриологического этапа программы ЭКО и диагностикой ЭБ после лечения бесплодия. Частота внематочной беременности после переноса эмбрионов в «свежем» и в криопротоколе была сопоставима: 1,28 % (3/234) vs 1,92 % (18/939), p=0,52.

выводы

Частота выявления внематочной беременности после переноса эмбрионов в программе ЭКО составляет 1,76 % в расчете на клиническую беременность. Основным фактором риска развития эктопической беременности после лечения с использованием методов ВРТ является бесплодие трубно-перитонеального генеза.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

влияние продуктов секреции плаценты на трансмиграцию nk-клеток через трофобласт

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Трофобласт — гетерогенная популяция клеток, выполняющая разнообразные функции, в том числе трофическую и барьерную. Эндоваскулярный трофобласт замещает эндотелиальные клетки (ЭК) спиральных артерий матки и приобретает фенотип ЭК. В настоящее время не изучена способность трофобласта контролировать миграцию лейкоцитов, в том числе NK-клеток в децидуаль-ную оболочку.

Цель работы: изучить трансмиграционную активность NK-клеток через монослой клеток тро-фобласта в присутствии секреторных продуктов плацент 1-го и 3-го триместров беременности.

материалы и методы исследования

Клетки трофобласта линии JEG-3 вносили в верхнюю камеру вставки с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм) для 24-луночных планшетов, инкубировали 24 часа. Затем в верхнюю камеру вносили NK-клетки линии NK-92mi. В нижнюю камеру вносили кондиционированную среду, полученную после культивирования эксплантов плацент 1-го и 3-го триместров, физиологическая беременность. Инкубировали 24 часа. Затем NK-клетки из нижней и верхней камеры обрабатывали антителами против CD 45, CD 11a, CD 11b, CD 11c, CD 18. Подсчет мигрировавших в нижнюю камеру NK-клеток и анализ экспрессии поверхностных маркеров проводили с помощью проточного цитофлуориметра FACSCantoII (BD, США).

результаты исследования

Как при спонтанной миграции, так и при миграции в присутствии секреторных продуктов плацент NK-клеток через трофобласт, экспрессия CD 11c, CD 11b, CD 18 NK-клетками из нижней ка-

меры по сравнению с клетками из верхней камеры была ниже (p < 0,001). При спонтанной миграции также снижался CD 11a (p < 0,001).

В присутствии секреторных продуктов плацент 1-го триместра количество мигрировавших клеток увеличивалось в 1,8 раза по сравнению со спонтанным уровнем. В верхней камере в присутствии продуктов плацент 1-го триместра количество NK-клеток, несущих CD 11c, было выше по сравнению со спонтанным уровнем (p < 0,01). Уровень экспрессии CD 11c NK-клетками нижней камеры был выше спонтанного в 1,3 раза.

В верхней камере в присутствии продуктов плацент 3-го триместра количество NK-клеток, несущих CD 11c, было выше по сравнению со спонтанным уровнем (p < 0,01). Кроме того, в верхней камере в присутствии продуктов плацент 3-го триместра количество NK-клеток, несущих CD 11a, было выше как по сравнению со спонтанным уровнем (p < 0,01), так и по сравнению с миграцией в присутствии секреторных продуктов плацент 1-го триместра (p < 0,05). В присутствии продуктов плацент 3-го триместра уровень экспрессии CD 11c NK-клетками из нижней камеры был выше спонтанного в 1,3 раза.

выводы

NK-клетки способны мигрировать через клетки трофобласта. В результате миграции через тро-фобласт меняется фенотип NK-клеток, а именно снижается экспрессия адгезионных молекул как при спонтанной миграции, так и в присутствии секреторных продуктов плацент. Трансмиграция NK-клеток через трофобласт усиливается в присутствии секреторных продуктов плацент 1-го триместра, что может быть связано с повышенной экспрессией NK-клетками CD 11c.

влияние макрофагов на ангиогенез

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Ангиогенез является важнейшим процессом, за счет которого происходит развитие плаценты, что в свою очередь обеспечивает рост и развитие

плода. Формирование и рост сосудов, а также их ремоделирование зависят от функционального состояния эндотелиальных клеток (ЭК), взаимодействия ЭК с клетками микроокружения и сба-

лансированной секреции цитокинов, ростовых факторов и хемокинов ЭК с клетками иммунной системы, в частности макрофагами. В связи с этим изучение взаимодействия ЭК и макрофагов является актуальной задачей современной медицины и биологии.

Цель исследования: изучение влияния моноци-топодобных клеток линии 'ГНР-1 на формирование капилляроподобных структур ЭК в присутствии факторов роста, про- и противовоспалительных цитокинов.

Материалы и методы исследования

В работе использовали ЭК линии EA.Hy926 и моноцитоподобные клетки линии THP-1. В лунки 24-луночного планшета с трехмерным ма-триксом Matrigel (BD, США) вносили 150 000 ЭК линии EA.Hy926 и 2,5 % ЭТС, к части лунок добавляли 250 000 клеток линии THP-1, а к части лунок — культуральную среду без клеток линии THP-1, инкубировали в течение 24 часов. Для активации клеток использовали ростовые факторы: VEGF (1, 10, 100 нг/мл), bFGF (1, 10, 20 нг/ мл), PlGF(1, 5, 20 нг/ мл), TGFP (1, 5, 10 нг/ мл); про-и противовоспалительные цитокины: IFNy (40, 400 и 1000 Ед/ мл), IL-4 (10, 50, 100 Ед/мл), IL-6 (1, 2,5, 4 нг/ мл), IL-10 (1, 10, 20 нг/мл), TNFa (10, 50, 400 Ед/мл), IL-1P (10, 100, 1000 Ед/ мл) и хемокин IL-8 (1, 10, 100 нг/ мл). Для визуализации клеток линии THP-1 использовали краситель Calcein AM (Sigma, США). При помощи микроскопа AxioObserver.Z1 (Carl Zeiss Microscopy, Германия) и компьютерной системы анализа изображений оценивали длину и количество образованных капилляроподобых структур в микрометрах.

результаты исследования

При монокультивировании ЭК (118,6 ± 0,7) VEGF (125,5 ± 2,6, p< 0,05; 126,5 ± 2,4, p< 0,01;

133.3 ± 2,6, p < 0,001), bFGF (117,9 ± 1,0; 135,0 ± 1,4, p< 0,001; 134,4 ± 1,3, p< 0,001), IL-8 (118,4 ± 1,8; 127,6 ± 2,4, p < 0,001; 145,7 ± 3,8, p < 0,001), IL-ф (124,1 ± 2,9; 130,9 ± 2,9, p < 0,001; 138,3 ± 5,3, p < 0,001), IL-6 (121,0 ± 2,2; 121,4 ± 2,2; 125,9 ± 2,6, p < 0,01) и TNFa (132,6 ± 2,4, p < 0,001; 120,2 ± 2,8;

130.4 ± 3,1, p < 0,001) во всех концентрациях увеличивали, а TGFP (120,5 ± 4,6; 119,3 ± 4,2; 105,1 ± 4,5, p < 0,01) снижал длину капилляроподобных структур, образованных ЭК. Плацентарный фактор роста (117,8 ± 1,6; 115,9 ± 1,4; 114,6 ± 2,2) не оказал влияния на длину клеточных тяжей по сравнению с культивированием ЭК в отсутствие факторов роста. При этом противовоспалительные цитокины

IL-10 в концентрациях 1 нг/мл (115,5 ± 2,0) и 10 нг/мл (111,6 ± 2,7, p < 0,05) и IL-4 в концентрациях 10 Ед/мл (117,7 ± 1,7) и 50 Ед/мл (117,9 ± 3,2) снижали длину капилляроподобных структур, а в концентрации 20 нг/мл (122,2 ± 3,3) и 100 Ед/ мл (124,2 ± 2,3, p < 0,05) соответственно увеличивали. Провоспалительный цитокин IFNy в концентрации 40 Ед/мл (102,1 ± 1,6, p < 0,001) уменьшал длину клеточных тяжей, образованных ЭК, а в концентрациях 400 Ед/мл (119,0 ± 2,0) и 1000 Ед/мл (142,6 ± 3,6, p< 0,001) увеличивал их длину. При совместном культивировании клеток линии ТНР-1 с ЭК длина капилляроподобных структур (125,7 ± 0,8, p< 0,001), образованных ЭК линии EA.Hy926, была выше по сравнению с культивированием ЭК в отсутствие клеток линии ТНР-1 (118,6 ± 0,7). Во всех концентрациях VEGF (133,8 ± 2,6, p< 0,05; 141,7 ± 2,9, p< 0,001; 136,9 ± 2,6), bFGF (130,8 ± 1,7, p < 0,001; 129,8 ± 1,8, p< 0,05; 138,6 ± 2,1) и PlGF (124,3 ± 2,0, p< 0,05; 126,22 ± 2,4, p< 0,001; 132,1 ± 2,8, p< 0,001), хемокин IL-8 (121,4 ± 2,7; 129,0 ± 2,4; 144,1 ± 6,4), а также противовоспалительные цитокины IL-4 (121,4 ± 3,0; 126,9 ± 2,8, p < 0,001; 132,3 ± 2,8, p < 0,01) и IL-10 (121,0 ± 3,0; 123,8 ± 3,0, p < 0,001; 125,9 ± 5,1) увеличивали, а TGFP (106,3 ± 5,1, p < 0,05; 93,7 ± 3,6, p < 0,001; 81,4 ± 1,2, p < 0,001), TNFa (111,9 ± 2,2, p < 0,001; 113,8 ± 2,6; 129,0 ± 2,5) и IL-6 (121,4 ± 4,2; 121,6 ± 3,2; 117,9 ± 2,8) снижали длину капилляроподобных структур, образованных ЭК линии EA.Hy926, в присутствии клеток линии ТНР-1 по сравнению с монокультивированием ЭК в присутствии цитокинов. Провоспалительный цитокин IFNy в концентрациях 40 Ед/мл (111,2 ± 1,5, p < 0,001) и 400 Ед/мл (122,5 ± 1,9) способствовал увеличению длины клеточных тяжей, а в концентрации 1000 Ед/мл (139,2 ± 4,4) уменьшал их длину, а IL-1P в концентрациях 10 Ед/мл (115,0 ± 2,5, p < 0,05) и 100 Ед/мл (125,7 ± 2,6) снижал, а в концентрации 1000 Ед/мл (128,5 ± 3,2) увеличивал длину клеточных тяжей по сравнению с монокультивированием ЭК в присутствии цитокинов.

выводы

Цитокины и факторы роста оказывают влияние на формирование капилляроподобных структур, при этом макрофаги за счет секреторной активности и контактного взаимодействия с ЭК изменяют секреторный профиль ЭК и характер действия ростовых факторов и цитокинов, тем самым влияя на формирование капилляроподобных структур ЭК линии EA.Hy926.

эмбриотипия в фетальный период развития крысы в экспериментальной модели рака желудка

Оренбургский государственный медицинский университет, г. Оренбург, Россия

Актуальность проблемы

Этапность гисто-, органо-, системогене-за — важнейший механизм реализации всего комплекса условий пренатального онтогенеза, определяющий динамический аспект адаптации процесса становления пространственной организации эмбриона и плода к последовательному закономерному изменению имманентных факторов регуляции морфогенеза. Объем, интенсивность, направленность последнего зависят от возникновения и усложнения необходимых взаимоотношений орагнизмов эмбриона (плода) и матери с учетом достижения ими эффективных параметров.

В основе тканевых трансформаций — ком-митирование и детерминация — явления специальной активности генома в соответствующий критический период. Следует подчеркнуть, что открытие новых генов, функциональная активность которых контролирует реализацию конкретных условий гистогенеза, все еще не связано с определением достоверных, объективных моделей взаимодействия генов, что ограничивает методолого-методические возможности изучения формообразовательных процессов, прежде всего разработку понятия о биологической форме и ее возникновении в широком смысле. Обозначенные проблемы имеют множество практических приложений, но все еще далеки от разрешения.

Структурная, физиологическая, биохимическая характеристика этапов развития в прена-тальный период на основе синтезного подхода и с учетом верификации критериального значения каждого из изменений все еще недостаточно разработанная проблемная область эмбриологии. Подготовка каждого последующего качественного изменения в процессе дифференцировки структур и несостоятельность соответствующего градиентного потенциала — сложно обусловленные феномены. Здесь актуально установление значения патогенетического модулирования гестационной доминанты матери и обобщение конкретных моделей материнско-плодных отношений в связи с обозначенными выше проблемами. Это лежит в основе решения задачи формирования новых теоретических представлений и развития практических технологий.

Цель исследования: показать гистогенетиче-ские свойства трансформации тканевых дифферо-нов в фетальном периоде с учетом верификации конкретных ее динамических условий при моделировании рака желудка беременной самки.

материалы и методы исследования

Работа выполнена на беспородных белых крысах-самках (N= 35), которым в течение 6 месяцев интрагастрально вливали 0,02 % водный раствор формальдегида и перекиси водорода (в соотношении 1 : 1) два раза в неделю через неделю (запатентованный способ моделирования экспериментального рака желудка). При работе с животными соблюдались нормы Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985). Через 5 месяцев интоксикации к самкам подсадили самцов по формуле 1 х 5. После завершения беременности новорожденных крысят фиксировали в формалине. Для гистологических исследований материал подвергли стандартной обработке. Тотальные серийные срезы плодов окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Количественные данные обработали обычными методами статистики с уровнем значимости, не превышающим 5 %.

результаты исследования

Беременность наступила только

у 17,1 ± 0,6 % самок по сравнению с контрольной группой животных (p < 0,001). При этом среднее количество крысят, приходящихся на одну крысу, было почти в два раза меньше (p < 0,001), а масса тела троекратно снижена по сравнению с группой контроля (p < 0,001). Доля новорожденных крысят, обнаруженных живыми, составила 16,8 ± 1,3 % (p < 0,001). При сравнительно обычном сроке гестационного периода (около 21 дня) крысята, обнаруженные неживыми, характеризовались недостаточной динамикой гисто- и органогенеза. Органы и их системы были сформированы, но наблюдалось значительное ослабление процессов дифференцировки и необходимой прогрессивной тканевой трансформации. Тканевые элементы были образованы незрелыми дифферо-нами. Гистологический анализ позволил установить, что крысята осуществили первый вдох — в респираторный отдел дыхательной системы поступил воздух. При этом паренхима легких характеризовалась значительным уровнем незрелости. В обширном объеме недифференцированной ткани обнаруживалось малое количество зачатков альвеол. Признаки саккулярного легкого не определяли реализацию всего объема морфогенетиче-ских процессов данной стадии развития, то есть свидетельствовали о нарушении этапности раз-

вития легких. Выстилка мешочков была образована кубическим эпителием, иногда гетерогенна и демонстрировала метаплазию при развитии плоского эпителия. В паренхиме обнаруживались многочисленные беспросветные эпителиальные тяжи и отсутствовали взаимоотношения сосудистого аппарата и респираторных элементов. В целом в легких не были сформированы структурные условия для эффективного газообмена.

Почки крысят находились на этапе метанеф-рогенной бластемы, когда паренхима образована ветвящимся дивертикулом вольфого протока. Нефроны не обнаруживались. В печени развитая кроветворная активность, портальный аппарат и гепатобилиарная системы не были сформированы, печеночные балки отсутствовали. Головной мозг был представлен мозговыми

пузырями с объемными полостями. В хрящевых моделях костей отсутствовали очаги оссифика-ции: не индуцирована даже остеоидная стадия остеогистогенеза.

выводы

Эксперимент по моделированию рака желудка самок при наступлении беременности позволил дать оценку патогенетического значения усугубляющих друг друга последовательно формируемых условий интоксикации и канцерогенеза для процессов морфогенеза плода. Доказан факт пролонгации эмбриотипии в плодном периоде.

Исследование выполнено за счет гранта Правительства Оренбургской области (Постановление № 465-п от 17.06.2015).

клетки трофобласта подавляют пролиферативную активность nk-клеток при беременности

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», отдел иммунологии, лаборатория межклеточных взаимодействий, г Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

NK-клетки играют важную роль в процессе подготовки эндометрия к имплантации. Количество NK-клеток в эндометрии закономерно изменяется в ходе менструального цикла, а также в течение беременности. Одним из возможных механизмов накопления NK-клеток в эндометрии является их пролиферация in situ. При беременности клетки трофобласта регулируют функциональную активность NK-клеток. В настоящее время недостаточно изучено влияние клеток трофобласта на пролиферацию NK-клеток.

Цель исследования: оценить влияние клеток трофобласта на пролиферативную активность NK-клеток при беременности.

Материалы и методы исследования

Обследовано 20 здоровых небеременных женщин в пролиферативной фазе менструального цикла (группа 1), 19 здоровых небеременных женщин в секреторной фазе менструального цикла (группа 2) и 20 женщин с физиологическим течением беременности на сроке 6-7 недель (группа 3). В лунки плоскодонного 96-луночного планшета с монослоем клеток линии JEG-3 вносили мононуклеары периферической крови и ре-комбинантный человеческий IL-2. После 7 суток инкубации оценивали относительное количество NK-клеток (CD56+) с помощью проточного цитофлюориметра (BD FACSCanto II, США).

Пролиферативную активность NK-клеток оценивали по интенсивности экспрессии маркерного белка пролиферации Ki-67 (в относительных единицах флуоресценции).

Результаты исследования

При добавлении IL-2 во всех исследуемых группах наблюдали увеличение пролифера-тивной активности NK-клеток по сравнению со спонтанным уровнем (интенсивность экспрессии маркерного белка пролиферации Ki-67 NK-клетками в присутствии IL-2 (относительные единицы флуоресценции); результаты представлены в виде: медиана {нижний квартиль; верхний квартиль}: группа 1 — 2698 {2030; 3280}, группа 2 — 2498 {2050,5; 7419,5}, группа 3 — 12481 {2644; 18900}; спонтанный уровень: группа 1 — 438 {170; 945}, группа 2 — 512 {216; 1286}, группа 3 — 1138 {507; 1453}. Достоверность различий внутри групп p< 0,001). В присутствии клеток трофобласта пролиферативная активность NK-клеток была ниже по сравнению со спонтанным уровнем (интенсивность экспрессии маркерного белка пролиферации Ki-67 NK-клетками в присутствии клеток трофобласта (относительные единицы флуоресценции): группа 1 — 162 {89; 204}, группа 2 — 168,5 {97; 486}, группа 3 — 485 {145,5; 1044}. Достоверность различий внутри групп от спонтанного уровня:

p < 0,001 для групп 1 и 2; p < 0,01 для группы 3). Пролиферативная активность NK-клеток, стимулированных IL-2, была ниже в присутствии клеток трофобласта по сравнению со стимуляцией IL-2 в отсутствие клеток трофобласта (интенсивность экспрессии маркерного белка пролиферации Ki-67 NK-клетками в присутствии IL-2 и клеток трофобласта (относительные единицы флуоресценции): группа 1 — 578 {490; 813}, группа 1 — 810 {601; 1412}, группа 1 — 2895 {920; 4205}. Достоверность различий внутри групп от культивирования в присутствии IL-2: p < 0,001). Данное ингибирующее действие клеток трофобласта было выражено слабее в отношении NK- клеток женщин группы 2 по сравнению с группой 1 (p < 0,05). Пролиферативная активность NK- клеток женщин группы 3 в присутствии IL-2 была примерно в 5 раз выше по сравнению с группами 1 (p < 0,001) и 2 (p < 0,01). В присутствии клеток трофобласта наблюдали ингибирование пролиферации стимулированных IL-2 NK-клеток женщин группы 3 (p < 0,001), однако базальный уровень пролифе-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

рации в данном случае был выше по сравнению с группами 1 (p < 0,001) и 2 (p < 0,001).

выводы

Клетки трофобласта ингибируют как спонтанную, так и индуцированную IL-2 пролиферацию NK-клеток in vitro при беременности и вне беременности. Ингибирующее действие клеток трофобласта на пролиферацию NK-клеток выражено в различной степени в зависимости от фазы менструального цикла. В секреторной фазе менструального цикла NK-клетки периферической крови более устойчивы к ингибирующему действию клеток трофобласта по сравнению с пролифера-тивной фазой. NK-клетки периферической крови беременных женщин обладают повышенной пролиферативной активностью по сравнению с NK- клетками небеременных женщин. Этот факт свидетельствует в пользу активированного состояния NK-клеток при беременности. Предактивация NK-клеток при беременности может способствовать их повышенной устойчивости к ингибирую-щему действию со стороны клеток трофобласта.

исследования влияния на морфологию клеток эндометрия квантовых точек на основе цинка

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, г. Санкт-Петербург, Россия;

2 ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

В последние два десятилетия в связи с развитием методов визуализации биологических объектов особое внимание стали привлекать полупроводниковые нанокристаллы различного типа, в особенности квантовые точки (КТ). КТ — это полупроводниковые флуоресцентные кристаллы, размер ядра которых составляет от единиц до десятков нанометров, а количество атомов 500-10 000. Этот новый вид флуорофоров обладает уникальными оптическими свойствами, устойчивостью к фотообесцвечиванию, широким спектром поглощения и узким спектром излучения, возможностью регулирования излучения за счет изменения размеров частиц. Перечисленные физико-химические и оптические свойства и особенности КТ напрямую зависят от метода получения. Их можно использовать практически во всех сферах, в которых нашли широкое применение современные полупроводники. В первую очередь КТ широко применяются в диагностических целях. В частности, их можно присоединять к биомолекулам (антитела, пептиды, белки или ДНК). А эти соединения могут быть образованы так, чтобы находить другие молекулы. В настоящее время разрабатываются

методики снабжения КТ антителами, имеющими сродство к поверхностным антигенам опухолевых клеток.

Наибольшей популярностью в качестве материала для синтеза КТ последние 10 лет пользуется кадмий, однако из-за того, что он относится к группе тяжелых металлов с высокой токсичностью, ученые пытаются применять для своих целей более безвредные материалы. В нашей работе исследовались КТ на основе цинка, которые могут стать в будущем идеальными флуорофорами для сверхчувствительной, многоцветной детекции биологических объектов и медицинской диагностики.

Цель исследования: исследовать влияние на морфологию клеток эндометрия нового вида квантовых точек ZnSe, легированных марганцем (Mn) и стабилизированных молекулами меркаптопро-пионовой кислоты (МПК) in vitro.

материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели на кафедре микро- и наноэлектроники СПбГЭТУ ЛЭТИ были созданы растворы наночастиц ZnSe: Mn, покрытых молекулами МПК, методом коллоидного синтеза в жидкой фазе.

Международная конференция «Репродуктивная медицина: взгляд молодых — 2016» International conference "Reproductive medicine: young scientists' overlook — 2016"

А

Б

Рис. 1. Культура клеток эндометрия человека, окраска гематоксилином и эозином, х400 (А — контрольная группа, Б — группа с введенными КТ в концентрации 1,15 нМ/мкл через 24 ч)

Материалом для исследования были выбраны клетки эндометрия. Их культивирование происходило в среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки плодов коровы, 1 % раствор Хепеса, 1 % раствор L-глютамина и антибиотик (пенициллин G, биолот, РФ). Культура поддерживалась при 37 °C в атмосфере 5 % СО2. Культуральная среда менялась каждые 1-2 дня.

Чтобы оценить влияние квантовых точек ZnSe: Мп/МПК на морфологию клеток эндометрия исследование проводилось через 18, 24 и 48 ч после инкубации с КТ, которая имела концентрацию 1,15 нМ/мкл. Окрашивание препаратов проводилось гематоксилином и эозином по стандартной методике. Оценка результатов морфологического исследования осуществлялась с помощью микроскопа BX-46 (Olympus, Япония), цифровой камеры UC 30 и программного обеспечения CellSence Entry.

Результаты исследования

За время длительной инкубации КТ ZnSe: Mn/ МПК с клетками эндометрия не наблюда-

лись морфологические признаки изменения культивируемых клеток, говорящие об изменении их состояния, таких как наличие базальных вакуолей и др. (рис. 1). Также не наблюдалось открепления клеток от субстрата и их гибели. Во всех контрольных группах (контроль и экспериментальные группы) эндометриальные клетки имеют хорошо различимую цитоплазму, занимающую примерно 70 % клетки, небольшое овальной формы ядро.

Выводы

Отработана методика инкубации КТ с клеточной культурой. Наличие МПК-оболочки у исследуемых КТ не вызывает изменений в строении клеток, что говорит о том, одним из важных факторов использования КТ в биологических исследованиях является наличие гидрофильных групп на поверхности частиц.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-1500324).

ОСОБЕННОСТМ популяционного СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ И УРОВЕНЬ экспрессии рецептора tlr2 моноцитами пуповинной крови

ФГБУ «Научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, научное отделение иммунологии и клинической микробиологии, г. Екатеринбург, Россия

Актуальность проблемы

Поверхностный мембранный рецептор врожденного иммунитета TLR2 (Toll-like receptor 2, CD282) экспрессируется на поверхности моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, полиморфно-

ядерных лейкоцитов, в некоторых В- и Т-клетках, в том числе Tregs (CD4+CD25+ регуляторные Т-лимфоциты). Его основная функция — распознавание бактериальных, грибковых, вирусных и некоторые других эндогенных веществ, что об-

условливает поглощение объектов фагоцитоза, а также процессы клеточной активации.

Связывание TLR-2 микробными продуктами приводит к воспалительному ответу, опосредованному продукцией цитокинов и противомикроб-ных пептидов.

В настоящее время в литературе недостаточно сведений, описывающих содержание CD282 в соответствии с конкретным гестационным возрастом (ГВ). Существуют лишь разрозненные данные, свидетельствующие о важности данной системы рецепторов врожденного иммунитета в пре- и постнатальном периодах. Снижение экспрессии CD282 обусловливает отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов, персистирование инфекции и хрониза-цию процесса. В связи с этими факторами оценка содержания популяционного состава лимфоцитов и уровня активированных моноцитов пуповин-ной крови, экспрессирующих TLR 2, является актуальной.

Цель исследования: оценить популяционный состав лимфоцитов и уровень экспрессии рецептора TLR 2 моноцитами пуповинной крови новорожденных различного гестационного возраста.

материалы и методы исследования

Проведено исследование образцов пупо-винной крови 53 новорожденных детей, из них 10 детей с гестационным возрастом 22-27 недель (1-я группа); 23 ребенка — 28-31 неделя ГВ (2-я группа) и 20 доношенных новорожденных с ГВ более 37 недель (3-я группа). Относительное содержание основных популяций лимфоцитов (CD3+/CD3+, CD19+/CD3-, CD4+/CD3+, CD8+/CD3+, CD16/56+/CD3), а также CD282+CD14+-моноцитов определяли методом проточной цитометрии. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 6. Данные представляли в виде медианы (Ме), нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го перцентилей, Р25 и Р75). Сравнение количественных признаков осуществляли c использованием U-критерия Манна — Уитни. Уровень значимости межгрупповых различий с учетом поправки Боферрони принимали равным 0,017.

результаты исследования

В результате исследований установлено снижение уровня экспрессии основных лимфоци-тарных маркеров в 1-й группе детей (ГВ 22-27 недель) относительно параметров 3-й группы

(ГВ 37-40 недель): CD3+ (17,5 (12,75-22) % против 53,5 (36-57) %), CD19+CD3- (4,5 (3,75-7) % против 13,5 (9-17) %) и CD8+CD3+ (5 (3,75-7,25) % против 13,5 (10-19) %) (p < 0,017 во всех случаях). Аналогичные результаты получены для детей с ГВ 28-31 неделя по отношению к показателям доношенных новорожденных с ГВ (более 37 недель), в этом случае также отмечалось снижение процентного содержания основных популяций лимфоцитов: CD3+ (42 (27-43) % против 53,5 (36- 57) %), CD4+CD3- (25 (18-34) % против 35 (28,25-41,25) %) и CD8+CD3- (12 (6-13) % против 13,5 (10-19) %) (p< 0,017 во всех случаях). Относительное число CD16/56+CD3- и CD19+CD3--клеток у детей 2-й группы было сопоставимо с показателями доношенных новорожденных. Исследование экспрессии маркеров CD 282+CD 14+ моноцитами пу-повинной крови показало, сниженное количество активированных клеток у детей с ГВ 22-27 недель в сравнении со значениями группы доношенных новорожденных — 39 (29,5-44,25) % против 59 (34-67) % (p< 0,017). Вместе с тем различий между 2-й и 3-й группами по данному параметру не выявлено.

При сравнении количества основных популяций лимфоцитов между группами недоношенных детей выявлено снижение относительного числа B-клеток (CD19+/CD3) в группе с ГВ 22-27 недель относительно показателей новорожденных с ГВ 28-31 неделя 4,5 (3,75-7) % против (11 (6- 13) %, p < 0,017). В то же время доля CD3+-, CD4+-, CD8- и CD16/56+-клеток значимо не различалась (p > 0,05). Содержание моноцитов пуповинной крови, экспрессирующих TLR2 у новорожденных основных групп, также было сопоставимо (39 (29,5-44,25) % против 41 (34,25- 63,75) % (p > 0,017) Полученные данные подтверждаются литературными источниками, в которых также отмечается снижение экспрессии TLR2 до 29-й недели ГВ.

выводы

В результате исследований установлено, что относительное содержание основных лимфоид-ных Т-клеток в группах недоношенных детей достоверно снижено в сравнении с группой доношенных новорожденных (за исключением cd^^^r^™^. По достижении ГВ в 28-31 неделю процентное содержание В-лимфоцитов и уровень TLR2 достигает значений доношенных детей, что свидетельствует об изначальной готовности к распознаванию потенциальных патогенов с целью дальнейшей презентации антигена клеткам адаптивного иммунитета.

фенотипические и функциональные характеристики лейкоцитов периферической крови и их микрочастиц при гестозе

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», отдел иммунологии, лаборатория межклеточных взаимодействий, г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Развитие патофизиологического процесса при гестозе сопровождается изменением состава основных популяций лейкоцитов в периферической крови и децидуальной оболочке. В литературе представлены разрозненные данные о феноти-пических характеристиках лейкоцитов периферической крови матери при гестозе, тогда как их функциональные свойства остаются практически не исследованными. Изменение функционального состояния лейкоцитов при гестозе может быть связано с различием в характеристиках микрочастиц клеток, присутствующих в периферической крови.

Целью работы явилось изучение характеристик лейкоцитов и их микрочастиц, выделенных из периферической крови женщин с беременностью, осложненной гестозом.

Материалы и методы исследования

Обследовано 422 женщины во время и вне беременности: здоровые небеременные женщины, соматически здоровые женщины с физиологически протекающей беременностью (38-39 недель) и беременные женщины с гестозом (38-39 недель). В работе была проведена оценка особенности адгезии и трансэндотелиальной миграции мононуклеа-ров периферической крови, которую выполняли in vitro с применением совместной инкубации моно-нуклеаров периферической крови и эндотелиаль-ных клеток линии Ea.Hy926. С использованием метода проточной цитофлюориметрии с помощью FACSCantoII (BD, США) проведена оценка экспрессии лейкоцитами периферической крови адгезионных молекул, рецепторов к хемокинам и ростовым факторам. Для проведения оценки функциональной активности NK-клеток мононуклеары периферической крови инкубировали в присутствии антител к CD 107a, 8 мкг/мл монензина, стандартного реагента для активации лейкоцитов и TRAIL в различных модификациях, с последующей оценкой экспрессии NK-клетками маркеров активации. Для анализа микрочастиц периферическую кровь последовательно центрифугировали при 2600g, 9900g, 19800g. Микрочастицы разводили в растворе Хенкса с 0,35 % бычьим сывороточным альбумином, обрабатывали антителами. Атомно-силовая микроскопия препаратов микрочастиц выполнена на сканирующем зондовом микроскопе Интегра Аура (NT-MDT,

Россия). Оценка влияния микрочастиц плазмы крови на функциональные свойства клеток проведена путем инкубации клеток линии THP-1 в присутствии микрочастиц в течение суток с последующей оценкой фенотипа клеток.

результаты исследования

Установлено, что гестоз по сравнению с физиологической беременностью сопровождается повышенной экспрессией CD18CD8+ Т-лимфоцитами (p < 0,05), CD1k NK-клетками (p < 0,05) и CD119 моноцитами (p < 0,05) периферической крови и повышенной функцией адгезии лимфоцитов и моноцитов in vitro как к интактным (p < 0,05), так и к активированным (p < 0,05) эндотелиальным клеткам линии Ea.Hy926. Установлено, что при гестозе по сравнению с физиологической беременностью снижена экспрессия CD107a NK-клетками после активации (p< 0,05). Установлено, что гестоз по сравнению с физиологической беременностью характеризуется присутствием в периферической крови повышенного количества TRAIL+ NK- клеток (p < 0,05). Выявленные фенотипические и функциональные характеристики лимфоцитов и моноцитов при гестозе могут определять их миграцию в деци-дуальную оболочку и их участие в развитии воспаления. Выявленные изменения экспрессии CD107a и TRAIL NK-клетками отражают происходящую при гестозе смену стратегии реализации цитоток-сических эффектов NK- клеток, а именно снижение способности реализовывать цитотоксический ответ с образованием гранзимов и перфорина и предрасположенностью NK-клеток индуцировать TRAIL-опосредованный апоптоз клеток-мишеней. Установлено повышенное количество микрочастиц с фенотипом CD45+CD16+CD56+ (p < 0,001) у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами, что может отражать гибель цитотоксических NK-клеток. При гестозе по сравнению с физиологической беременностью выявлено повышенное количество микрочастиц, образованных нейтрофилами и моноцитами (CD45+CD16+CD56) (p< 0,001). Показано, что гестоз сопровождается присутствием сниженного количества микрочастиц, образованных NK-клетками (CD45+CD16+CD56+) (p < 0,001). Вероятно, повышенное количество микрочастиц нейтрофилов и моноцитов является следствием развивающейся при гестозе воспалительной реакции,

а повышенное содержание микрочастиц NK-клеток связано с нарушением механизмов развития иммунологической толерантности, а именно дефектом в индукции гибели активированных NK-клеток. Установлено, что микрочастицы женщин с физиологической беременностью снижают экспрессию рецептора для IL-8 (p < 0,05) и повышают экспрессию адгезионных молекул CD18 (p < 0,05) и CD54 (p< 0,05) клетками линии THP-1. Микрочастицы женщин с гестозом по сравнению с микрочастицами женщин с физиологической беременностью повышают экспрессию CD181 (p < 0,05) клетками линии THP-1.

выводы

Гестоз по сравнению с физиологической беременностью характеризуется повышенной экс-

прессией отдельных адгезионных рецепторов и повышенной способностью лимфоцитов и моноцитов периферической крови к адгезии к активированным эндотелиальным клеткам линии Ea.Hy926, что определяет предрасположенность лимфоцитов и моноцитов к интенсификации миграции в децидуальную оболочку при гестозе. Развитие гестоза сопровождается увеличением количества микрочастиц плазмы крови, образованных нейтрофилами и моноцитами, что отражает развитие воспалительной реакции при данной патологии. Микрочастицы плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и с гестозом обладают разнонаправленными эффектами на клетки в условиях in vitro, что указывает на возможность существования регуляторной функции микрочастиц.

экспериментальная модель острого жирового гепатоза на беременных крысах

ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

Острый жировой гепатоз (ОЖГ) является одним из самых тяжелых осложнений беременности (1 на 13 000 родов), приводящих к высокой материнской и перинатальной смертности. Успех лечения определяется прежде всего своевременным распознаванием этого заболевания и ранним родоразрешением, а также совершенствованием методов интенсивной фармакотерапии.

В настоящее время существует около 20 моделей печеночной патологии. У животных наиболее близкие к человеку морфологические изменения паренхимы печени возникают в экспериментальных условиях при введении гепатотоксинов. Это наиболее эффективный способ индуцирования патологии печени у лабораторных животных.

К наиболее распространенным гепатотоксинам для создания моделей повреждения печени относятся: четыреххлористый углерод, ацетаминофен, ацетон, D-галактозамин гидрохлорид, этанол, а-нафтилизотиоцианат и др. Оральное, внутри-брюшинное, подкожное или ингаляционное введение этих гепатотоксинов приводит к острому, обратимому повреждению печени, дистрофическим изменениям печени, почек и других органов, поражению ЦНС.

В литературе также имеются данные о моделировании липемии, вызываемой введением препаратов тритон WR-1339 (тилоксапол) и поликса-мер-407 у мышей. Преимуществами этих моделей являются простота воспроизведения, низкая токсичность полимеров, дозозависимый эффект со-

единений при воспроизведении липемии разной степени выраженности.

Цель исследования: создать экспериментальную модель ОЖГ на беременных самках крыс.

материалы и методы исследования

Моделирование ОЖГ проводили на крысах линии Вистар на 15-18-й день беременности. Всего в эксперименте было использовано 24 самки крыс, из которых были сформированы две группы животных:

• контрольная группа (n = 8) получала с 15-го по 18-й день беременности инъекции растворителя (стерильная вода для приготовления лекарственных форм для инъекций);

• подопытная группа (n = 16) получала в те же сроки беременности инъекции препарата тритон WR-1339 (Sigma-Aldrich, США).

Ранее проведенные пилотные исследования показали, что стабильный гепатотоксический эффект наблюдается только в случае ежедневного назначения препарата в дозе не менее 300 мг/кг более 3 дней. Основываясь на этих данных, с целью моделирования ОЖГ животным подопытной группы внутрибрюшинно вводили препарат тритон WR-1339 в дозе 300 мг/кг ежедневно в течение 4 дней. О развитии токсического поражения печени судили по изменениям биохимических показателей крови. При биохимических исследованиях определяли 12 основных показателей: активность трансаминаз (АСТ, АЛТ), содержание желчных кислот, билирубина, активность

холинэстеразы, глутаматдегидрогеназы (ГлДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), концентрацию общего белка, мочевины, триглицеридов, холестерина, активность щелочной фосфатазы (ЩФ). На протяжении эксперимента животных обеих групп ежедневно осматривали, определяли массу тела для расчета дозы вводимого препарата и сравнительной оценки относительной массы печени. Эвтаназию всех животных осуществляли на 19-й день беременности. Далее готовили гистологические срезы толщиной 8-10 мкм. Препараты исследовали при помощи микроскопа (ув. ><400).

результаты исследования

За время эксперимента случаев гибели животных зафиксировано не было. Однако на фоне препарата в подопытной группе отмечались вялость и апатия животных. При биохимических исследованиях сыворотки крови определяли 12 основных показателей. Наиболее значительные изменения были отмечены для показателей липидного обмена — триглицеридов и холестерина, уровень которых вырос в 80 и 15 раз соответственно (р < 0,002 и 0,02; здесь и далее, если не указано иначе, критерий Манна-Уитни с поправками на множественные сравнения и на непрерывность). Также значительно увеличилась активность ЛДГ — в 5,4 раза (р < 0,002), концентрация желчных кислот и активность ГлДГ — в 3 раза (р < 0,001 и 0,05), АСТ — в 2 раза (р < 0,001), АЛТ — в 1,3 раза (р < 0,01). При этом наблюдалось снижение в сыворотке крови экспериментальных животных концентрации хо-линэстеразы и уровня общего белка (в 1,5 раза) (р < 0,001 и 0,002). Вместе с тем активность ЩФ, уровни билирубина и мочевины оставались без значимых изменений (р > 0,05).

При макроскопическом исследовании печень подопытных крыс была бледная, рыхлая, с оливковым оттенком и наличием вкраплений. При этом масса органа соответствовала результатам в контрольной группе (медианы в контрольной и подопытной группах составили 4,32 и 4,30 г на 100 г массы животного соответственно р = 1,00).

Гистологическое исследование образцов печени экспериментальной группы показало, что балочное строение сохранено лишь в половине исследуемых случаев — 50 % Дистрофические изменения гепатоцитов выявлены во всех исследуемых образцах. Паренхиматозная жировая дистрофия печени присутствовала в 44 % случаев. Выявлялись ожирение с некробиозом гепатоцитов и ожирение с мезенхимально-клеточной реакцией без перестройки дольковых структур печени. В 100 % случаев (у всех 16 животных) присутствовала жировая дистрофия (вероятность формирования жировой дистрофии выше 0,75 с р = 0,01, посчитано точным биномиальным критерием). При этом превалировала мелкокапельная и крупнокапельная жировая дистрофия, определяющаяся в 75 и 25 % случаев соответственно.

выводы

По совокупности результатов биохимических и гистологических исследований можно сделать вывод о том, что 4-дневное внутрибрюшинное введение беременным крысам (15-18-й день беременности) препарата тритон WR-1339 в дозе 300 мг/кг приводит к токсическому поражению печени по типу ОЖГ. Данная модель печеночной патологии может быть использована для проведения скрининга как вновь синтезированных, так и применяющихся в клинике фармакологических средств, обладающих гепатотропной активностью.

иммуногистохимическая верификация системы KISS 1/KISS 1R в органах плода человека

1 Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург, Россия;

2 ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

По результатам многочисленных исследований последнего десятилетия известно, что кис-спептины (КП) и их рецепторы (KISS1R) играют ключевую роль во многих физиологических процессах организма, таких как половое созревание, нормальное функционирование репродуктивной системы, секреция инсулина и пищевой статус, вазоконстрикция. Экспрессия кисспептинов и их рецепторов была выявлена в различных тканях организма, причем не только в центральных орга-

нах (гипофиз, гипоталамус), в которых изначально была определена их функция, но и в органах репродуктивной системы, поджелудочной железе, пищеводе, почках и др. До сих пор идет определение роли и значимости кисспептинов в периферических тканях и органах. Функциональная значимость и локализация системы KISS1/KISS1R при внутриутробном развитии до сих пор не изучена.

Цель исследования: выявление системы KISS1/KISS1R в органах плода человека на разных сроках развития (23-42 недели).

материалы и методы исследования

Объектом для исследования послужили образцы тканей и органов плодов (гипофиз, тимус, надпочечники, поджелудочная железа, аорта), полученные из архива отделения патоморфологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д О. Отта». Материал (n=9) был разделен на группы по срокам гестации: 23-27 недель (конец второго триместра), 28- 42 недели (третий триместр). Для иммуногистохими-ческого исследования использовали первичные моноклональные антитела к KISS1 (1 : 140, Abcam, Великобритания) и к KISS1R (1 : 350, Abcam). В качестве вторичных антител брали универсальный набор, содержащий биотинилированные кроличьи антимышиные иммуноглобулины, конъюгирован-ные с биотинилированной пероксидазой хрена (EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse, Dako, Дания). В качестве негативного контроля производилась ИГХ реакция без использования первичных антител. Визуализация реакции осуществлялась проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra, Leica Biosistem, Германия). Проводилось морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus BX46 (Olympus, Япония) и программного обеспечения Vidеotest Morphology 5.2 (Россия). Исследования проведены с использованием оборудования ресурсного центра Научного парка СПБГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Результаты исследования

Показано, что наибольший уровень экспрессии KISS1/KISS1R наблюдается в клетках аде-ногипофиза и материале коры надпочечников во всех группах. Также наблюдается значительный уровень экспрессии в ацинарных клетках поджелудочной железы, корковом веществе тимуса и эндотелиальной выстилке аорты, однако, статистически достоверных различий между группами не выявлено. Корреляция между геста-ционным возрастом и уровнем экспрессии кис-спептинов характерна лишь для материала тимуса (r=0,54, p < 0,05) и надпочечников r=0,48, p < 0,05).

выводы

Полученные данные свидетельствуют о том, что закладка системы KISS1/KISS1R, возможно, происходит во время первого триместра внутриутробного развития, когда наблюдается формирование основных органов и систем. Также отмечено усиление экспрессии кисспептинов в тимусе и коре надпочечников по мере увеличения геста-ционного возраста. Это может быть следствием того, что на 7-м месяце внутриутробного развития на надпочечники оказывается специфическое действие адренокортикотропного гормона, и начинают функционировать все звенья гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, в регуляции которой, как известно, принимают участие и кисспептины.

оценка параметров развития и реактивных свойств тканевых элементов плаценты при введении в организм наночастиц меди

Оренбургский государственный университет, г. Оренбург, Россия; Оренбургский государственный медицинский университет, г. Оренбург, Россия

Актуальность проблемы

Реализация инвазивно-трофического и регуля-торного потенциала трофобласта в связи с диффе-ренцировкой хориональных структур развивающейся плаценты обусловлена высокими уровнями ферментативной и цитокиновой активности сим-пластотрофобласта. Становление всего комплекса свойств селективного трансбарьерного обмена, а также взаимоотношений тканевых элементов, принадлежащих разным организмам (матери и плода), контролируется рядом цито- и гистогенетиче-ских факторов (развитие щеточной каймы, состав и целостность гликокаликса, экспрессия рецептор-ного аппарата, тканевая детерминация трофобласта и др.), а также достижением необходимых метаболических условий и синтезом группы регуляторов (ПЩФ, Р-ХГЧ, простациклины и др.). Медь, как эс-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

сенциальный элемент, в организме проявляет сродство к некоторым неметаллам (например, к сере) — компонентам органических молекул. Кроме того, медь входит в состав координационных соединений, в которых является комплексообразователем, а лигандами являются аминокислоты. Возможная биохимическая активность меди при увеличении ее концентрации в организме, очевидно, будет иметь патогномоничное значение. Получение нанострук-турированного порошка меди, как вещества с новыми физическими и химическими свойствами, актуализирует изучение его биотехнологических свойств. Влияние наночастиц меди (НМ) на плаценту на сегодняшний день не исследовано, в том числе в аспекте обозначенных выше проблем регуляции морфогенеза плаценты, ее метаболической и барьерной активности.

Цель исследования: определить диапазон эффективных маточно-плацентарных взаимоотношений с учетом верификации активного комплекса приспособительных механизмов становления структур хориона при введении в организм НМ в течение всего периода гестации в эксперименте.

Материалы и методы исследования

Сформировано две группы крыс Вистар: экспериментальная и контрольная (N1 = N2=35). Все мероприятия по работе с животными соответствовали Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985). Самкам опытной группы с первого дня беременности в бедренную группу мышц вводили инъекцию, содержащую взвесь НМ (0 103,0 ± 2,0 нм, покрытых оксидной пленкой толщиной 6,0 нм), в дозе 1 мг/кг. Инъекции делались каждые 6 дней. Взвесь готовили в ультразвуковой ванне. Вещество получено в Институте энергетических проблем химической физики РАН (Москва). Контрольным животным вводили физиологический раствор. Для гистологических исследований материал подвергли стандартной обработке. Серийные срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином. После морфо-метрии количественные данные обработали обычными методами статистики с уровнем значимости, не превышающим 5 %.

результаты исследования

Поступление в организм беременной самки НМ обусловило значимое отклонение морфогенеза плаценты от закономерного хода. Наблюдалось снижение объема тканевых процессов пролиферации и дифференцировки (в пределах всех диф-феронов), ослабление динамики формирования хориальных структур, прогрессивное нарастание деструктивно-атрофических явлений и нарушение гематоперфузии лабиринта.

Определено изменение параметров пространственно-объемного взаимоотношения элементов хориона: снижена площадь поперечного сечения балок, уменьшено количество терминальных ворсин, приходящихся на одну промежуточную дифференцированную ворсину, показан сравнительно низкий процент анастомозирующих балок. Так, диаметр наименьших балок равен

9,9 ± 0,4 мкм, в группе контроля — 19,4 ± 0,8 мкм (t=22,09; p < 0,001). По данным дисперсионного анализа (6,2 ± 0,6 и 30,5 ± 0,8 (контроль)) снижение диаметра балок стабильно во всем объеме лабиринта: F = 5,00 (p < 0,01). При этом объемная плотность развития хориональных структур в целом не превышает величины 33,7 ± 0,6 % (n = 6750), в контроле — 55,2 ± 0,6 % (n = 6750; t=25,75; p < 0,001). Следует подчеркнуть пластически-реактивную активность ворсин (балок). В лабиринтной зоне обнаруживаются симпла-стические почки, а также отмечено формирование терминальных ворсин, отрастающих от промежуточных. Очевидно, что такие процессы характеризуются неэффективностью адаптивного потенциала с учетом показанных параметров морфогенеза плаценты.

О недостаточности развития плацентарных структур свидетельствует наличие в лабиринтной зоне многочисленных островков незрелого трофобласта, без элементов сосудистого аппарата и стромы: объемная плотность составляет 10,4 ± 0,5 % (n = 6750), тогда как в контроле не более — 4,9 ± 0,3 % (n = 6750; t = 12,09; p< 0,001). Периферический трофобласт не демонстрирует инволютивной перестройки и к периоду завершения беременности все еще занимает значительный объем в спонгиозном компартменте плаценты. У отдельных животных незрелый трофобласт лабиринта настолько объемен, что канализируется, и через него начинает циркулировать материнская кровь.

На фоне атрофии ворсин расширены лакуны с материнской кровью. Причем динамика перфузии характеризуется заметным стазом.

выводы

Установлено токсическое поражение организма беременной самки. При этом определены структурные критерии становления плацентарной недостаточности и параметры нанотоксиколо-гии меди, характеризующие ее патогенетическое значение при введении в конкретной дозировке. Очевидно, что НМ нельзя использовать как объекты доставки лекарств или в диагностических целях у беременных животных.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (№ 14-36-00023).

исследования цитотоксического эффекта и стабильности квантовых точек селенида кадмия на трансформированных клЕткАх

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, г. Санкт-Петербург, Россия;

2 ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», г. Санкт-Петербург, Россия

Актуальность проблемы

В последнее десятилетие методы, основанные на использовании флуоресцентных меток (имму-нохимические тест-методы, визуализация тканей, отслеживание лекарств в организме и т. д.), получили огромную популярность. Таким образом, флуорофоры стали одним из важнейших инструментов исследования. Наиболее перспективными являются флуоресцентные полупроводниковые наночастицы — квантовые точки.

Цель исследования: оценить цитотоксиче-ский эффект квантовых точек селенида кадмия in vitro.

материалы и методы исследования

В работе изучена оценка цитотоксического эффекта и стабильности квантовых точек селени-да кадмия с оболочкой из L-цистеина. Квантовые точки (КТ) синтезированы в водной фазе и получены на кафедре микро- и наноэлектроники СПбГЭТУ ЛЭТИ. Методом инкубирования данных полупроводниковых наночастиц оценена ци-тотоксичность в культуре ZR-75-1 в разные промежутки времени.

Оценку цитотоксичности квантовых точек CdSe/L^ys проводили на культуре клеток постоянной клеточной линии ZR-75-1 (карцинома молочной железы). Для оценки цитотоксическо-го действия КТ селенида кадмия в клеточной линии ZR-75-1 после 1, 3, 18 и 24 часов инкубации определяли индукцию апоптоза клеток методом фиксированного окрашивания иодидом пропи-дия (PI), который специфически окрашивает ядра клеток с нарушенной структурой цитоплазматиче-ской мембраны.

В питательную среду добавляли образцы КТ по 1, 10 и 100 мкл на 1 мл ростовой среды, концентрация КТ составляла 175, 1,75, 17,5 мкМ/ мл соответственно. В качестве контроля к культурам клеток добавлялся фосфатно-солевой буфер (PBS) в тех же объемах. Окрашивание производилось PI (Biotium, США) объемом 100 мкл в конечной концентрации 5 мкг/мл на 15 мин в темноте.

результаты исследования

Для временных интервалов 1, 3, 18 часов характерно отсутствие цитотоксического эффекта. Через 24 часа около 4 % клеток в группе с введением КТ в концентрации 17,5 мкМ/мл накапливали PI. В двух других группах (с концентрациями наночастиц 175, 1,75 мкМ/мл соответственно) эти значения составляли 3 %, что статистически достоверно не отличалось от контроля, в котором число флуоресцирующих клеток составляло 2 на 100 исследованных (рис.1). Количество живых клеток в культуре ZR-75-1 на всех контрольных точках как в контроле, так и в экспериментальной группе было не меньше 97 %.

выводы

В экспериментах по оценке цитотоксичности на трансформированной клеточной линии установлено, что КТ CdSe/L-cyst в концентрациях, необходимых для окрашивания и мечения специфических молекул, не являются цитотоксичными для опухолевых клеток человека.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-15-00324).

Контроль 24 часа

175 нМ/мл 24 часа

1,75 мкМ/мл 24 часа

17,5 мкМ/мл 24 часа

Рис. 1. Окрашивание иодидом пропидия культуры клеток ZR-75-1, х400

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Корчагин А. О.

Текст научной работы на тему «Особенности проведения программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациентов с ВИЧ-инфекцией»