CC BY
70
© Т. Ю. САЛИНА, Т. И. мОРОзОвА, 2013 УДК 616.24-002.5-078.33
Т. Ю. Салина, Т. И. морозова
особенности продукции цитокинов у больных туберкулезом легких
Саратовский областной клинический противотуберкулезный диспансер, ГБОУ БПО Саратовский государственный медицинский университет
У 36 больных впервые выявленным, преимущественно инфильтративным туберкулезом легких изучали особенности спонтанной и стимулированной специфическими антигенами продукции наиболее значимых в патогенезе туберкулеза цитокинов ФНОа, ИФН-у, ИЛ-8. Продукцию ФНОа и ИФН-у изучали в культуре периферических мононуклеарных клеток с использованием антигена М. bovis (BCG), ИФН-у и ИЛ-8 - в культурах цельной гепаринизированной крови с применением антигенов H37Rv и ESAT-6. Установлено значительное угнетение стимулированной антигенами продукции ФНОа и ИФН-у у пациентов с тяжелыми, деструктивными и осложненными формами туберкулеза по сравнению с пациентами с ограниченным и благоприятно протекающим туберкулезом. Не выявлено различий в продукции ИЛ-8 у пациентов с разной степенью тяжести туберкулезного процесса.
Ключевые слова: цитокины, туберкулез легких
T. Yu. Salina, T.I. Morozova
THE CHARACTERISTICS OF PRODUCTION OF CYTOKINES IN PATIENTS WITH TUBERCULOSIS OF
LUNGS
The .sample of 36 patients with primarily diagnosed mostly infiltrative tuberculosis of lungs was used to investigate the characteristics of spontaneous and stimulated by specific antigens production of cytokines FNO-а, IFN-P, IL-8 playing the most significant role in pathogenesis of tuberculosis. The production ofFNO-а and IFN-y was analyzed in the culture ofperipheral mononuclear cells using antigen M.bovis (BCG). The cytokines IFN-y and IL-8 were analyzed in the cultures of whole heparinized blood using antigens H37Rv and ESAT-6. The significant inhibition of stimulated by antigens production of FNO-а and IFN-y in patients with severe, destructive and complicatedforms of tuberculosis as compared with to patients with limited andfavorably developing tuberculosis. The differences in production ofIL-8 in patients with different degree of severity of tuberculosis process are not revealed.
Key words: cytokine, tuberculosis of lungs
В противоинфекционной защите организма от внутриклеточной инфекции, в том числе туберкулеза, велика роль ключевых цитокинов, а именно фактора некроза опухолей а (ФНОа) и интерферона-у (ИФН-у), посредством которых регулируется характер, глубина и продолжительность воспаления и иммунного ответа организма [1, 3-6].
ФНОа имеет значение в формировании гранулем, индукции макрофагальной активности, ограничении размножающейся микобактериальной популяции [4, 5]. С нарушением продукции этого цитокина связывают развитие симптомов туберкулезной интоксикации (лихорадка, потеря массы тела), тканевые повреждения, формирование геморрагического некроза и другие изменения.
Роль ИФН-у рассматривается в контексте антиген-специфического Т-клеточного иммунитета [6]. Он стимулирует экспрессию антигенов тканевой совместимости классов I и II, усиливает цитотоксические реакции, опосредованные Т-лимфоцитами и естественными кил-лерными клетками [6], является принципиальным медиатором макрофагальной активности [7].
Дискутируется вопрос о роли интерлейкина-8 (ИЛ-8) в патогенезе туберкулезной инфекции. Традиционно ИЛ-8 считается потенциальным аттрактантом нейтро-филов, а нейтрофильный ответ при туберкулезе менее
Для корреспонденции:
Салина Татьяна Юрьевна, д-р мед. наук, доц. каф. фтизиатрии Адрес: 410056, Саратов, ул. Рабочая, 90/104-195 Телефон: (8452)51-40-65 E-mail: SalinaTU@rambler.ru
значим [4]. Однако в свете современных экспериментальных данных нейтрофильные гранулоциты рассматриваются не только как эффекторные клетки, но и как регулирующие иммунный ответ, и способные участвовать в продукции целого ряда цитокинов [2].
Изучение компонентов иммунного ответа макроорганизма приводит к лучшему пониманию патогенеза туберкулеза и позволяет искать новые подходы к предотвращению неблагоприятных исходов течения туберкулезной инфекции, которая у взрослых остается ведущей причиной смерти среди всех инфекций в мире.
Цель исследования - анализ особенностей продукции наиболее значимых цитокинов (ФНОа, ИФН-у, ИЛ-8) в периферической крови у больных с разным типом течения туберкулезного процесса.
Материалы и методы. Под наблюдением находились 36 больных с впервые выявленным, преимущественно инфильтративным туберкулезом легких. Мужчин было 20, женщин - 16 в возрасте от 19 до 65 лет. Пациенты были распределены на 2 группы в зависимости от степени тяжести туберкулезного процесса. 1-ю группу составили 14 больных с ограниченным по протяженности (1-2 сегмента) туберкулезным процессом и без симптомов интоксикации. Во 2-ю группу были включены 22 пациента с тяжелым, прогрессирующим и осложненным течением туберкулеза, с выраженным интоксикационным и бронхолегочным синдромом. Деструктивные изменения в легочной ткани установлены у пациентов 2-й группы в 81,8%, бактериовыделение в 86,4% случаев. 3-ю (контрольную) группу составили 15 здоровых лиц, положительно реагирующих на туберкулин.
У всех обследованных проводили определение спонтанной (нестимулированной) и индуцированной анти-
ИММУНОЛОГИЯ
геном М. bovis (BCG) продукции ФНОа и ИФН-у в су-пернатантах культур периферических мононуклеарных клеток, спонтанной и индуцированной специфическими антигенами продукции ИФН-у и ИЛ-8 в культурах цельной (неразделенной) гепаринизированной крови. Для приготовления супернатантов культур мононуклеарных клеток последние выделяли из периферической венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографин (р = 1,114 г/см, при 200g) и культивировали в среде RPMI (Flow Laboratories), содержащей 10% инактиви-рованной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина и по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина при температуре 37oC в СО2 - инкубаторе в течение 24 ч. В качестве специфического стимулятора использовали М. bovis (BCG) в рабочей концентрации 50 мкг/мл, предварительно культивированные на среде Левенштейна-Йенсена. Определение спонтанной и индуцированной антигенами продукции ИФН-у и ИЛ-8 проводили в супернатантах культур, где вместо периферических мононуклеарных клеток использовали неразделенную гепаринизированную кровь. Венозную кровь в объеме 25 мкл разводили в 10 раз стерильной средой RPMI. В качестве специфических стимуляторов для определения ИФН-у при исследовании цельной крови использовали антигены H37Rv и ESAT-6 в рабочей концентрации 15 и 10 мкг/мл соответственно, а для определения ИЛ-8 - антиген H37Rv, представляющий собой суспензию гамма-облученной (2,5 мегарад) биомассы вирулентного штамма микобактерий туберкулеза H37Rv. Биомассу обрабатывали с помощью ультразвукового диспергатора мощностью 100 Вт при 22 кгц в течение 40 циклов по 1 мин. Использовали супернатант после центрифугирования (18 тыс. об/мин). Технология получения антигена H37Rv разработана сотрудниками НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И. М. Сеченова. ESAT-6 - новый высокоспецифический пептид, продуцент метаболической активности микобактерий туберкулеза, синтезирующийся в раннюю и активную фазу инфекции, любезно предоставлен институтом биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.Н. Овчинникова. Оценку содержания ФНОа, ИФН-у и ИЛ-8 в супернатантах культур проводили методом иммунофер-ментного анализа (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск и ООО «Цитокин», Санкт-Петербург). Количественный учет результатов реакции оценивали на многоканальном иммуноферментном анализаторе «Лин-кей», Россия, при длине волны 450 нм. Концентрацию ФНОа, ИФН-у и ИЛ-8 определяли путем построения калибровочных кривых по результатам титрования реком-бинантного ФНОа, ИФН-у и ИЛ-8 в качестве стандартов и выражали в пикограммах на миллилитр. Рассчитывали Д - разность между величиной оптической плотности образца в ответ на стимулятор и уровнем спонтанной продукции (Д BCG, Д H37Rv, Д ESAT-6).
Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерных программ Microsoft Excel® и Statistica. Данные представлены в виде X ± m (где X -среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического) доверительного интервала, медианы. Сравнение двух независимых групп, подчиняющихся нормальному распределению проводили с помощью t-критерия Стью-дента, а не подчиняющихся нормальному распределению - с помощью теста Вилкоксона. В качестве критического уровня достоверности был принят критерий 0,05.
Результаты и обсуждение. Установлен (табл. 1) низкий уровень спонтанной продукции ИФН-у в супернатантах культур мононуклеарных клеток у пациентов с
тяжелым прогрессирующим течением туберкулезного процесса (2-я группа) - 22,5±2,5 пг/мл по сравнению с пациентами 1-й группы 41,5±8,6 пг/мл (p1-2 < 0,05) и здоровыми (3-я группа) - 34,0±3,5 пг/мл (p2-3 < 0,05). Аналогичные изменения в сторону уменьшения продукции ИФН-у у тяжелых больных были получены и при изучении индуцированной М. bovis (BCG) продукции ИФН-у. Среднее значение А БЦЖ у пациентов 2-й группы составило 37,7±33,4 пг/мл против 214,9±81,9 пг/мл у больных
1-й группы (p < 0,05) и здоровых - 206,0±46,6 пг/мл (p2-3 < 0,001). В то же время у тяжелых больных выявлена спонтанная гиперпродукция ФНОа, среднее значение которого составило 1555,3±12,6 пг/мл по сравнению с таковым у больных 1-й группы - 117,0±20,0 пг/мл (p,2 < 0,001) и здоровых - 173,0±49,0 пг/мл (p2-3 < 0,001). Не было установлено достоверных различий по уровню спонтанной продукции ФНОа у пациентов 1-й группы и здоровых. Однако при изучении индуцированой М. bovis (BCG) продукции ФНОа, выявлено достоверное ее снижение у пациентов 2-й группы (А БЦЖ) - 27,6±18,4 пг/мл против 285,7±3,1 пг/мл у больных 1-й группы (p < 0,001) и здоровых - 435,7±124,0 (p2-3 < 0,01).
При исследовании продукции ИФН-у в супернатантах цельной периферической крови установлены статистически значимые различия по уровню его спонтанной продукции. Нестимулированная продукция ИФН-у в 1-й группе составила 52,7±7,5 пг/мл против 93,2±15,1 пг/мл во 2-й группе; p < 0,05 (табл. 2). Также нашими исследованиями выявлено значительное угнетение индуцированной продукции ИФН-у в ответ на стимуляцию антигенами у тяжелых больных. Среднее значение А H37Rv во
2-й группе составило 10,9±3,8 пг/мл против 225,4±102,0 пг/мл в 1-й группе (p1-2 < 0,01). У 13 (59,1%) из 22 больных 2-й группы ответ иммунокомпетентных клеток на антиген H37Rv отсутствовал, в то время как в 1-й группе таких больных было только 2 (14,3%). Аналогичные изменения в сторону угнетения индуцированной продукции ИФН-у получены и при индукции антигеном ESAT-6, среднее значение А ESAT-6 составило 24,8±9,3 пг/мл во 2-й группе против 65,0±15,2 пг/мл в 1-й группе (p < 0,05). Нулевые значения прироста индуцированной про-
Таблица 1
Спонтанная и индуцированная антигеном M. bovis (BcG) продукция цитокинов (ФНОа и ИФН-у) периферическими моно-нуклеарными клетками крови у больных активным туберкулезом легких
Больные активным туберкулезом легких (n = 36) Здоровые 3-я группа (П = 15)
Показатель 1-я группа (n = 14) 2-я группа (n = 22)
Спонтанная про- 41,5±8,6 22,5±2,5 34,0±3,5
дукция ИФН-у, пг/мл (Р,_2 < 0,05) (Р2-3 < 0,05) (Л_3 > 0,05)
Индуцированная 214,9±81,9 37,7±33,4 206,0±46,6
М. bovis продукция ИФН-у (А (Pi_2 < 0,05) (Р2_з < 0,001) (Л_3 > 0,05)
БЦЖ), пг/мл
Спонтанная про- 117,0±20,0 1555,3±12,6 173,0±49,0
дукция ФНОа, пг/мл (p1-2 < 0,001) (Р2-3 < 0,001) (Л_3 > 0,05)
Индуцированная 285,7± 3,1 27,6±18,4 435,7±124
М. bovis продукция ФНОа (А (p1-2 < 0,001) (Р2-3 < 0,01) (Л_3 > 0,05)
БЦЖ), пг/мл
Таблица 2
Спонтанная и индуцированная антигенами Н37Ку и ESAT-6 продукция ИФН-у в супернатантах культур цельной крови у больных активным туберкулезом легких
Показатель Больные активным туберкулезом легких (n = 36)
1-я группа (n = 14) 2-я группа (n = 22)
Спонтанная продукция ИФН-у, пг/мл 52,7±7,5 (Л-2 < 0,05) 93,2±15,1
Индуцированная Н37Яу продукция ИФН-у (Д Н37Яу), пг/мл 225,4±102 (Р,-2 < 0,01) 10,9±3,8
Индуцированная ESAT-6 продукция ИФН-у (Д ESAT-6), пг/мл 65,0±15,2 (Р,-2 < 0,05) 24,8±9,3
дукции ИФН-у относительно спонтанной во 2-й группе установлены у 12 (54,5%) человек и у 3 (21,4%) в 1-й группе.
Спонтанная продукция ИЛ-8 обнаружена в супернатантах 24-часовых культур цельной крови у 25 (69,4%) из 36 больных активным туберкулезом и у 14 (93,3%) из 15 здоровых. Уровень ИЛ-8 имел большие индивидуальные колебания; у больных туберкулезом от 0 до 10 000 пг/мл (медиана 506) и от 0 до 8124 пг/мл у здоровых (медиана 1875); р > 0,05. Не выявлено достоверных различий спонтанной и индуцированной антигеном Н37^ продукции ИЛ-8 в зависимости от тяжести течения туберкулезного процесса. Спонтанная продукция ИЛ-8 у пациентов 1-й группы имела интервал колебаний от 0 до 8124 пг/мл (медиана 936), а во 2-й группе от 0 до 10 000 пг/мл (медиана 448); р > 0,05, индуцированная Д Н37^ продукция в 1-й группе имела интервал колебаний от 0 до 4064 (медиана 276) и во 2-й группе - от 0 до 9494 пг/мл (медиана 380); р > 0,05. Однако следует отметить, что у 5 пациентов 2-й группы с крайне тяжелым течением туберкулезного процесса, приведшим в дальнейшем к летальному исходу, наблюдалось значи-
тельное угнетение индуцированной продукции ИЛ-8 (у 4 пациентов она не определялась и у 1 составила 780 пг/мл), что, вероятно, следует рассматривать как проявление анергии в терминальном периоде туберкулезной инфекции.
Выводы. 1. У больных с тяжелым, прогрессирующим и осложненным течением туберкулеза наблюдается выраженное угнетение индуцированной антигеном BCG продукции ИФН-у и ФНОа в культурах периферических мононуклеарных клеток и значительное снижение продукции ИФН-у в ответ на специфические антигены (H37Rv ESAT-6) в цельной крови по сравнению с пациентами с благоприятно протекающим туберкулезом, что свидетельствует о снижении функциональной активности иммунокомпетентных клеток у тяжелых больных.
2. Продукция ИЛ-8 в супернатантах культур цельной периферической крови у больных туберкулезом имеет большой размах индивидуальных колебаний и не зависит от тяжести течения туберкулезного процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. -М.: Мир, 2000. - 592 с.
2. Швыдченко И. Н., Нестерова И. В., Синельникова Е. Ю. Цито-кинсекретирующая функция нейтрофильных гранулоцитов // Иммунология - 2005. - Т. 26, № 1. - С. 31-34.
3. BekkerL. G., Moreira A. L., BergtoldA. et al. Immunopathologic effects of tumor necrosis factor а in murine mycobacterial infection are dose dependent // Infect. Immunity. - 2000. - Vol. 68. - P. 6954-6961.
4. Crevel R., Ottenhoff N. M., Meer W. M. Innate Immunity to Mycobacterium tuberculosis // Clinical Microbiology Review. - 2002. -Vol. 15, N 2. - P. 294-309.
5. Flynn J. L., Goldstein M. M., Chan J. et al. Tumor necrosis factor-а is reguired in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice // Immunity. - 1995. - Vol. 2. - P. 561-572.
6. Flynn J. L., Chan J. Immunology of tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. - 2001. - Vol. 19. - P. 93-129.
7. OkamuraH., Kashiwamura S., TsutsutiH. et al. Regulation of inter-feron-gamma production by IL-12 and IL-18 // Curr. Opin. Immunol. - 1998. - Vol. 10. - P. 259-264.
Поступила 16.05.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.151.514-06:616.36-002-022]-078.33
С. В. Игнатьев, Е. П. Ивашкина, С. И. Ворожцова, Е. Л. Назарова, Т. Г. Градобоева, Т. А. Чернова
подклассы юс у больных ингибиторной формой гемофилии, инфицированных и не инфицированных вирусами гепатитов
ФМБА Кировский НИИ гематологии и переливания крови
В клинике ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России обследованы 102 больных гемофилией, инфицированных и не инфицированных вирусами гепатитов. При ингибиторной форме гемофилии выявили достоверное повышение уровня IgG за счет 2-го подкласса, а при неингибиторной форме - значимое повышение содержания IgG за счет 1, 2 и 3-го подклассов при сопутствующем хроническом гепатите. Значимых различий уровня антител к VIII и IX факторам между этими группами не обнаружили.
Ключевые слова: подклассы IgG, гемофилия, вирусы гепатитов
