CC BY
115
УДК 616.24-002.5-078.33
Л.И. Мордовская М.А. Владимирский 2, В.А. Аксенова 2
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КАК КРИТЕРИЙ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ПРОЦЕССА У ИНФИЦИРОВАННЫХ МИКОБАКТЕРИЯМИ ТУБЕРКУЛЕЗА И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
1НПЦ «Фтизиатрия» (Якутск) 2 НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва)
В исследование включили 23 пациентов, инфицированных МБТв течение не более 2-хлет и 31 больного с впервые выявленным туберкулезом, легких. Обследовано 30 мальчиков и. 24 девочки от. 12 до 17 лет.. Иммунологическое исследование включало в себя, определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови, продукции мононуклеарами периферической крови, интерферона-у и. перфорина до антибактериальной терапии. Было установлено, что при. активном, туберкулезном, процессе субпопуляция гамма-дельта Т-лимфоцитов значительно меньше, по сравнению с МБТ инфицированными пациентами. При. анализе индукции ИФН-у антигенами PPD и. ESAT-6 субпопуляция гамма-дельта интерферонпродуцирующих Т-клеток и. проценты, цитотоксических (CD8) Т-лимфоцитов, продуцирующих перфорин, у больных туберкулезом, легких были, выше, чем. у инфицированных МБТ детей и. подростков. Полученные результаты, свидетельствуют, о возможности, дифференцирования латентной туберкулезной инфекции от. активного процесса при. анализе субпопуляции гамма-дельта Т-клеток и. антиген-индуцированной популяции перфорин продуцирующих цитотоксических Т-лимфоцитов.
Ключевые слова: дети и подростки, туберкулезная инфекция, микобактериальные антигены, иммунофено-типирование Т-лимфоцитов
IMMUNOLOGICAL DATA AS THE EVALUATION CRITERION FOR ACTIVITY OF TUBERCULOSIS PROCESS IN CHILDREN AND ADOLESCENTS WITH M. TUBERCULOSIS INFECTION AND PULMONARY TUBERCULOSIS DISEASE
L.I. Mordovskaia V.A. Aksenova 2, M.A. Vladimirskiy 2
1 Research-Practice Center “Phthisiatry”, Yakutsk 2 Research Institute of Phthisiopulmonology named after I.M. Sechenov of First Moscow State Medical
University, Moscow
23 patients with less then 2 years back history of recent MBT infection and 31 patients with newly identified, pulmonary tuberculosis were included, to the study. 30 boys and. 24 girls aged 12 to 17 have been examined. Immunological study included, determination, of the composition, of peripheral blood lymphocyte populations, peripheral blood mononuclear cells interferon-gamma and. perforin production, before the start of antibacterial therapy. Gamma/delta T-cell subpopulation, was found, to be significantly smaller in active tuberculosis process, compared, to subpopulations of the patients with. MTB infection. Analysis of the IFN-gamma induced by PPD and. ESAT-6 antigens showed, that both the subpopulations of IFN-producing gamma/delta T-cells and perforin-producing cytotoxic (CD8) Т-cell percentages were higher in patients with, active tuberculosis, then in children and. adolescents with. MBT infection. The study findings give evidence on the possibility of differentiating between latent tuberculosis infection and active disease in the course of analyses of gamma/delta T-cell subpopulations and. antigen-induced, perforin-producing cytotoxic T-cell populations.
Key words: children, adolescents, tuberculosis infection, mycobacterial antigens, T-cell immunophenotyping
Гамма-дельта Т-клетки (CD3+y8+) — важная субпопуляция клеток, ответственная за угнетение роста микобактерий туберкулеза (МБТ) в макрофагах (врожденный и адаптивный иммунитет). Клоны сенсибилизированных к МБТ у8-Т-лимфоцитов вырабатывают гамма — интерферон (ИФН-у), фактор некроза опухолей (ФНО-а), интерлейкины: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10, т.е. группу цитокинов, аналогичных секретируемым aP-T-клетками, кроме того, они способны лизировать клетки, инфицированные МБТ [1—4].
Т-клетки способны вырабатывать молекулы, действующие на микобактерии напрямую: в тест-системе in vitro было показано, что Т-лимфоциты CD8+человека, синтезирующие гранулизин и перфорин, обладают бактерицидной активностью
в отношении МБТ [3]. Противомикробный эффект гранулизина может обеспечиваться за счет активности перфорина, усиливающего эндоцитоз макрофагов или проделывающего поры в мембране макрофагов, в которых находятся микобактерии. CD8+ Т-лимфоциты, способные лизировать инфицированные микобактериями макрофаги с помощью лизирующих белков — перфорина и гран-зимов, также могут синтезировать ИФН-у [6, 7, 8].
Целью работы явилось сравнение содержания Т-лимфоцитов (CD3 + ), гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3+y8 + ), интерферон-гамма продуцирующих (CD3+ ИФН-у + ) и гамма-дельта интерферон-гамма продуцирующих (CD3 + CDy8 + ИФН-y+) Т-лимфоцитов, перфорин продуцирующих Т-лимфоцитов (CD3+ перфо-
рин+), содержания CD3 + CD8 + и перфорин продуцирующих (CD8 + перфорин+) Т-лимфоцитов у инфицированных МБТ и с туберкулезом легких детей и подростков.
МЕТОДИКА
Обследованы 23 пациента, инфицированных МБТ в течение не более 2 лет и 31 больной с впервые выявленным туберкулезом легких от 12 до 17 лет.
Иммунологическое исследование включало в себя определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови, продукции моно-нуклеарами периферической крови интерферона-у (ИФН-у) до антибактериальной терапии.
Образцы периферической венозной крови получали из локтевой вены утром натощак, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (10 ед. на 1 мл крови). Кровь разводили 1:1 в среде RPMI-1640 (Sigma). К 1 мл разведенной крови добавляли по 10 мкл раствора антигена (туберкулин PPD, ESAT-6 и/или CFP-I0) или стерильного физиологического раствора. В отдельных пробах лейкоциты активировали в присутствии 10 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА, Sigma) и 1 мкг ио-номицина (Sigma). Для предупреждения секреции ИФН-у использовали ингибитор аппарата Гольджи брефельдин А (BD GolgiPlug) 10 мгк/мл. Пробы инкубировали 5 ч при 37 °С. Эритроциты лизиро-вали в растворе BD PharmLyse (Becton Dickinson). Определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови (CD3 + , CD3 + ИФН-у+, CD3+y8 + , CD3 + CDy8+ИФН-y+, CD3+перфорин + , CD3 + CD8 + , CD8+перфорин+) проводилось с использованием моноклональных антител фирмы «Becton Dickinson» согласно инструкции производителя. Для фиксации и пермеабилизации клеток использовали набор BD Cytofix/Cytoperm Fixation/ Permeabilization Solution Kit (Becton Dickinson). Анализ связывания антител с клетками проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems), используя программное обеспечение CELL QUEST.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общее количество Т-лимфоцитов у инфицированных МБТ и больных туберкулезом детей и подростков достоверно не отличались (71,2 ± 1,5 % и 68,6 ± 1,9 %, соответственно). Количество интер-ферон-продуцирующих CD3+ ИФН-у+ лимфоцитов у больных по всем критериям: в контроле, с анти-
генами PPD и ESAT-6 (0,33 ± 0,1 %, 0,64 ± 0,1 %, 0,66 ± 0,1 %, соответственно) было достоверно выше (р<0,05), чем у инфицированных МБТ детей и подростков (0,12 ± 0,02 %, 0,26 ± 0,03 % и
0,35 ± 0,1 %, соответственно). Количество CD3+y8+ клеток у больных туберкулезом легких было достоверно ниже, чем у инфицированных МБТ пациентов (2,53 ± 0,3 % и 4,93 ± 0,8 %, соответственно).
Было установлено, что при активном туберкулезном процессе субпопуляция гамма-дельта Т-лимфоцитов значительно меньше, по сравнению с МБТ инфицированными пациентами. Число этих клеток не зависит от инкубации в присутствии изучаемых антигенов PPD и ESAT-6.
При туберкулезном инфицировании увеличивается приток гамма-дельта Т-клеток из костного мозга в кровоток. Однако при развитии активной туберкулезной инфекции число гамма-дельта Т-лимфоцитов в периферической крови уменьшается, что связывается с их миграцией в зоны специфического воспаления, в том числе в легкие, где они осуществляют свою эффекторную антимикробную и противовирусную функцию [1, 2, 3, 5].
При анализе индукции ИФН-у антигенами РРБ и ESAT-6 субпопуляция гамма-дельта интерферон-продуцирующих Т-клеток у больных туберкулезом легких была выше, чем у инфицированных МБТ детей и подростков (табл. 1).
Проценты Т-лимфоцитов, продуцирующих перфорин (CD3 + Per+) у инфицированных МБТ детей (1,68 ± 0,52) и больных туберкулезом легких (2,21 ± 1,1) значимо не отличались. Проценты перфорин продуцирующих Т-клеток в образцах крови, инкубированных с антигенами PPD и ESAT-6 были выше, чем в контроле без индукции антигенами в обеих группах; достоверные различия — с антигеном ESAT-6.
При анализе субпопуляции цитотоксических CD8 + , продуцирующих перфорин, которые рассматриваются как важная субпопуляция клеток, обеспечивающих цитотоксический эффект в отношении инфицированных микобактериями макрофагов, а также прямой микробицидный эффект, было установлено, что в неиндуцированных антигенами образцах крови, несмотря на большее число этих клеток в группе больных, достоверных различий не показано.
Результаты изучения процентного содержания CD8+Т-клеток, продуцирующих перфорин (CD8+Per+) показаны в табл. 2.
Таблица 1
Процент гамма-дельта интерферон-продуцирующих Т-клеток (CD3+y5+ИФН-y+) при индукции антигенами МБТ PPD и ESAT-6 у инфицированных МБТ и больных туберкулезом легких пациентов
Пациенты CD3+y8^H-y+ %
к PPD ESAT-6
инфицированные МБТ 1,55 ± 0,3 3,8 ± 1,2 4,5 ± 1,5
больные туберкулезом легких 4,2 ± 0,8 9,5 ± 1,0 8,8 ± 0,7
P p < 0,05 р < 0,001 p < 0,05
Таблица 2
Процентное содержание CD8 Т-клеток, продуцирующих перфорин (CD8+Per+)
Пациенты CD8+Per+ %
к PPD ESAT-6
Инфицированные МБТ 2,73 ± 0,81 5,02 ± 1,34 4,85 ± 0,62
Больные туберкулезом легких 3,78 ± 1,54 7,91 ± 1,85 9,81 ± 1,74
P p > 0,05 p > 0,05 p < 0,05
Значительное увеличение числа CD8 + Per + клеток наблюдается только при индукции антигеном ESAT-6.
Для анализа количества перфорин продуцирующих Т-лимфоцитов CD3 + Per+ и CD8 + Per + , индуцированных антигенами PPD и ESAT-6, мы из уровня процентного числа CD3+Per+ и CD8+Per+ клеток в индуцированных образцах вычитали число клеток в контроле (без антигена). При индукции обоими антигенами PPD и ESAT-6 проценты цито-токсических (CD8) Т-лимфоцитов, продуцирующих перфорин, были значительно выше в группе больных активным туберкулезом легких, чем в группе инфицированных МБТ пациентов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение метода иммунофенотипирова-ния Т-лимфоцитов, в том числе субпопуляции гамма-дельта Т-клеток и антиген-индуцированной популяции перфорин продуцирующих цитотокси-ческих Т-лимфоцитов открывает дополнительные возможности оценки специфического иммунного ответа и дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dieli F. et al. Granulysin-dependent killing of intracellular and extracellular Mycobacterium tuberculosis by Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes // J. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 184, N 8. - P. 1082-1085.
2. Dodd J. et al. Pulmonary V gamma 4+ gamma delta T cells have proinflammatory and antiviral effects in viral lung disease // J. Immunol. — 2009. — Vol. 182, N 2. - P. 1174-1181.
3. Ferrero E. et al. Macrophages exposed to Mycobacterium tuberculosis release chemokines able to recruit selected leucocyte subpopulations: focus on gammadelta cells // Immunology. — 2003. — Vol. 108, N 3. — P. 365 — 374.
4. Keane J. et al. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor-alphs neutralizing agent // N. Engl. J. Med. — 2001. — Vol. 345. — P. 1098—1104.
5. Kirby A.C. et al. Evidence for the involvement of lung-specific gammadelta T cell subsets in local responses to Streptococcus pneumoniae infection // Eur. J. Immunol. — 2007. — Vol. 37, N 12. — P. 3404 — 3413.
6. Lalvani A. et al. Human cytolytic and interferon-gamma-secreting CD8 + T lymphocytes specific for Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 1998. — Vol. 95, N 1. — P. 270 — 275.
7. Woodworth J.S. Wu Y., Behar S.M.J. Mycobacterium tuberculosis-specific CD8+ T cells require perforin to kill target cells and provide protection in vivo // Immunol. — 2008. — Vol. 181, N 12. — P. 8595 — 8603.
8. Wu X. et al. Recombinant early secreted antigen target 6 protein as a skin test antigen for the specific detection of Mycobacterium tuberculosis infection // Clin. Exp. Immunol. — 2008. — Vol. 152, N 1. — P. 81—87.
Сведения об авторах
Мордовская Лариса Ивановна - к.м.н., с.н.с. ГУ НПЦ «Фтизиатрия» МЗ РС (Я) (677000, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Петра Алексеева, 93; e-mail: limordovskaya @mail.ru)
Аксенова Валентина Александровна - д.м.н., проф., гл. внештатный фтизиопедиатр РФ, руководитель лаборатории по профилактике, диагностике и лечению туберкулеза у детей и подростков НИИ фтизиопульмонологии Первого МгМу им. И.М. Сеченова, г Москва
Владимирский Михаил Александрович - д.м.н., профессор, руководитель лаборатории молекулярной диагностики НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, г. Москва
