CC BY
29
МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ
© Коллектив авторов, 2009
Л.И. Мордовская', В.А. Аксенова', М.А. Владимирский', Е.И. Аксенова3,
Е.Е. Ефремов2, Т.Н. Власик2
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ИНДУКЦИИ ИНТЕРФЕРОНА у КЛЕТКАМИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ IN VITRO В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
'НИИ фтизиопульмонологии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава; 2Российский кардиологический научный центр; 3НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея, Москва
Ежегодно число впервые инфицированных микобактериями туберкулеза детей и подростков в России составляет 1,3% всего детского населения. Внутрикожная проба с туберкулином (проба Манту) остается основным методом выявления туберкулезной инфекции среди детей и подростков. Однако при массовой вакцинации и ревакцинации дифференцирование инфекционной от поствакцинной аллергии связано с серьезными трудностями. Работа представляет результаты применения разработанной авторами российской тест-системы для определения туберкулезного инфицирования и дифференцирования его от поствакцинной БЦЖ-аллергии на основе количественного анализа индукции интерферона у в образцах цельной крови, инкубированных в течение 20—24 ч в присутствии туберкулина PPD и специфического для микобактерий туберкулеза рекомбинантного антигена ESAT-6. Чувствительность определения туберкулезного инфицирования составляет 94,2% при 100% специфичности.
Ключевые слова: туберкулез, детское население, иммунный ответ, интерферон у, рекомбинантные антигены.
Yearly number of children and adolescents in Russia infected by M. tuberculosis for the first time is 1,3% of children population. Tuberculin skin test (Mantoux test) is the main method of tuberculous infection diagnosis in children and adolescents. However differentiation of infection and postvaccinal allergy is rather difficult because of mass vaccination and revaccination. Authors of present study outworked Russian test-system for determination of tuberculous contamination and its differentiation from postvaccinal BCG- allergy based of quantitative analysis of interferon y induction in whole blood specimens incubated during 20-24 h in presence of PPD tuberculin and recombinant ESAT-6 antigen, specific for M. tuberculosis. Results of this method usage showed its 94,2% sensitivity and 100% specificity.
Key words: tuberculosis, children population, immune response, interferon y, recombinant antigens.
Число детей, впервые инфицированных микобактериями туберкулеза (МБТ), ежегодно составляет около 1,3 % всего детского населения страны [1]. Туберкулинодиагностика по-прежнему остается основным методом раннего выявления туберкулеза и формирования групп риска по заболеванию туберкулезом у детей [2]. Инфицированность МБТ определяется при конверсии («вираже») кожной туберкулиновой пробы Манту (ПМ) (переход результата туберкулинового кожного теста от отрицательного к положительному), которая должна
проводиться детям ежегодно. К 14 годам около 30% детского населения (всего 1 млн 300 тыс чел.) становятся инфицированными МБТ по результатам туберкулиновых проб. Однако эффективность этого метода диагностики первичной туберкулезной инфекции у детей недостаточна в связи с относительно низкой специфичностью ПМ. На каждые 1000 впервые инфицированных детей и подростков заболевает туберкулезом 12 детей и 100 подростков, что свидетельствует о поздней диагностике туберкулеза у части детей (особенно у подрост-
Контактная информация
Мордовская Лариса Ивановна - к. м. н., НИИ фтизиопульмонологии ГОУ ВПО ММА
им. И.М. Сеченова Росздрава
Адрес: 127994, г. Москва, ул. Достоевского, 4
Тел.: (495) 631-33-14, E-mail: limordovskaya@mail.ru
Статья поступила 28.04.09, принята к печати 10.06.09
ков), о запоздалом выявлении виража туберкулиновой пробы [1].
В условиях массовой вакцинации БЦЖ (92-95% всех новорожденных) и ревакцинации в дошкольном и препубертатном возрастах довольно сложно достоверно установить уровень инфи-цированности детей МБТ, отличить поствакцинную аллергию, которая часто сохраняется в течение ряда лет, от инфекционной.
В связи с этим диагностика туберкулезной инфекции у детей, в том числе дифференцирование туберкулезного инфицирования детей от поствакцинной туберкулиновой аллергии, является одной из наиболее актуальных проблем детской фтизиатрии. Для специфической диагностики туберкулезной инфекции у детей, в отсутствие выраженных рентгенологических изменений, необходимо использовать новые методы, которые должны быть неинвазивными и не аллергизирующими.
В последние годы в странах Европы и США тест-системы QuantiFERON-TB-Gold и Quanti FERON-TB-Gold In Tube, основанные на измерении иммунного ответа Т-лимфоцитов на микобак-териальные антигены, выраженного продукцией интерферона у (ИФНу) в 24-часовой культуре цельной крови [3-5], рассматриваются в качестве тестов для определения туберкулезной инфекции. В этих тест-системах в качестве индукторов ИФНу используются полученные генно-инженерным путем специфические для МБТ антигены: ESAT-6 (ранний секретируемый антиген), CFP-10 (белок клеточного фильтрата) и неспецифический стимулятор фитогемагглютинин. Эти антигены отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма M. bovis (BCG) и большинства нетуберкулезных микобактерий. В связи со строгой специфичностью рекомбинантных антигенов предварительная вакцинация БЦЖ не оказывает значительного влияния на результаты индукции ИФНу in vitro. Ряд исследователей отмечает важные преимущества этого метода по сравнению с кожной туберкулиновой пробой.
При использовании рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10 этот тест был положительным при активной туберкулезной инфекции в 89% случаев, но отрицательным у БЦЖ-вакцини-рованных с минимальным риском туберкулезного контакта; специфичность - 98% [ 5].
Основной целью нашей работы явилось изучение уровня индукции ИФНу клетками цельной крови in vitro в присутствии специфического антигена туберкулезного возбудителя у детей и подростков при первичной туберкулезной инфекции в сравнении с поствакцинной БЦЖ-аллергией.
Материалы и методы исследования
Обследованы 148 детей и подростков в возрасте от 1 до 14 лет, проходивших обследование и лечение в детском противотуберкулезном диспансере
г. Якутска и НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова с установленными диагнозами: конверсия («вираж») туберкулиновой пробы - 52 пациента; поствакцинная аллергия - 40 пациентов; туберкулез внутригрудных лимфатических узлов -25 пациентов. Обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной ПМ.
Поствакцинную аллергию, как и «вираж» туберкулиновой пробы устанавливали на основании данных о вакцинации, ревакцинации БЦЖ, динамики ПМ и эпидемиологического анализа. Для исследования были с согласия родителей или при проведении биохимических исследований взяты образцы по 3,0 мл крови с гепарином (10 ед/мл).
Образцы крови были разлиты по 1 мл в 3 различные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и две опытные пробы, в которые вносили по 10 мкл туберкулина PPD (сухой очищенный туберкулин производства С-Петербургского НИИ вакцин и сывороток) и специфический рекомбинантный антиген ESAT-6, полученный одним из авторов в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея РАМН. Ампулу сухого очищенного туберкулина разводили 0,6 мл дистиллированной воды, что соответствовало концентрации по белку 1 мг/мл. Антиген ESAT-6, массой 32 кДа, полученный методом генной инженерии, содержал помимо специфического пептида 6 кДа целлюлозу связывающий домен. Конечная концентрация обоих антигенов по белку составляла 10 мкг в мл крови. Образцы крови в стерильных пробирках объемом 5 мл с герметично закрывающимися крышками инкубировали при 37 0С в течение 20-24 ч. На следующий день отбирали по 200 мкл образцов плазмы, в которых определяли концентрацию ИФНу с помощью разработанной нами иммуно-ферментной тест-системы.
Для иммуноферментного анализа использовали два моноклональных антитела к различных детерминантам ИФНу: иммобилизованные в лунках планшета и детектирующие антитела, меченные биотином. ИФНу, связанный с помощью первых антител, в лунках планшета выявляли с помощью вторых - биотин-меченных антител и ферментного коньюгата - стрептадивин-перокси-дазы. Для определения концентрации ИФНу в образцах плазмы строили калибровочную кривую на основании измерения оптической плотности при 450 нм в лунках стандартного ИФНу с двукратным разведением от 280 до 8,75 пг/мл. Чувствительность анализа - 10 пкг/мл.
Для статистической обработки полученных результатов использовали программу SAS с помощью параметрических и непараметрических методов анализа. Определяли среднюю величину, стандартное отклонение (дисперсию), медиану и межквартильный (25-75%) уровень результатов. Достоверность различий в изучаемых группах анализировали по критерию Вилкоксона.
Результаты и их обсуждение
Результаты анализа индукции ИФНу антигенами МБТ - неспецифическим туберкулином PPD и специфическим рекомбинантным антигеном
Л.И. Мордовская, В.А. Аксенова, М.А. Владимирский и др.
45
ЕЯАТ-6 при обследовании детей с отрицательной ПМ, поствакцинной аллергией и впервые инфицированных («вираж» ПМ) и туберкулез внутриг-рудных лимфоузлов представлены в таблице.
Индукция ИФНу туберкулином PPD у детей с конверсией («вираж») туберкулиновой пробы значительно выше (р<0,001), чем у детей с поствакцинной БЦЖ-аллергией. Однако в связи с большой вариабельностью получаемых результатов при использовании туберкулина PPD дифференцировать конверсию туберкулиновой пробы, т.е. первичное тубинфицирование, от поствакцинной БЦЖ аллергии невозможно.
При использовании специфического рекомби-нантного антигена ЕЯАТ-6 различия в индукции ИФНу у пациентов с конверсией ПМ и у детей с поствакцинной аллергией не только резко отличаются, но и пригодны для индивидуального дифференцирования. Для индивидуальной оценки наличия туберкулезного инфицирования был принят пороговый критерий уровня индукции ИФНу более 70 пг/мл. Из 40 детей с клинически установленной поствакцинной аллергией все результаты индукции ИФНу были ниже 70 пг/мл. При «вираже» туберкулиновой пробы из 52 обследованных детей лишь в 3 случаях уровень индукции ИФНу был ниже порогового критерия. У детей с туберкулезом внутригрудных лимфоузлов, который рассматривается как первичная туберкулезная инфекция, индукция ИФНу как с туберкулином PPD, так и с использованием специфического ЕЯАТ-6 не отличалась от результатов индукции ИФНу у детей с конверсией ПМ.
При статистическом анализе зависимости между величиной индукции ИФНу и размером ПМ у 50 впервые инфицированных детей коэффициент корреляции был низким - 0,3.
Однако при сравнении двух групп детей с размером папулы 5-9 мм (п=15) и 10-16 мм (п=35), различия в уровнях индукции ИФНу (средние ве-
личины ± стандартное отклонение) для этих групп при использовании специфического реком-бинантного антигена ESAT-6 были значимыми, составляя 254±228 и 446±314 пг/мл соответственно; р=0,02. В то же время различия в этих группах при использовании для индукции ИФНу туберкулина PPD не были значимыми.
Методы анализа индукции ИФНу антигенами МБТ, обозначаемые в англоязычной литературе аббревиатурой IGRA (interferon gamma release assay) и наборы реагентов QuantiFERON-TB-Gold [3, 5-8] и T-SPOT.TB [8], в которых используются рекомбинантные антигены ESAT-6 и CFP-10, являются предметом значительного числа исследований, посвященных в основном определению латентной туберкулезной инфекции. В этих исследованиях и при сравнении кожного туберкулинового теста даже при использовании в качестве положительного результата пробы с 10 мм были получены результаты, демонстрирующие намного более высокую специфичность метода индукции ИФНу с использованием специфичных для МБТ антигенов по сравнению с кожным тестом. При проведении исследования индукции ИФНу реком-бинантными специфическими антигенами у школьников с положительным кожным тестом лишь 9% из них имели положительный результат в тесте с индукцией ИФНу, но именно в этой группе была отмечена вероятность контактов с больными туберкулезом. Основная часть положительных реакций на туберкулин у школьников, по данным авторов из Норвегии, где заболеваемость туберкулезом низкая, связана с вакцинацией БЦЖ [7].
Большой интерес представляет эта технология для диагностики туберкулеза у детей, в частности, для более точного анализа вспышки туберкулезной инфекции в школьном коллективе [9, 10], а также для диагностики перинатального туберкулеза [11]. Альтернативная тест-система T-SPOT.TB,
Таблица
Индукция ИФНу антигенами МБТ в образцах крови детей с поствакцинной аллергией и детей с первичной туберкулезной инфекцией
Группы обследованных Диагноз Кол-во лиц Концентрация ИНФу, пг/мл
PPD р (критерий Вилкоксона) ESAT-6 р (критерий Вилкоксона)
1-я Туберкулин-отрицательные здоровые 31 85 (48-181) р1-2<0,001 0 (0- 0) р1-2 -н.д.
2-я Поствакцинная БЦЖ-аллергия 40 282 (208-440) р2-3<0,001 0(0-0) р2-3<0,001
3-я Конверсия ПМ -«вираж» 52 552 (338-862) р3-б<0,001 351 (152-537) р3-6<0,001
4-я Туберкулез внутригрудных лимфоузлов 25 624 (323-1033) р3-4 - н.д. 377 (156-791) р3-4 - н.д.
основанная на измерении количества Т-лимфоци-тов, продуцирующих ИФНу после индукции специфическими антигенами, по данным ряда авторов, является несколько более чувствительной, но менее специфичной [8].
Большинство исследователей отмечает следующие преимущества метода индукции ИФНу в образцах цельной крови с использованием специфических антигенов по сравнению с традиционным кожным туберкулиновым тестом: 1) метод не связан с введением биологического материала в организм ребенка и не приводит к дополнительной сенсибилизации; 2) новый тест может повторно проводиться в короткие промежутки времени; 3) не требует повторного посещения пациентом медицинского учреждения; 4) является существенно более объективным в методическом отношении.
В разработанной нами тест-системе, в отличие от тест-системы QuantiFERON-TB-Gold, в которой для положительного контроля индукции ИФНу используют неспецифический стимулятор фитоге-магглютинин, в соответствующих тестовых инкубационных пробирках используется туберкулин PPD и специфический рекомбинантный антиген.
Такое решение обусловлено тем, что в связи с всеобщим вакцинированием БЦЖ в нашей стране применение туберкулина может служить в качестве положительного контроля, а также быть дополнительным критерием определения поствакцинной БЦЖ-аллергии.
Выводы
1. Метод количественного определения индукции ИФНу в образцах цельной крови in vitro при использовании специфического рекомбинантного антигена ESAT-6 позволяет определить первичное туберкулезное инфицирование у детей и подростков с чувствительностью 94,2% и дифференцировать его от поствакцинной БЦЖ-аллергии с высокой специфичностью. Отрицательный уровень индукции ИФНу с антигеном ESAT-6 при положительной индукции с туберкулином PPD подтверждает поствакцинную БЦЖ-аллергию.
2. Величина индукции ИФНу в образцах цельной крови с антигеном ESAT-6 у впервые инфицированных детей с размером папулы туберкулиновой пробы 10-16 мм значимо выше, чем у детей с величиной кожной пробы 6-9 мм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шилова М.В. Туберкулез в России в 2007 г. М.: ООО «ПАГРИ Принт», 2008: 45-46.
2. Овсянкина Е.С., Губкина М.Ф. Проба Манту, ПЦР и ИФА в диагностике туберкулеза у детей и подростков. Биопрепараты. 2004; 1: 8-10.
3. Mazurek, GH, LoBue PA, Daley CL et al. Detection of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay. Clin. Infect. Dis. 2003; 36 (9): 1207-1208.
4. Mazurek, GH, Villarino ME. Guidelines for Using the QuantiFERON-TB Test for Diagnosing Latent Mycobacterium Tuberculosis Infection. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm. Rep. 2005; 54: 49-55.
5. Mori T, Sakatani M, Yamagishi F et al. Specific detection of tuberculosis infection; an interferon-"/ based assay using new antigens. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004; 170 (1): 59-64.
6. Eum SY, Lee VJ, Kwak HK et al. Evaluation of the diagnostic utility of a whole-blood interferon-gamma assay for determining the risk of exposure to Mycobacterium tuberculosis in
Bacille Calmette-Guerin (BCG)-vaccinated individuals. Tuberculosis. 2008; 88 (1): 31-38.
7. Winje BA, Oftung F, Korsvold GE et al. School based screening for tuberculosis infection in Norway: comparison of positive tuberculin skin test with interferon-gamma release assay. BMC Infect. Dis. 2008; 8: 140-154.
8. Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann. Intern. Med. 2008; 149 (3): 177-184.
9. Molicotti P, Bua A, Mela G et al. Performance of QuantiFERON-TB testing in a tuberculosis outbreak at a primary school. J. Pediatr. 2008; 152 (4): 585-586.
10. Neira-Munoz E, Smith J, Cockcroft P et al. Extensive transmission of Mycobacterium tuberculosis among children on a school bus. Pediatr. Infect. Dis. J. 2008; 27 (9): 835-837.
11. Connel T, Bar-Zeev N, Curtis N. Early detection of perinatal tuberculosis using a whole blood interferon-gamma release assay. Clin. Infect. Dis. 2006; 42: 82-85.
