CC BY
130
Инфекционные болезни, иммунология
и иммунотерапия
УДК 616 - 002.5 - 053.2 - 07 Л.И. Мордовская1, М.А. Владимирский3, В.А. Аксенова3, Ф.А. Захарова2
СОВРЕМЕННЫЙ ПОДХОД К ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
Научно-практический центр «Фтизиатрия» МЗ РС (Я)1; Медицинский институт Якутского государственного университета им. М.К. Аммосова, 677000, ул. Белинского, 582; НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова3, г. Москва
Интерферон-гамма (ИФН-у) — один из ключевых факторов протективного иммунитета при туберкулезной инфекции. Существуют ряд новых иммунологических тестов для определения туберкулезной инфекции, в том числе у детей, основанных на анализе индукции ИФН-у в образцах цельной крови, инкубированных в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза (МБТ) [2-5, 8]. В такого рода тест-системах измеряют продукцию ИФН-у с помощью количественного иммуноферментно-го анализа («QuantiFERON-TB-Gold») [2] или определяют количество ИФН-у продуцирующих Т-лимфоцитов (T-SPOT.TB) [3]. В качестве специфических антигенов МБТ-индукторов ИФН-у в последние годы используют рекомбинантные антигены ESAT-6 (ранний секретиру-емый антиген с молекулярной массой 6 кд) и CFP-10 (белок фильтрата культуры МБТ). Эти тест-системы используют главным образом для определения латентной туберкулезной инфекции [6, 7, 9]. Поскольку антигены отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма M.bovis(BCG) и большинства нетуберкулезных видов микобактерий [1], такие тест-системы могут использоваться, в том числе, и для обследования лиц, вакцинированных BCG.
Мы разработали отечественную тест-систему для определения туберкулезного инфицирования у детей и подростков на основе индукции ИФН-у в образцах цельной крови in vitro. В отличие от тест-системы «QuantiFERON-TB-Gold» для индукции ИФН-у, мы используем как традиционный туберкулин PPD, так и комплекс специфических антигенов ESAT-6 и СFР-10.
Эта тест-система позволяет дифференцировать первичную туберкулезную инфекцию у детей и подростков и поствакцинную БЦЖ аллергию, следить за уровнем специфического иммунного ответа у больных подростков с различными формами туберкулеза легких.
Материалы и методы
Обследованы 277 детей и подростков в возрасте от 1 г. до 14 лет, проходивших обследование и лечение в Детском противотуберкулезном диспансере г. Якутска, клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова и Детской поликлинике УД президента РФ с установленными диагнозами: конверсия («вираж») туберкулиновой пробы (52 пациента); поствакцинальная аллергия (40 пациентов); туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (25 пациентов). Обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной пробой Манту, 46 ранее инфицированных детей, находившихся под наблюдением у фтизиопедиатра на основании конверсии туберкулиновой пробы, 10 ранее инфицированных детей, находившихся на стационарном лечении по поводу пневмонии, и 73 ребенка и подростка, проходивших стационарное лечение по поводу различных форм туберкулеза легких.
Для исследования были (с согласия родителей) взяты образцы венозной крови по 3,5 мл с гепарином (10 ед./мл). Образцы крови были разлиты по 1 мл в три различные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и две опытные пробы, в которые вносили по 10 мкл туберкулина PPD в концентрации по белку 1 мг/мл и смесь
(равные объемы) рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10 в концентрациях по белку 1 мг/мл. Конечная концентрация всех антигенов по белку составляла 10 мкг в мл крови. Образцы крови в стерильных пробирках объемом 5 мл с герметично закрывающимися крышками инкубировали при 37°С в течение 20-24 ч. На следующий день отбирали по 200 мкл образцов плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-у с помощью разработанной нами иммуноферментной тест-системы. Результаты анализа обрабатывали, используя специальную компьютерную программу Zemfira фирмы «БиоРад» для обсчета количественного ИФА. В некоторых опытах образцы плазмы замораживали и хранили при 20°С в течение 2 нед.
Для статистической обработки полученных результатов применяли программы Microsoft Excel и SAS с использованием параметрических и непараметрических методов анализа. Определяли среднее значение, стандартное отклонение, медиану и межквартильный (25-75%) диапазон результатов. Достоверность различий в изучаемых группах анализировали по критерию Вилкоксона.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования индукции ИФН-у в образцах крови антигенами МБТ в изученных группах пациентов представлены в таблице. В результате анализа индукции ИФН-у в образцах цельной крови 123 пациентов с первичной туберкулезной инфекцией (группы 3, 4 и 6) установлено, что чувствительность определения первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков при пороговом значении концентрации ИФН-у (более 70 пг/мл) составила 97,6%.
Индукция ИФН-у у детей и подростков в образцах крови при различных формах туберкулезной инфекции
Резюме
Разработана тест-система определения туберкулезного инфицирования, проводимого путем количественного анализа интерферона-гамма (ИФН-у) в образцах плазмы крови в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза: туберкулина PPD и смеси специфических для М. tuberculosis рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10. Диагностическая чувствительность определения первичной туберкулезной инфекции составляет 97,6% при 94,4% специфичности, позволяющей дифференцировать туберкулезную инфекцию от поствакцинной аллергии. При распространенных формах туберкулеза легких уровень антиген-индуцированного ИФН-у снижается.
Ключевые слова: туберкулезная инфекция, поствакцинная аллергия, интерферон-гамма, туберкулин PPD, специфические антигены, ESAT-6 и CFP-10.
L.I Mordovskaya, M.A. Vladimirsky, V.A. Aksenova, F.A. Zacharova
CURRENT APPROACH TO IMMUNOLOGICAL
DIAGNOSTICS OF TUBERCULOSIS INFECTION IN CHILDREN AND TEENAGERS
The science-practical centre «Phthisiology» MHC RS (Y);
Medical institute of the Yakut state university, Yakutsk;
Scientific research institute of phthisiopulmonology of the Moscow medical academy after I.M. Setchenov, Moscow
Summary
The test-system diagnosing tuberculosis infection performed by the quantitative analysis of interferon-gamma (IFN-y) in samples of blood plasma at presence of tuberculosis mycobacterium antigens: tuberculin PPD and mixes specific for M. tuberculosis recombinant antigens ESAT-6 and CFP-10 is developed. Diagnostic sensitivity of primary tuberculosis infection diagnostics makes up 97,6% with 94,4% specificity, allowing differentiating tuberculosis infection from post vaccine allergy. In widespread forms of pulmonary tuberculosis the level of the antigen induced IFN-y can be low.
Key words: tuberculosis infection, post vaccine allergy, in-terferon-gamma, tuberculin PPD, specific for M. tuberculosis recombinant antigens ESAT-6 and CFP-10.
Специфичность исследования при таком пороговом значении индукции ИФН-у, которую определяли при анализе пациентов с отрицательной (сомнительной) пробой Манту и детей с поствакцинальной БЦЖ-аллергией, составила 94,4%.
Мы провели сопоставление уровня иммунного ответа на антигены PPD и смесь специфических антигенов ESAT-6 и CFP-10 в двух группах пациентов: больных пневмонией, ранее инфицированных, по данным конверсии туберкулиновой пробы, и у здоровых, ранее тубин-фицированных. Несмотря на определенное увеличение уровня индукции ИФН-у больных пневмонией, значимых различий между этими группами выявлено не было.
В процессе исследования подростков, больных туберкулезом легких (вторичная туберкулезная инфекция), было установлено, что, в среднем, уровень индукции ИФН-у в присутствии антигенов МБТ — туберкулина
Группа Диагноз Концентрация ИФН-у, пг/мл - медиана, 25-75% межквартильные величины
ppd Р, критерий Вилкоксона esat-6 +cfp-10 Р, критерий Вил-коксона
1 Туберкулин-отрицательные здоровые (п=31) 85 (48-181) p1-2<0,001 0 (0-0) P1-2 -н.д.
2 Поствакцинная БЦЖ-аллергия (п=40) 282 (208-440) Р2-3<0,001 0 (0-0) Р2-3 <0,001
3 Впервые инфицированные - «вираж» пробы Манту (п=52) 552 (338-862) Р3-6<0,001 351 (152-537) Р 3 - 4,5,6 - н.д.
4 Ранее инфицированные (п=46) 552 (294-720) Р3-4 - н.д. 336 (182-552) Р3-4 - н.д.
5 Пневмония -инфицированные (п=10) 820 (520-240) Р4.5 = 0,052 524 (280-580) Р4-5 - н.д.
6 Туберкулез внутригруд-ных лимфоузлов (п=25) 624 (323-1033) Р3-6 - н.д. 377 (156-791) Р3-6 - н.д.
7 Туберкулез легких (п=73) 213 (91-374) Р7 - 3,4Д6<0,01 47 (19-161) Р 7 - 3,4,5,6 <0,01
Примечание. Обозначение н.д. — недостоверно.
PPD и специфических антигенов ESAT-6 и CFP-10 — у этих пациентов существенно ниже, чем у лиц с первичной туберкулезной инфекцией. У значительной части пациентов с вторичной туберкулезной инфекцией и наличием деструкции легочной ткани и бактериовыделением уровень индукции ИФН-у в присутствии антигенов МБТ был угнетен настолько сильно, что в ряде случаев оказывался нулевым. В дальнейшем было установлено, что в процессе лечения, при благоприятном течении процесса, специфическая индукция ИФН-у восстанавливается. Эти данные послужили предметом отдельного исследования.
Разработанная нами тест-система существенно отличается от зарубежного аналога («QuantiFERON-TB-Gold» In Tube) тем, что для индукции ИФН-у in vitro в нашей системе используется как относительно неспецифический туберкулин PPD, так и смесь специфических реком-бинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10. Это позволяет при индукции ИФН-у исключительно в ответ на туберкулин PPD подтвердить наличие поствакцинальной аллергии и отвергнуть туберкулезное инфицирование при одновременном отсутствии диагностического порогового уровня индукции (70 пг/мл) ИФН-у рекомбинантными антигенами.
В связи с довольно высокой распространенностью туберкулезной инфекции среди взрослого населения в нашей стране этот метод наиболее актуален для своевременного выявления первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, поскольку проводимая ревакцинация БЦЖ в 6- и 14-летних возрастных группах не позволяет достоверно определить туберкулезное инфицирование с помощью стандартной пробы Манту. Важность этого аспекта применения таких тест-систем показана рядом работ [3, 4, 8], использующих зарубежные аналоги. При сравнении метода, основанного на антиген-специфической индукции ИФН-у и кожного туберкулинового теста, по разным данным, лишь в 9-30% случаев у детей и подростков с положительной кожной пробой наблюдали совпадение с результатами теста на основе набора «QuantiFERON-TB-Gold». Именно эти дети и подростки, по данным эпидемиологического обследования, имели большую вероятность контактов с больными туберкулезом.
Возможность контроля иммунного ответа на основании специфической индукции ИФН-у у больных туберкулезом в процессе их специфической химиотерапии имеет существенное значение при использовании некоторых иммуномодулирующих препаратов.
Заключение
Разработана тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции in vitro ИФН-у в образцах цельной крови антигенами микобактерий туберкулеза (PPD и специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10). Данная система позволяет установить первичную туберкулезную инфекцию с чувствительностью 97,6% при специфичности 94,4%. Эти характеристики обеспечивают возможность дифференцирования первичной туберкулезной инфекции от поствакцинальной аллергии. Поствакцинальная аллергия характеризуется сочетанием повышенной индукции ИФН-у к туберкулину и индукцией ИФН-у ниже порогового уровня к спе-
цифическим антигенам. При туберкулезе легких уровень иммунного ответа, определяемый по специфической индукции ИФН-у, в среднем существенно снижается, в том числе до нулевых значений, в зависимости от выраженности туберкулезного поражения.
Литература
1. Arend S.M., van Meijgaarden К.Е., de Boer K. et al. Tuberculin skin testing and in vitro T-cell responses to Esat-6 and culture filtrate protein 10 after infection with Mycobacterium marinum or Mycobacterium kansasii // J.Inf. Dis. - 2002. - Vol. 186. - P. 1797-1807.
2. Brock I., Munk M.E., Kok-Jensen A. et al. Performance of whole blood IFN-gamma test for tuberculosis diagnosis based on PPD or specific antigens ESAT-6 and CFP-10 // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - 2001. - Vol. 5. - P. 462-467.
3. Dominguez Jose, Juan Ruiz-Manzano, Malu De Souza-Galvao et al. Comparison of Two Commercially Available Gamma Interferon Blood Tests for Immunodiagnosis of Tuberculosis // Clin Vaccine Immunol. - 2008. - Vol. 15(1).
- P. 168-171.
4. Eum S.Y., Lee V.J., Kwak H.K., Min J.H. et al. Evaluation of the diagnostic utility of a whole-blood interferon-gamma assay for determining the risk of exposure to Mycobacterium tuberculosis in Bacille Calmette-Guerin (BCG)-vaccinated individuals // Tuberculosis. - 2008. - Vol. 88(1). - P. 31-38.
5. Lalvani A., Millington K.A. Т cell-based diagnosis of childhood tuberculosis infection // Curr Opin Infect Dis. -2007. - Vol. 20(3). - P. 264-271.
6. Manuel O., Kumar D. QuantiFERON-TB-GOLD assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection // Thorax.
- 2008. - Vol. 63(1). - P. 67-71.
7. Mazurek G.H., LoBue P.A., Daley C.L. et al. Detection of Mycobacterium Tuberculosis Infection by Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay // Clin. Infect.Dis. - 2003.
- Vol. 36(9). - P. 1207-1208.
8. Mori Т., Sakatani, M., Yamagishi F. et al. Specific detection of tuberculosis infection; an interferon-y based assay using new antigens // Am J Respir Crit Care Med. -2004. - Vol. 170(1). - P. 59-64.
9. Pai M., Zwerling A., Menzies D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis // Ann. Intern.Med. - 2008. - Vol. 149(3). - P. 177-184.
Координаты для связи с авторами : Мордовская Лариса Ивановна — канд. мед. наук, с.н.с. ГУ НПЦ «Фтизиатрия» МЗ PC (Я), г. Якутск; e-mail: limordovskaya @mail. ru; Владимирский Михаил Александрович — доктор мед. наук, проф., руководитель лаборатории молекулярной диагностики НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, г. Москва, тел.:/факс. 631-33-14; 8-917-5416238, e-mail: mvladimirskij@mail.ru; Аксенова Валентина Александровна — доктор мед. наук, проф., гл. внештатный фтизиопедиатр РФ, руководитель лаборатории по профилактике, диагностике, лечению туберкулеза у детей и подростков НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, г. Москва; Захарова Федора Апполоновна
- доктор мед. наук, профессор кафедры патологической физиологии ГОУ ВПО «Якутский государственный университет им. М.К. Аммосова», г. Якутск, e-mail: patfiz63@ mail.ru.
□□□
